Summary
En One-Step RT-PCR assay til detektion og genogruppe identifikation af norovirus isolater fra børns afføring, som udnytter primere og TaqMan prober specifikke for den åbne læseramme 1 (ORF1)-ORF2 forbindelsesregionen, mest konserverede region i norovirus genomet er beskrevet. En ikke-kommercielle, omkostningseffektive RNA ekstraktion metode er nærmere beskrevet.
Abstract
Norovira (NoVs) er den hyppigste årsag til udbrud af sporadisk akut gastroenteritis på verdensplan i mennesker i alle aldre. De er vigtig årsag til indlæggelser hos børn med en indvirkning på folkesundheden, der svarer til Rotavirus. NoVs er RNA-vira med stor genetisk diversitet, og der er en kontinuerlig forekomst af nye stammer. Fem genogrupper indregnes, GI og GII med deres mange genotyper og subtyper er det vigtigste for smitte til mennesker. Imidlertid diagnosen af disse to genotyper stadig problematisk, forsinke diagnose og behandling. 1, 2, 3
For RNA-ekstraktion fra fæcesprøver den mest almindeligt anvendte fremgangsmåde er QIAmp virale RNA kommercielt kit fra Qiagen. Denne fremgangsmåde kombinerer bindingsegenskaberne af silicagel membran, buffere, der styrer RNaser og giver optimal binding af RNA til søjlen sammen med hastigheden af MicroSpin. Denne metode er enkel, hurtig og pålidelig og er CarrIED ud i et par trin, der er beskrevet i beskrivelsen leveres af producenten.
Norovirus er kun overgået af rotavirus som den mest almindelige årsag til diarré. Norovirus diagnosen bør være tilgængelige i alle undersøgelser af patogenese af diarré samt i udbrud eller individuelle diarré sager. På nuværende tidspunkt er imidlertid norovirus diagnose er begrænset til nogle få centre på grund af mangel af simple metoder til diagnosticering. Dette forsinker diagnose og behandling 1, 2, 3. Desuden bruger på grund af omkostninger og reguleret transport af ætsende buffere i og mellem landene af disse fremstillede kits udgør logistiske problemer. Som et resultat har vi i denne protokol beskriver en alternativ økonomisk, in-house metode, som er baseret på den oprindelige Boom et al. Fremgangsmåde 4 som anvender de nucleinsyrebindende egenskaber silicapartikler sammen med anti-nuklease egenskaber guanidiniumthiocyanat .
et al. 5 er nærmere. Sekventering af PCR-produktet fra konventionel PCR muliggør differentiering af genotyper, der tilhører GI og GII genogrupper.
Protocol
1. Afføringsprøver
- Afføringsprøver skal opbevares nedfrosset til at bevare RNA. At gøre en 10% fækalt suspension tage ca 0,1 g optøet afføringsprøve og afslutte til 1 ml med PBS.
- Alikvot på 200 ul at undgå gentagen frysning og optøning. Opbevares i aliquoter ved -70 ° C.
- Optø og centrifugeres alikvoter ved 4000 g i 10 min før anvendelse i ekstraktionen.
2. Fremstilling af siliciumdioxidovertrukket partikler til Ekstraktion med guanidin og Silica
- Ved stuetemperatur, suspendere 30 g siliciumdioxid og komplet med dH2O op til 250 ml.
- Efter 24 timer ved sedimentering, fjernes 215 ml af supernatanten ved sugning. Tilsættes dH2O op til 250 ml, og suspenderer silica pellet ved omrystning.
- Efter yderligere 24 timer, fjernes supernatanten ved sugning, og pH indstilles på silica suspensionen til pH 2,0, under anvendelse af saltsyre (HCl). Aliquot silica suspensionen i glas bottles og autoklaven.
3. Fremstillinq af L6 Buffer til Ekstraktion med guanidin og Silica
- Ved stuetemperatur, fremstilles L6 puffer ved at opløse 60 g guanidiniumthiocyanat (GuSCN) og 1,3 g Triton X-100 i 50 ml 0,1 M Tris-hydrochlorid, pH 6,4, og 11 ml af en 0,2 M EDTA, pH 8,0 opløsning.
4. Fremstillinq af L2-puffer til ekstraktion med guanidin og Silica
- Ved stuetemperatur, fremstilles L2-puffer ved at opløse 180 g guanidiniumthiocyanat (GuSCN) i 150 ml 0,1 M Tris-hydrochlorid, pH 6,4.
5. Ekstraktionsprocedure
- I hver udtræk en nov positiv afføringsprøve, som positiv kontrol, og DEPC behandlet vand, som negativ kontrol, bør medtages.
- I en mikro-centrifugerør blande følgende: 1 ml puffer L6, 20 uL af silicapartikler, og der tilsættes 200 pi af 10% fækale ekstrakt suspension. Vortex kortvarigt og henstår ved stuetemperatur i 15 min.
- Centrifugeres suspensionen ved 6000 g i 10 s og vaskes pelleten med 1 ml puffer L2 to gange, efterfulgt af to vaske med 70% ethanol og en gang med acetone. Tørre pellet i en tør varmeblok ved 56 ° C i 5 min.
- Hydrat RNA'et i silica pellet ved at tilsætte 50 pi RNase-frit dH 2 0. Tilsæt 1 pi RNasin, blandes ved at vende røret og inkuber ved 56 ° C i 15 min.
- Centrifugeres i 3 minutter ved fuld hastighed i en bordcentrifuge, og indsamle 40 pi af supernatanten indeholdende RNA.
- Kvantificere de udtagne RNA-prøver ved hjælp af Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Derefter opbevares ved -70 ° C indtil anvendelse, op til 6 måneder. (Bemærk: En bedre måde at bevare totalt RNA intakt er at omdanne det til cDNA).
6. Alternativ ekstraktion ved hjælp af Commercial RNA QIAamp Viral RNA Kit
Komplet instruktion findes i hæftet provsynet med den QIAGEN kit. Kort fortalt er fremgangsmåden som følger:
- Pipette 560 pi puffer AVL indeholder bæreren RNA i et 1,5 ml rør, og der tilsættes 140 pi af 10% afføringssuspension. Blanding af puls-hvirvelblanding i 15 sek. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Tilsæt 560 ul af ethanol (96-100%) til prøven og bland ved puls-hvirvelblanding i 15 sekunder, og derefter kortvarigt centrifugeres.
- Anvende 630 ul af denne opløsning til en centrifugesøjle anbragt i en 2 ml opsamlingsrør. Centrifugeres i 1 minut ved 6000 g og derefter placere spinkolonne til et rent 2 ml rør.
- Vask kolonne, der indeholder bundne RNA med 500 pi puffer AW1 og centrifugeres ved 6000 g i 1 min. Sted kolonne i et rent 2 ml opsamlingsrør.
- Vaskes søjlen med 500 pi puffer AW2 og centrifugeres ved fuld hastighed (20.000 g eller 14.000 rpm) i 3 minutter.
- Sted spinkolonne i en ren 1,5 ml mikro-centrifugerør, og der tilsættes 40 uL DEPC-behandlet vand og elueres RNA med fuld hastighed. Gentag påce til en endelig 80 pi eluerede RNA.
- Kvantificere de udtagne RNA-prøver ved hjælp af Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Derefter opbevares ved -70 ° C indtil anvendelse, op til 6 måneder. (Bemærk: En bedre måde at bevare totalt RNA intakt er at omdanne det til cDNA).
7. Påvisning af Norovirus i ekstraherede RNA ved Et-trins realtiden rt-PCR med specifikke TaqMan Prober
Instrument StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).
Metode
- Tør og Rengør alle arbejdsflader, pipetter og centrifuger med RNase AWAY for at fjerne enhver potentiel RNase forurening.
- Afpipettér den NOV GI og GII screening masterblandinger henhold til tabel 1. Primere og Taqman prober er anført i tabel 2.
- Portion 10 pi passende stamblanding til hvert reaktionsglas.
- Tilsættes 5 pi ufortyndet ukendt prøveRNA, DEPC-behandlet vand som negativ kontrol, eller GI henholdsvis GII positiv kontrol-RNA, til de tilsvarende reaktionsskakter. Alle prøver skal køres i to eksemplarer. Positive kontroller og standarder med en koncentration på 300 ug / ul og 500 mg / ul henholdsvis blev leveret af National calicivirus Laboratory Center for Disease Control og Forebyggelse (CDC).
- Centrifugeres reaktionsblandingen pladen ved 6000 g i 10 sek.
- I forsøget egenskaber skærmen, definere og vælg en type af eksperiment for kørslen. Sørg for, at TaqMan reagenser vises som reagenser type, og at Pre-PCR læst og forstærkning er valgt.
- Kør 15 pi reaktioner under anvendelse af termisk profil i tabel 3.
- Analysere resultaterne.
8. Genotypebestemmelse af NOV GI og GII anvendelse af konventionel RT-PCR og sekventering
(Det er ikke nævnt i denne video, da det er en almindelig og udbredt metode.)
Instrument. Applied Biosystems StepOne og StepOnePlus real-time PCR systemer med Quantitec skabelonen.
Metode
- Før genotype er det genogruppe (GI eller GII) af prøverne bestemmes ved screening RT-PCR som beskrevet ovenfor. GI NOV RNA skal forstærkes med GI genotypebestemmelse stamblandingen og GII nov RNA med GII genotypebestemmelse Master mix.
- Afpipettér den NOV GI og GII genotypebestemmelse masterblandinger efter tabel 4. Primere GI SKF / SKR og G2 SKF / SKR er anført i tabel 5.
- Portion 45 pi af den passende stamblanding til 0,2 ml reaktionsrør.
- Tilsættes 5 pi DEPC-behandlet vand til hvert negativ kontrol rør, og 5 pi af præ-screenes, Nov (GI og / eller GII) positive RNA til den tilsvarende reaktionsrøret.
- Løbe 50 ul reaktion anvender termisk profil i tabel 6.
- Send PCR-produkter contaiNing mindst 100 ng / ul af det amplificerede capsid regionen Macrogen Company for rensning og sekventering. (9700 Great Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 og $ 10 per prøve pr sekventering).
9. Repræsentative resultater
Figur 1 viser repræsentative resultater fra Taqman One-Step RT-PCR, når de anvendes til assay RNA ekstraheret fra fæcesprøver fra diarré børn. Tærsklen cyklus (Ct) for en positiv prøve blev sat til mindre end eller lig med Ct 37 for GI og Ct 39 for GII. CT-værdierne for de positive kontroller viste sig at være mindre end 27 og 18 i ORF1-ORF2 knudepunkt for GI og GII, hhv. Klik her for at se større figur .
Figur 2
| Master Mix | Slutkoncentration | Volumen (pi) |
| H2O 0 PCR | 2,875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6,250 |
| RT Mix | 1x | 0,125 |
| 50 uM Cog R primer | 1 uM | 0,250 |
| 50 uM Cog F primer | 1pM | 0,250 |
| 10 uM Ring probe | 1 uM | 0.125/0.250 * |
| 10,00 |
* 0,250 uL af hver probe blev anvendt til GI afprøvning, medens 0,125 uL af hver probe blev anvendt til GII testning.
Tabel 1. Qiagen Quantitect Master mix til screening GI og GII (Trujillo et al., 2006). 7
| Navn | Geno-gruppe | Brug | Sekvens (5 'til 3') |
| Cog 1R | GI | Primer | CTT AGA CGC KAT KAT KAT TyA C |
| Cog 1F | GI | Primer | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | GII | Primer | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA |
| Cog 2F | GII | Primer | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Ring 1A | GI | Probe | FAM-AGA TYG CGA Tredjelande FTT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring 1B | GI | Probe | FAM-AGA TCG CGG TCT FTT GTC CA-BHQ-1 |
| RING2-TP | GII | Probe | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
Tabel 2 nedenfor. Primer og probe oligonukleotider anvendt til kvantitativ realtids-RT-PCR for genogrupper I, II (Kageyama et al.2003). 8
| Trin | Temperatur (° C) | Tid (min) | |
| 1 | 50 | 30:00 | cDNA-syntese |
| 2 | 95 | 15:00 | Hotstart Taq-polymerase aktivering |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | 45x cykler |
Bord3. Termisk profil for One-step Taqman Real time RT-PCR (Trujillo et al., 2006). 7
| Master Mix | Slutkoncentration | Volumen (pi) |
| H2O 0 PCR | 29,50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR-buffer | 1x | 10,00 |
| 10 mM dNTP-blanding | 0,4 mM | 2,00 |
| Enzymblanding | 2,00 | |
| 40 U / ul RNAsin | 20 U / ul | 0,50 |
| 10 uM SKF | 0,1 uM | 0,50 |
| 10 uM SKR | 0,1 uM | 0,50 |
| 45,00 |
Tabel 4. Qiagen One-Step RT-PCR master-blanding for genotypebestemmelse GI og GII.
| Navn | Geno-gruppe | Brug | Sekvens (5 'til 3') |
| G1SKF | GI | Primer | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | Primer | 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | GII | Primer | 5'-CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | GII | Primer | 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Tabel 5. Primere anvendt til amplificering af regionen C capsid region (Kojima et al., 2002). 5
| Trin | Temperatur (° C) | Tid (min) | |
| 1 | 60 | 30:00 | cDNA-syntese |
| 2 | 96 | 15:00 | Hotstart Taq-polymerase aktivering |
| 3 | 94 | 00:030 | |
| 52 | 01:00 | 40x cykler | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Annealing |
Tabel 6. Termiske profil til Taqman One-Step RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af økonomiske i huset fremgangsmåde til isolering af nukleinsyre fra afføringsprøver, vi opnå samme resultater som med det kommercielle QIAmp Viral RNA-kittet fra Qiagen, og sammen med TaqMan RT-PCR udviklet i vores laboratorium har vi kan detektere et bredt område af NOV genotyper tilhører GI og GII genogruppe. En nylig offentliggørelse af regionens C-protokollen rapporteret genotypebestemmelse satser på 78% 6. Siden mangfoldigheden af moderne nov stammer har været stigende i de foregående år, vil den succesrate afhænger af uoverensstemmelser af primere i område C for de prøver, der testes. Assayet er egnet til rutinemæssig diagnose, da det eliminerer post-amplifikation forarbejdning, hvilket forkorter den ekspeditionstid 7. Bortset fra diagnose, kan denne protokol også bruges til afklaring af epidemiologi nov infektioner, vil således være nyttigt for den offentlige sundhed kontrol af denne sygdom.
Når de kører screening RT-PCR, negativ kontrol (NC) reaktioner for primer / probe sæt bør ikke udvise fluorescens vækstkurver, der krydser tærskelværdien linje. Hvis en falsk positiv forekommer med en eller flere af primer / probe sæt s NC reaktioner kan prøve forurening har fundet sted, og i alle disse tilfælde blev hele tiden ugyldig og gentages med strengere overholdelse af retningslinjerne.
Krydsreaktion til screening RT-PCR blev testet under anvendelse af GI og GII positive standarder leveret af CDC. Ingen krydsreaktion blev observeret mellem GI primere og prober med GII RNA og vice versa. Reproducerbarheden af screeningen RT-PCR var høj som CT-værdier, hvor ens for gentagne kørsler med RNA fra de positive kontroller. RNA fra børn afføringsprøver, der var blevet fundet positiv for nov og havde Ct-værdier mellem 20 og 33, hvor efterfølgende forstærket af konventionel RT-PCR og sendes til genotypebestemmelse. Fem positive prøver med CT-værdier mellem 35 og 38 blev ikke sendt til fortløbendeCing som den virale belastning hvor fundet at være for lav til efterfølgende amplifikation ved anvendelse af konventionel RT-PCR.
I øjeblikket er tilgængeligheden af norovirus diagnosen begrænset, fordi de metoder, der ikke er i stand til at blive gennemført i lokale laboratorier med kun basisudstyr. Dette forsinker diagnose og behandling i individuelle diarré tilfælde eller i udbrud. Sættet Metoden er pålidelig og hurtig alligevel kræver en betydelig mængde tid og ressourcer til at transportere materialer til lande. Det koster tre gange så vores metode. Vi har vist en ekstra metode under anvendelse af let tilgængelige i landet reagenser til påvisning af NOV, der er lige så enkel, hurtig og pålidelig. Denne omkostningseffektive metode omgår afhængighed af materialer købt i udlandet, problemerne med internationale og intra-nationale regler på sin transport, som i sidste ende vil føre til en tilgængelig diagnose og hurtig behandling af en af de mest almindelige virale årsager til gastroenteritis i lmildren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke National calicivirus Laboratory Center for Disease Control og Forebyggelse (CDC) til den slags gave en standard og kontrol positive for Nov, og Laboratorier for School of Public Health ved Johns Hopkins for at levere de reagenser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
