Summary
Amostras de proteínas visualização por microscopia eletrônica negativa mancha (EM) tornou-se um método de análise estrutural populares. É útil para a análise estrutural quantitativa, como cálculo de uma reconstrução 3D das moléculas em estudo, e também para a análise qualitativa da qualidade de preparações de proteína. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para preparar as grades EM, a coloração da amostra e visualizar a amostra em um microscópio eletrônico. Usuários novatos podem seguir estes protocolos facilmente e utilizar negativa mancha EM como um ensaio de rotina, além de outros ensaios bioquímicos, para avaliar as suas amostras de proteína.
Abstract
Microscopia eletrônica única partícula (EM), de ambos os manchado negativo ou congelados hidratado amostras biológicas, tornou-se uma ferramenta versátil em biologia estrutural 1. Nos últimos anos, este método tem alcançado grande sucesso no estudo de estruturas de proteínas e complexos macromoleculares 2, 3. Em comparação com elétrons criomicroscopia (cryoEM), no qual amostras de proteínas congeladas hidratadas são incorporados em uma fina camada de gelo vítreo 4, coloração negativa é um método mais simples de preparação da amostra em que as amostras de proteínas são incorporados em uma fina camada de sal de metal pesado para aumentar secas contraste da amostra em 5. O contraste aprimorado de mancha negativa EM permite o exame de relativamente pequeno de amostras biológicas. Além de determinar a estrutura tridimensional (3D) de proteínas purificadas ou complexos de proteínas 6, este método pode ser usado para fins muito mais amplo. Por exemplo, a mancha negativa EM pode ser facilmente usado para visualizar purificadaamostras de proteínas, a obtenção de informações, tais como homogeneidade / heterogeneidade da amostra, a formação de complexos de proteínas ou grandes montagens, ou simplesmente para avaliar a qualidade de uma preparação de proteína.
Neste artigo de vídeo, apresentamos um protocolo completo para a utilização de uma amostra de EM para observar proteínas negativamente coradas, desde a preparação grades de carbono revestido para negativa mancha EM para aquisição de imagens de amostra negativamente coradas em um microscópio eletrônico operado a tensão de aceleração 120kV. Estes protocolos têm sido utilizados rotineiramente em nosso laboratório e pode ser facilmente seguido por usuários novatos.
Protocol
1. Preparação de EM grades para revestimento de carbono
- Encha um copo de vidro grande com água destilada.
- Use uma pipeta de vidro para deixar cair uma única gota de colódio (~ 20μl, 2% em acetato de amila, Ciências Microscopia Eletrônica, PA, EUA) na superfície da água. Colódio vai se espalhar para formar uma camada de plástico fino para a água da superfície / ar; Nota: A primeira gota de colódio pode ser usado para limpar a superfície da água a partir de qualquer partículas de poeira. Após a remoção do filme da primeira queda, a superfície da água está livre de poeira.
- Coloque EM grades, 400 ou 200 mesh grades Gilder Cu comprado de Ted Pella Inc. (EUA), um por um para a camada de plástico flutuando na superfície da água; Nós colocamos geralmente 50 ~ 100 grids em um padrão próximo de embalagem, com a brilhante lado da grade voltada para baixo na camada de plástico (Fig. 1A). Nota: 400 redes mesh são bons para a rotina negativa grades mancha EM, e que 200 redes mesh são bons para a recolha de imagens par de inclinação.
- Cortar uma tortace de papel com dimensões ligeiramente maiores do que a área onde as redes são colocadas sobre a camada de plástico. Coloque o papel com cuidado por cima da grade (Figura 1B), e esperar até o papel ficar completamente molhada (Fig. 1C). Nota: Diferentes tipos de papel têm diferentes taxas de absorção de água. É importante que o papel não absorve água muito rápido. Por exemplo, papel de filtro regular não é boa para este fim, pois absorve água muito rápido e faz um monte de rugas. O filme de carbono feitas de papel amassado não é plana, e, portanto, não é bom para a recolha de imagens par inclinação para a reconstrução 3D cônica inclinação aleatória. Um deles tem para testar papéis diferentes para encontrar um adequado. Em nosso laboratório, temos vindo a utilizar papéis de blocos comprados a partir da mercearia local. Às vezes o papel de jornal também foi considerada adequada. Outra opção é usar o papel de arroz em relação espesso usado para caligrafia chinesa / japonesa.
- Rapidamente fazer incisões no filme plástico em volta e perto deo papel encharcado. Logo em seguida, use uma pinça para pegar o papel com as grades imprensado entre o filme plástico e papel. Coloque o papel numa placa de Petri com as grades para cima para a secagem do ar (Figura 1D); Nota: É importante deixar o papel secar ao ar. Secagem muito rápido gera muitas rugas no papel.
2. Revestimento de grades de carbono
- A máquina de revestimento de carbono-usado em nosso laboratório é um Cressington 208C Alto Vácuo Turbo Carbono Coater (Ted Pella). Nosso sistema é equipado com um monitor de espessura do filme Cressington, que mede a espessura da película de carbono revestido com base no princípio de que a freqüência de oscilação de um cristal de quartzo é alterada pela massa de um filme depositado em sua superfície. No entanto, o protocolo descrito aqui não requer um monitor de espessura, uma vez que muitas vezes não é disponível em cada laboratório.
- Afiar uma vara de carbono usando um apontador (Ted Pella) e varas de carbono de carga em carbono revestimento machine (Fig. 2A). Dois bastões, um deles com uma ponta afiada ea outra com uma extremidade plana são colocados uns contra os outros.
- Aplicação de graxa para vácuo em metade da área fosco de uma lâmina de vidro e coloque-o ao lado das grades (Fig. 2B). Apenas metade da área fosco da lâmina de vidro deve ser coberta com graxa de vácuo. Nota: A área com graxa de vácuo não vai mudar de cor após o revestimento de carbono. O contraste entre as áreas adjacentes, com e sem graxa de vácuo fornece uma estimativa da espessura de carbono revestido.
- Coloque o papel com grids no palco da máquina de revestimento de carbono. Coloque a lâmina de vidro ao lado das grades (Fig. 2C). Nota: Pode-se também grades primeira transferência revestido com o filme plástico para uma lâmina de vidro antes do revestimento, no caso de muitas grades cair do papel.
- Bomba na câmara de vácuo, e espere até que o vácuo atinge um nível de 10 Torr -5. Nota: revestimento com menor vácuo muitas vezes gera muitas faíscas, resultando em muitas partículas de carbono em grandeda grade.
- Aumentar a corrente de forma muito lenta. A ponta afiada da vara de carbono irá tornar-se primeiro vermelha e branca, em seguida, com o aumento da corrente. Não vê a ponta de alto brilho diretamente com o olho nu. Parar o aumento da corrente quando o revestimento é iniciado. A lâmina de vidro muda de cor do branco ao cinza claro e cinza escuro, em seguida. A escuridão da slides correlaciona a espessura do filme de carbono sendo revestido. Desligue o atual para parar de revestimento quando a espessura desejada foi alcançada (Fig. 2D). Nota: 1) Depois de repetidos processos de carbono, revestimento de carbono revestido de dentro da redoma de vidro pode escurecer a sua cor. Isso torna o filme de carbono revestido aparecem mais grossos do que realmente é. 2) Uma haste de carbono afiada pode ser usado para o revestimento de várias. A nitidez da ponta é gradualmente reduzida após cada revestimento. A corrente máxima é influenciada pela nitidez da vara de carbono. A vara recém-afiada com diâmetro menor requer um parente menoratual para evaporar carbono. Mais tarde revestimento pode exigir um pouco maior corrente.
- Ventilação da câmara de vácuo e remover grades revestido para uso posterior.
Nota 1. O método mais preciso de controlar a espessura de carbono é usando um monitor de espessura do filme. Ou pode-se qualitativamente calibrar cor contra a espessura exacta medida pelo monitor. A espessura de carbono útil para esta técnica é entre 3 e 7 nm.
Este é um método simples e fácil de preparar uma grande quantidade de grades de carbono revestidos, geralmente ~ 100 grades por preparação. As grades contém uma camada de plástico fino, o que geralmente não afeta a qualidade da imagem negativa manchado. No entanto, as redes preparadas neste método não são adequados para cryoEM. Esta camada de plástico pode ser removida por imersão as grades em clorofórmio por várias horas.
3. Preparação de solução de formiato de uranila (0,75%) para o negativo mancha EM. O protocolo detalhado foidescrito anteriormente 5
- Pesar 37,5 mg de formato de uranila em um copo pequeno;
- Adicionar 5 ml de água fervente e mexa por 5 minutos no escuro;
- Adicionar 10μl NaOH 5M, continue mexendo por 5 minutos;
- Filtrar a solução usando uma seringa filtro (Fisherbrand, 13 milímetros filtro de seringa, 0,2 Hm, Nylon não-estéril número de catálogo, 09-720-5), e armazenar a solução filtrada em um tubo Falcon 8ml coberto com papel alumínio;
Nota pó Formate. Uranilo pode ser comprado de Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), número de catálogo 22451. Solução de formiato de uranilo é sensível à luz e deve ser mantido longe da luz direta, por exemplo, que cobre o tubo de Falcon com papel alumínio. A solução recentemente preparada tem uma cor amarelo claro (Fig. 3A). Solução mancha pode ser mantido no banco de uma a duas semanas antes de começar a precipitar. Formiato de uranilo é ácida com um pH ~ 4. Adição de NaOH aumenta o pH, mas adicioná-lo muito rapidamenteou em excesso pode causar a mancha de precipitado. Além de gerar contraste, formate uranilo também corrige a amostra de proteína. Porque a taxa de fixação é tão rápido, o pH baixo geralmente não afeta as conformações da proteína total ou formação de complexos de proteínas 7.
4. Protocolo para a elaboração da grade negativa EM mancha. Este protocolo foi descrita em detalhes anteriormente 5
- De descarga luminescente grade de carbono revestido, utilizando PELCO GlowDischarge easiGlow sistema (Ted Pella Inc., EUA). A corrente utilizada é de 15 mA e grades são brilho descarregada por 30 sec Nota.. Glow-descarregada grades deve ser usado logo após o fulgor de descarga. Muitas vezes usamos as grades em menos de duas horas após a descarga luminescente.
- Coloque duas gotas 20μl de água destilada e duas gotas de solução de formiato 25μl de uranilo em um pedaço de parafilme (Fig. 3B).
- Segure um brilho totalmente descarregada grade usando reverse força anti-capilar fórceps com o carrobon revestido virado para cima. Nota: É necessário o uso de anti-capilar fórceps. Caso contrário, amostra de líquido será bombeado para fora de grades pela força capilar entre a fórceps.
- Aplicar amostra de proteína 2μl ao brilho descarregada grid, e aguarde 30 segundos. Nota: O tempo de espera eo tempo de descarga luminescente influência da concentração de proteínas adsorvidas na grade. Amostras muito diluídas requer maior tempo de adsorção. No entanto, adsorção prolongada pode alterar a concentração do tampão desde vapores de água. Para conseguir uma distribuição adequada de partículas em grade requer um pouco de tentativa e erro abordagem.
- Blot fora da amostra, utilizando papel de filtro.
- Toque na superfície da grade para uma gota de água e depois blot fora da água com papel de filtro. Repita com a queda de 2 de água.
- Toque a superfície da grelha para a primeira gota de uma breve mancha. Blot off a solução mancha com papel de filtro.
- Toque a superfície da grelha para a segunda gota de corante durante 20 segundos. Blot off solução mancha com papel de filtro.
- Secar a grade usando vácuo. Nota: também se pode deixar as redes no banco ou em um capuz químico secar ao ar. O benefício de vácuo seco é que pode-se observar as grades na EM imediatamente. O artefato possíveis gerados por secagem rápida é desigual mancha.
5. Microscopia eletrônica de transmissão
- O microscópio utilizado nesta demonstração é um T12 Tecnai (FEI Company) equipado com um x 4K 4K Gatan câmera CCD.
- Brevemente verificar o alinhamento do microscópio antes de inserir amostra; Nota: Isto só é necessário uma vez por EM sessão. Em um microscópio modelo, perto de um perfeito alinhamento pode ser salvo anteriormente. Carregando um arquivo-alinhamento deve restaurar o alinhamento microscópio para uma condição quase perfeita.
- Carregar a grade de EM em porta espécime único de inclinação padrão.
- Inserir titular em CompuStage do T12. Aguarde até que o ciclo de bombeamento para ser concluído.
- Insira o suporte na coluna. </ Li>
- Foco amostra e definir um defocus desejado, geralmente, 1.5um. Nota: A focalização pode ser conseguida por manualmente foco usando o método de contraste mínima ou usando câmera CCD para capturar imagens ao vivo e computar espectro de potência ao vivo Fourier.
- Gravar uma imagem utilizando CCD da câmera;
- Em imagens de forma negativa amostras coradas proteínas, as proteínas são muitas vezes vistos com contraste branco, ou seja, densidade branco contra um fundo mais escuro. Observe que, enquanto as concentrações de proteínas em diferentes áreas da mesma grade são geralmente bastante semelhantes, se faz observar diferentes níveis de mancha em diferentes áreas da grade mesmo. Às vezes, as áreas podem ter coloração irregular ou mesmo coloração positiva (proteína aparece escura sobre um fundo claro), enquanto que outras áreas têm perfeita mancha. Muitas vezes, é necessário procurar a grade para localizar uma área boa para a imagem latente.
6. Resultados representante
Exemplos típicos de boas imagens de forma negativa staamostras INED, cavalo baço ferritina (Figura 4A), Fab (Fig. 4B), 20S archaeal proteassoma (Fig. 4C) e nucleossomos (Fig. 4D), são mostrados.
Figura 1. Elaboração de grelhas de carbono revestido para negativa mancha EM. A) Colocar EM grades um por um em um padrão de embalagem fechada na superfície do filme colódio. B) Colocar um pedaço de papel um pouco maior do que a área das grades. C) Esperar até que o papel fica completamente molhado. D) Pegue o papel em conjunto com as grades para secagem ao ar.
Figura 2. . Grades revestimento de carbono com EM A) Instalação do evaporador de carbono: coloque as duas varas de carbono no aparelho de revestimento, com uma haste (à esquerda) com uma ponta afiada ponto. A haste de outros (à direita) tem uma superfície plana e entrar em contato com a ponta do ponto um no s opostoide. B) Coloque uma pequena quantidade de graxa de vácuo em um lado de uma lâmina de vidro promovida. A área dentro do quadro negro tem graxa de vácuo. C) Setup as grades para revestimento. As lâminas de vidro são usados para segurar o papel na posição. A seta aponta a área com graxa de vácuo. D) Após o revestimento, a cor do slide com graxa de vácuo cobertos não muda a cor. O contraste indica a espessura de carbono revestido.
Figura 3. Ilustrando o procedimento de coloração negativa. A) recentemente preparada (à esquerda) solução de formiato de uranilo é transparente sem sinal de precipitados. Depois de 1 ~ 2 semanas, precipita começar a acumular no fundo no fundo do tubo. B) Coloque duas gotas (~ 25μl) de água destilada e duas gotas de solução de uranilo formate em um pedaço de parafilme. Use um par de anti-capilar pinça para segurar um brilho descarregada carbono revestido com grade EM lado de carbonopara cima. Uma gota de amostra (~ 2μl) é colocado no grid. C) Após uma espera de 30 segundos, blot a solução com um filtro de papel. D) Virar a grade para tocar o lado amostra da grade com a primeira gota de água. Repita o passo C e D para completar o processo de coloração.
Figura 4. Exemplos de imagens de amostras EM proteínas negativamente manchado. A) ferritina baço cavalo, B) fragmento de ligação do antígeno (Fab), C) 20S archaeal proteassoma e D) nucleossomo. Todas as imagens foram gravadas com a mesma ampliação. A barra de escala é de 20nm.
Discussion
Negativa mancha EM é uma ferramenta poderosa que pode ser usado para estudar estruturas 3D de amostras de proteínas purificadas, como o uso de inclinação cônica aleatória 8 método, que requer a coleta de um par de imagens com uma de uma amostra inclinado a 60 ° e um da mesma área mas untilted, para calcular reconstruções 3D dos complexos macromoleculares. Além disso, coloração negativa EM pode ter muitas outras aplicações, como rastreamento de duas dimensões (2D) de cristais de proteínas da membrana 9, visualizando complexos de proteína em conformações diferentes 10, ou simplesmente para a visualização de homogeneidade e / ou heterogeneidade de proteínas purificadas amostra assim fornecendo feedbacks para melhorar os procedimentos de purificação de proteínas, etc Pode ser um ensaio poderoso para bioquímicos. Neste artigo, apresentamos os protocolos que vão desde preparar as grades de carbono revestidos para recolher imagens de amostras de proteínas negativamente coradas em um microscópio eletrônico. Como ilustrado aqui,o procedimento é bastante simples e fáceis de seguir. Se a tentativa de calcular as reconstruções 3D da amostra que está sendo observado pelo método aleatório inclinação cônica, é necessário adquirir imagens par de inclinação. No entanto, se a realização de análises única partícula é o propósito, várias imagens untilted será suficiente. Em ambos os casos, processamento de imagem adicional é necessária e isso está além do escopo deste artigo vídeo.
Como acontece com qualquer método, existem variações para os protocolos. Formate uranila funciona muito bem como um reagente negativo mancha na maioria dos casos. Acetato de uranila é outro comumente usado reagente negativo mancha. Ele funciona muito semelhante ao formato de uranila, mas com um tamanho maior de grãos e, em muitos casos, menor contraste do que formate uranila. A vantagem de usar acetato de uranila é que a solução dura mais de formiato de uranila. Não é preciso para preparar uma nova solução a cada uma ou duas semanas. Ambos formiato e acetato de uranila são ácidas. Uma preocupação óbvia é que opH baixo pode induzir alterações na amostra de proteína em estudo. Ambas as soluções mancha também funcionam como fixadores de proteínas. Um estudo anterior mostrou que ambas as amostras de proteínas corrigir rapidamente 7. Essa fixação rápida faz com que o pH baixo menos importante. Durante o processo de coloração, uma amostra de proteína torna-se fixado antes do pH baixo pode induzir qualquer alteração. No entanto, outras negativas reagentes mancha, como molibdato de amônio e ácido fosfotúngstico, pode produzir melhores resultados para a coloração de amostras quando o pH baixo é uma preocupação 7. Ambos molibdato de amônio e ácido fosfotúngstico têm um pH praticamente neutro, mas o contraste das amostras de proteína gerada por essas manchas é geralmente inferior a formiato de uranila.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Electron trabalho de microscopia de Cheng laboratório é parcialmente apoio por concessões do NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 e P50GM082250 (para A. Frankel)), e uma bolsa da UCSF Programa de Pesquisa Biomédica Breakthrough, Award e Prêmio Oportunidade Novas Tecnologias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
