Summary
Protein örneklerinin negatif leke elektron mikroskobu (EM) tarafından görselleştirme popüler bir yapısal analiz yöntemi haline gelmiştir. Ayrıca protein preparatları kalitesi kalitatif olarak incelenmesi için çalışılan moleküllerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon hesaplanırken gibi, nicel yapısal analizi için yararlı olur ve. Biz bu makalede, EM ızgaraları hazırlanması, numune boyama ve örnek bir elektron mikroskobu görselleştirmek için ayrıntılı protokoller mevcut. Acemi kullanıcılar, kolayca bu protokolleri uygulayın ve protein örneklerinin değerlendirilmesi için olumsuz, diğer biyokimyasal testlerin yanı sıra, rutin bir tahlil olarak EM leke yararlanmak için.
Abstract
Tek parçacık hem de negatif boyanmış veya dondurulmuş sulu biyolojik örnekler elektron mikroskobu (EM), yapısal biyoloji 1 çok yönlü bir araç haline gelmiştir. Son yıllarda bu yöntem, proteinler ve makromoleküler kompleksleri 2, 3 yapıları inceleyerek büyük bir başarı elde etti. Dondurulmuş sulu protein örneklerinin vitreus buz 4 ince bir tabaka içine gömülü olduğu elektron cryomicroscopy (cryoEM) ile karşılaştırıldığında, negatif boyama, protein örneklerinin artırmak için ince bir tabaka kuru ağır metal tuzu gömülü olduğu basit bir örnek hazırlama yöntemi örnek kontrast 5. Negatif leke gelişmiş kontrast EM nispeten küçük biyolojik örneklerin incelenmesi sağlar. Saflaştırılmış protein ya da protein kompleksleri 6 üç boyutlu (3D) yapısını belirlemenin yanı sıra, bu yöntem çok daha geniş amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, negatif EM saflaştırılmış görselleştirmek için kolaylıkla kullanılabilir lekeprotein örneklerinin, bilgi edinme, örnek homojenlik / heterojenliği, protein kompleksleri veya büyük meclislerinin oluşumu, ya da sadece bir protein hazırlık kalitesini değerlendirmek için gibi.
Bu video makalede, 120kV hızlandırma gerilimi işletilen bir elektron mikroskobu, olumsuz lekeli örnek görüntüleri alan EM leke negatif karbon kaplı ızgaraları hazırlanırken, olumsuz lekeli protein örneği gözlemlemek için bir EM kullanımı için eksiksiz bir protokol mevcut. Bu protokoller, laboratuvarda rutin olarak kullanılan ve acemi kullanıcılar tarafından kolayca takip edilebilir.
Protocol
1. EM ızgaraları karbon kaplama için hazırlanması
- Büyük bir cam beher distile su ile doldurun.
- Kolloidon (~ 20μl, amil asetat% 2, Elektron Mikroskopi Bilimler, PA, USA) tek bir damla su yüzeyinde açılan bir cam pipet kullanın. Kolloidon su / hava yüzeyi ince bir plastik tabaka oluşturacak şekilde yayılır; Not: kolloidon ilk damla su yüzeyinde herhangi bir toz parçacıkları temizlemek için kullanılıyor olabilir. Filmin ilk damla çıkardıktan sonra, su yüzeyinde toz açıktır.
- EM ızgaraları, su yüzeyinde yüzen plastik tabaka üzerine tek tek Ted Pella Inc (ABD) satın alınan 400 veya 200 örgü Gilder Cu ızgaraları yerleştirin; Biz genellikle 50 ~ 100 ile yakın bir ambalaj desen parlak ızgaraları, plastik katman (Şekil 1A) içine aşağı bakacak şekilde ızgara yan. Not: 400 örgü ızgaralar rutin negatif leke EM ızgaraları iyi 200 mesh ızgaraları ise eğim çifti görüntüleri toplamak için iyi.
- Kes bir pastace, ızgaraları plastik tabaka üzerine yerleştirilen alanında biraz daha büyük boyutlara sahip kağıt. Izgara (Şekil 1B) üstüne kağıt dikkatlice yerleştirin ve kağıt (Şekil 1C) tamamen ıslak hale gelene kadar bekleyin. Not: Farklı kağıt türleri farklı su emme oranlarına sahip. Kağıt çok hızlı su emme olmadığı önemlidir. Örneğin, düzenli filtre kağıdı, su çok hızlı emer ve kırışıklıkların çok yapar, çünkü bu amaç için iyi değildir. Buruşmasını yapılan karbon film, böylece rasgele konik eğim 3D rekonstrüksiyon için eğim çifti görüntüleri toplamak için iyi değildir düz değildir ve. Bir uygun olanı bulmak için farklı kağıtları test etmek için vardır. Laboratuvarımızda, yerel bakkal satın bloknot kağıtları kullanarak var. Bazen gazete kağıdı da uygun bulunmuştur. Başka bir seçenek de Çince / Japonca hat için kullanılan göreli kalın pirinç kağıdı kullanmaktır.
- Hızla etrafındaki plastik film kesiler yapmak ve yakınbatırılmış bir kağıt. Hemen sonra, kağıt, plastik film ve kağıt arasında sıkışmış ızgaraları ile pick up için forseps bir çift kullanın. Hava ile kurutma (Şekil 1D) yukarı bakacak şekilde ızgaraları ile petri kağıt yerleştirin; Not: Bu kağıt hava kuruması için önemlidir. Kuruma çok hızlı kağıt birçok kırışıklıkları oluşturur.
2. Karbon kaplama ızgaraları
- Laboratuvarımızda kullanılan karbon kaplama makinesi Cressington 208C Yüksek Vakum Turbo Karbon Kaplayıcı (Ted Pella). Sistemimiz, bir kuvars kristali salınım frekansı yatırılan filmin yüzeyinde bir kitle tarafından değiştirildi olduğunu ilkesine dayalı kaplı karbon film kalınlığını ölçen bir Cressington film kalınlığı monitör, ile donatılmıştır. Ancak, bu protokol, her laboratuar genellikle mevcut olmadığından, kalınlığı monitör gerektirmez Burada anlatılan.
- Karbon kaplama m bir kalemtıraş (Ted Pella) ve yük karbon çubuklar kullanarak karbon çubuk Keskinleştirachine (Şekil 2A). Düz bir ucu keskin bir ucu ve diğer iki çubuklar, birbirlerine karşı yerleştirilir.
- Buzlu bir cam slayt alanının yarısı vakum sürülmesi ve ızgaralar (Şekil 2B) yanına yerleştirin. Buzlu cam slayt alanının sadece yarısı vakum gres yağı ile kaplı olmalıdır. Not: vakum gres alan karbon kaplama sonra renk değişikliği olmaz. Vakum gres bitişik olan ve olmayan alanlar arasındaki kontrast kaplı karbon kalınlığı bir tahmin sağlar.
- Karbon kaplama makinesi sahnede ızgaraları ile kağıt yerleştirin. Izgaraları (Şekil 2C) yanındaki cam slayt yerleştirin. Not: Bir de kaplama yapmadan önce bir bardak slayt plastik film ile kaplı ilk transferi ızgaraları durumunda birçok ızgaraları kağıt düşebilir.
- Vakum odasında pompası ve vakum 10 -5 Torr bir seviyeye gelene kadar bekleyin. Not: kaplama genellikle düşük vakum ile çok büyük karbon parçacıkları sonuçlanan birçok kıvılcım üretirızgara.
- Çok yavaş arttırın. Karbon çubuğun sivri uçlu ilk akım arttıkça beyaz, kırmızı ve daha sonra olacak. Yüksek parlaklık ucu doğrudan çıplak gözle izlemek etmeyin . Kaplama başladığında akımını artırarak durdurun. Cam slayt, beyaz, gri ve koyu gri ışık rengi değişecektir. Slaytların karanlık kaplı olan karbon film kalınlığı ilişkilidir. Istenilen kalınlıkta (Şekil 2B) elde edildiğinde kaplama durdurmak için geçerli kapatın. Not: 1) tekrarlanan karbon kaplama prosesleri, cam fanus içine kaplı karbon sonra rengini koyulaştırır. Bu kaplamalı karbon filmi aslında daha kalın görünmesine neden olur. 2) Bir bilenmiş karbon çubuk birkaç kaplama için kullanılabilir. Her kaplama sonra yavaş yavaş uç keskinliği azaltılır. Maksimum akım karbon çubuk netlik etkilenir. Küçük çaplı bir taze sivriltilmiş çubuk göre daha düşük gerektirirkarbon buharlaşması için mevcut. Daha sonra kaplama biraz daha yüksek akım gerekebilir.
- Vakum odasında Vent ve daha sonra kullanmak üzere kaplı ızgaraları kaldırmak.
Not 1 karbon kalınlığı kontrol daha doğru bir yöntem, bir film kalınlığı monitör kullanıyorsanız. Veya bir monitör ile ölçülen doğru kalınlığı niteliksel karşı rengi kalibre. Bu teknik için yararlı bir karbon kalınlığı 3 ila 7 nm.
Bu büyük miktarda karbon kaplı ızgaralar hazırlamak için basit ve kolay bir yöntem, genellikle ortalama 100 ızgaraları hazırlık ~. Izgaraları, genellikle olumsuz lekeli görüntünün kalitesini etkilemez ince bir plastik tabaka içerir. Ancak, bu yöntem hazırlanan ızgaraları cryoEM için uygun değildir. Bu tabaka, plastik, birkaç saat için kloroform içine ızgaraları iliklerine silinebilir.
3. Uranil format solüsyonu (% 0.75) negatif hazırlama EM leke. Ayrıntılı bir protokol.daha önce 5 açıklanan
- Uranil format, 37.5 mg lık küçük bir behere tartılır;
- 5 ml kaynar su ekleyin ve 5 dakika boyunca karanlıkta karıştırın;
- 10μl 5M NaOH ekle, 5 dakika karıştırmaya devam edin;
- Bir şırınga filtresi (Fisherbrand, 13mm şırınga filtresi, 0.2μm, Naylon non-steril, katalog numarası 09-720-5) kullanarak çözüm Filtre ve filtre edilmiş solüsyon alüminyum folyo ile kaplanmış bir 8 ml Falcon tüp içinde saklamak;
Not uranil biçimleri toz Elektron Mikroskobu Bilimleri (Hatfield, PA), katalog numarası 22451 olarak satın alınabilir. Uranil format çözüm ışığa duyarlı ve Falcon tüp alüminyum folyo ile kaplayarak örneğin, doğrudan güneş ışığı uzak tutulmalıdır. Taze hazırlanmış bir çözüm açık sarı bir renk vardır (Şekil 3A). Leke çözüm presipite başlamadan önce 1-2 hafta boyunca tezgah üzerinde tutulmalıdır. Uranil format ~ 4 pH asittir. NaOH pH artar ekleme, ancak çok hızlı bir şekilde ekleyerekya da aşırı hızlanmasına neden leke neden olabilir. Uranil format, kontrast yanı sıra, aynı zamanda protein örneği giderir. Fiksasyon oranı çok hızlı olduğundan, genellikle düşük pH, toplam protein konformasyonlar veya protein kompleks oluşumu 7 etkiler değildir .
4. Negatif leke EM ızgara hazırlanması için protokol. Bu protokol daha önce 5 ayrıntılı olarak tarif edilmişti
- PELCO easiGlow GlowDischarge sistemi (Ted Pella Inc, USA) kullanılarak Kızdırma deşarj karbon kaplı ızgara,. Kullanılan akım 15 mA ve ızgaralar 30 sn. Taburcu parlaklık Glow-deşarj ızgaraları parlaklık boşaltma kısa bir süre sonra kullanılmalıdır. Biz genellikle kızdırma taburcu olduktan sonra en az 2 saat içinde ızgaraları kullanın.
- Place distile su iki 20μl parafilm bir parça düşer ve uranil format çözüm iki 25μl damla (Şekil 3B).
- Araba ile ters kuvvet anti-kapiller forseps kullanarak parlayan taburcu ızgara tutunbon-kaplı yüzü yukarı bakacak. Not: anti-kapiller forseps kullanmak gereklidir. Aksi takdirde, sıvı numune ızgaralardan forseps arasındaki kılcal kuvvet tarafından emilir olacak.
- 2μl protein örneği parlayan taburcu ızgara uygulayın ve 30 saniye bekleyin. Not: bekleme süresi ve parlaklık deşarj süresini kılavuzunda adsorbe proteinlerin konsantrasyonu etkiler. Çok seyreltilmiş numune uzun adsorpsiyon kez gerektirir. Ancak, uzun süreli adsorpsiyon su buharları beri tampon konsantrasyonu değişebilir. Kılavuzunda uygun bir parçacık dağılımı elde etmek için biraz deneme yanılma yaklaşımı gerektirir.
- Örnek filtre kağıdı kullanarak kurutun.
- Bir su damlası ızgara yüzeyine dokunun ve sonra su filtre kağıdı ile kurulayın. 2. damla su ile tekrarlayın.
- Leke kısaca ilk damlasına kadar ızgara yüzeyine dokunmayın. Filtre kağıdı ile leke çözüm kurutun.
- 20 saniye boyunca leke ikinci damlasına kadar ızgara yüzeyine dokunmayın. Leke ofiltre kağıdı ile ff leke çözüm.
- Izgara bir vakum kullanarak kurutun. Not: Bir bankta ya da kimyasal bir kaput hava kuru ızgaraları da bırakabilirsiniz. Kuru vakum yararına bir EM ızgaraları hemen izleyebilirsiniz. Hızlı kuruyan tarafından üretilen mümkün artifakı leke düzensiz.
5. Geçirimli elektron mikroskobu
- Bu gösteri kullanılan mikroskop Gatan 4K x 4K CCD kamera ile donatılmış bir Tecnai T12 (FEI Şirketi).
- Kısaca örnek takmadan önce mikroskop hizalama kontrol edin; Not: Bu EM başına sadece bir kez oturum gereklidir. Yakın mükemmel bir uyum bir model mikroskop, daha önce kaydedilmiş olabilir. Böyle bir hizalama dosyasını yükleme mikroskop hizalama mükemmele yakın bir duruma geri yüklemeniz gerekir.
- Tek bir eğim standart numune tutucu EM ızgara yükleyin.
- Tutucu T12 CompuStage içine yerleştirin. Pompalama döngüsünü tamamlamak için bekleyin.
- Sahibine sütuna yerleştirin. </ Li>
- Örnek Focus ve istenen bir bulanıklaştırma, genellikle-1.5um ayarlayabilirsiniz. Not: Odaklama minimum kontrast yöntemi kullanılarak elle odaklama veya canlı görüntüleri yakalama ve canlı Fourier güç spektrumu hesaplamak için CCD kamera kullanarak ya da elde edilebilir.
- CCD kamera kullanarak bir görüntü kaydetme;
- Lekeli proteinlerin olumsuz örneklerin görüntüleri, proteinler genellikle beyaz kontrast, yani koyu bir arka plana karşı beyaz yoğunluğu görülür. Not aynı grid farklı alanlarda protein konsantrasyonları genellikle oldukça benzer iken, aynı grid farklı alanlarda bir leke farklı düzeylerde gözlemleyebilirsiniz yaptığı. Bazen diğer bazı alanlarda ise mükemmel bir leke alanları, düzensiz boyama ya da pozitif boyanma (protein hafif bir arka plan üzerinde koyu görünüyor) olabilir. Genellikle, görüntüleme için iyi bir alan bulmak için kılavuz aramak için gerekli.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Olumsuz sta tipik iyi görüntü örnekleriincelendiği numuneler, at dalak ferritin (Şekil 4A), Fab (Şekil 4B), arke 20S proteazom (Şekil 4C) ve nucleosome (Şekil 4D), gösterilmiştir.
Şekil 1. EM ızgaraları kolloidon film yüzeyinde kapalı bir ambalaj desen tek-bir yerleştirme A) negatif karbon kaplı ızgaraları hazırlanması EM leke. B) ızgaraları alanında biraz daha büyük bir kağıt parçası yerleştirme. C) kağıt tamamen ıslanması kadar bekleyin. D) kurutmak için hava ızgaraları ile birlikte kağıt Pick up.
Şekil 2. Bir nokta ucu sivriltilmiş bir çubuk (solda), kaplama aparat yer iki karbon çubuklar: karbon ile kaplanması EM ızgaraları A) karbon evaporatör Kur. Diğer çubuk (sağda), düz bir yüzeye sahiptir ve tam tersi bir noktaya ucu ile temaside. B) beslenen bir cam slayt bir tarafında küçük bir miktar vakum gres yağı koyun. Siyah çerçeve içinde vakum gres vardır. C) kaplama ızgaraları Kur. Cam slaytlar kağıdı konumda tutmak için kullanılır. Ok ucu vakum gres ile alan işaret ediyor. D) kaplama tamamlandıktan sonra, kapalı vakum gres ile slayt renk renk değiştirmez. Kontrast kaplı karbon kalınlığı gösterir.
Şekil 3. Negatif boyama prosedürü gösteren A) Taze hazırlanmış (sol) uranil format çözüm Çökelek işareti olmadan şeffaf. 1 ~ 2 hafta sonra, tüpün alt alt biriken çökeltiler. B) Yer distile su ve bir parça parafilm uranil format çözüm iki damla iki damla (~ 25μl). Karbon yüzü parlayan bir taburcu karbon kaplı EM ızgara tutmak için anti-kapiller forseps bir çift kullanınkadar. Bir damla örnek (~ 2μl) kılavuzunda yer almaktadır. C) 30 saniye bekledikten sonra, bir filtre kağıdı ile çözüm kurulayın. D) ilk damla su ile ızgara örnek tarafında dokunmatik ızgara çevirin. Boyanma işlemi tamamlamak için adım C ve D tekrarlayın.
Şekil 4. Antijen bağlama (Fab), C olumsuz lekeli protein örnekleri EM görüntü örnekleri. A) At dalak ferritin, B) fragman) arke 20S proteazom ve D) nucleosome. Tüm görüntüler de aynı büyütme ile kaydedildi. Ölçekleme çubuğu 20nm.
Discussion
Leke Negatif EM rastgele konik tenteli, aynı bölgede örnek bir 60 ° eğik ve bir görüntü bir çift toplama yöntemi, 8, saflaştırılmış protein örneklerinin 3D yapıları, çalışma için kullanılan güçlü bir araçtır ancak makromoleküler kompleksleri 3D rekonstrüksiyonlar hesaplamak için untilted. Buna ek olarak, negatif boyama EM, 10, ya da sadece homojenlik ve / veya bu nedenle saflaştırılmış proteinler örnek heterojenite görselleştirmek için farklı konformasyonlar protein kompleksleri görselleştirme zarı proteinleri 9, iki boyutlu (2D) kristaller için tarama gibi diğer birçok uygulama var. Protein saflaştırma yöntemleri geliştirmek için geri bildirimler sağlanması, vb biyokimyacılar için güçlü bir tahlil edilebilir. Bu makalede, biz karbon kaplı ızgaraları bir elektron mikroskop görüntüleri olumsuz lekeli protein örnekleri toplamaya hazırlanıyor kadar uzanan protokoller sundu. Burada gösterildiği gibi,prosedürü takip etmek oldukça basit ve kolay. Eğer rastgele konik eğim yöntemi tarafından gözlemlenen örnek 3D rekonstrüksiyonlar hesaplamak için çalışırken, tilt çifti görüntüleri elde etmek için gereklidir. Ancak, tek parçacık analizi yapmak amacı ise, birden fazla untilted görüntüler yeterli olacaktır. Her iki durumda da, daha fazla görüntü işleme gereklidir ve bu bu video makalenin kapsamı dışındadır.
Herhangi bir yöntem olduğu gibi, protokoller çeşitleri vardır. Uranil format, çoğu durumda olumsuz bir leke reaktif olarak çok iyi çalışıyor. Uranil asetat yaygın olarak kullanılan başka bir olumsuz leke reaktif. Uranil format olarak çok benzer çalışır, ancak birçok durumda daha büyük bir tane boyutu ve uranil format daha düşük kontrast. Uranil asetat kullanmanın avantajı çözüm uranil format daha uzun sürer. Bir taze bir çözüm hazırlamak için her bir ya da iki hafta bir ihtiyacı yoktur. Uranil format ve asetat asidiktir. Bariz bir endişe olduğunudüşük pH, protein örnek çalışılan değişikliklere neden olabilir. Her iki leke çözümleri aynı zamanda protein fiksatif olarak işlev görür. Daha önceki bir çalışmada her ikisinin de düzeltme protein örneklerinin hızla 7 göstermiştir. Bu hızlı fiksasyonu düşük pH daha az önemli hale getirmektedir. Düşük pH herhangi bir değişiklik neden önce boyanma işlemi sırasında, sabit bir protein örnek olur. Bununla birlikte, amonyum molibdat ve fosfotungstik asit gibi diğer olumsuz leke reaktifler, düşük pH bir endişe 7 boyama örnekleri için daha iyi sonuçlar verebilir. Amonyum molibdat ve fosfotungstik asit yaklaşık nötr pH var, ama bu lekeleri tarafından oluşturulan protein örneklerinin kontrast genellikle uranil format aşağı.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Cheng laboratuvar Elektron mikroskobu çalışmaları kısmen NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 ve P50GM082250 (A. Frankel)) ve Atılım Biyomedikal Araştırma, Fırsat Ödülü ve Yeni Teknoloji Ödülü, UCSF Programı hibe hibe destek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
