Summary
Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.
Abstract
Norovirussen (NoVs) zijn de belangrijkste oorzaak van het uitbreken van sporadische acute gastro-enteritis over de hele wereld bij mensen van alle leeftijden. Zij zijn belangrijke oorzaak van ziekenhuisopnamen bij kinderen met volksgezondheidseffect vergelijkbaar met die van Rotavirus. NoVs zijn RNA virussen grote verscheidenheid genetische en er een continue weergave van nieuwe stammen. Vijf genogroepen worden erkend; GI en GII met hun vele genotypen en subtypen het meest belangrijk zijn voor menselijke besmetting. Echter, de diagnose van deze twee genotypes blijft problematisch, het uitstellen van diagnose en behandeling. 1, 2, 3
Voor RNA-extractie uit ontlasting specimens de meest gebruikte methode is de QIAmp Viraal RNA commerciële kit Qiagen. Deze methode worden de bindende eigenschappen van een silicagel membraan buffers die controle RNAses, voor een optimale binding van de RNA de kolom met de snelheid van Microspin. Deze methode is eenvoudig, snel en betrouwbaar en is carrIED in een paar stappen die worden beschreven in de beschrijving van de fabrikant.
Norovirus is de tweede alleen voor rotavirus de meest voorkomende oorzaak van diarree. Norovirus diagnose moet beschikbaar zijn in alle onderzoeken naar pathogenese van diarree en bij uitbraken of individuele diarree gevallen. Momenteel echter norovirus diagnose slechts een beperkt aantal centra door het ontbreken van eenvoudige technieken voor de diagnose. Dit vertraagt de diagnose en behandeling 1, 2, 3. Daarnaast is vanwege de kosten en gereguleerde transport van corrosieve buffers binnen en tussen landen het gebruik van deze gefabriceerde kits stelt logistieke problemen. Hierdoor, in dit protocol beschrijven we een alternatieve, economisch eigen methode is gebaseerd op de originele Boom et al.. Methode 4 waarin het nucleïnezuur bindingseigenschappen van silicadeeltjes gebruikt samen met de anti-nuclease eigenschappen guanidiniumthiocyanaat .
et al.. 5 is beschreven. Sequencing van het PCR-product van de conventionele PCR maakt de differentiatie van genotypes die tot GI en GII genogroepen.
Protocol
1. Kruk Monsters
- Kruk stalen worden bevroren om het RNA te behouden. Om een 10% fecale suspensie te maken, duurt ongeveer 0,1 g ontdooide stoelgangstaal en vul tot 1 ml met PBS.
- Aliquot in 200 ul om te voorkomen dat Herhaald invriezen en ontdooien. Bewaar de monsters bij -70 ° C
- Ontdooien en centrifugeer aliquots bij 4.000 g gedurende 10 minuten voor gebruik in extractie.
2. Voorbereiding van de silica deeltjes voor de extractie met Guanidine & Silica
- Bij kamertemperatuur, schorten 30 g siliciumdioxide en compleet met dH 2 O 250 ml.
- Na 24 uur van sedimentatie verwijderen 215 ml van de supernatant door afzuigen. Voeg dH 2 O tot 250 ml, en hang de silica pellet door schudden.
- Na nog 24 uur, de bovenstaande vloeistof door afzuigen en de pH van de silica suspensie op pH 2,0 met zoutzuur (HCl). Aliquot de silica suspensie in glazen botrust is gekomen en autoclaaf.
3. Voorbereiding van L6 buffer voor Extractie met Guanidine & Silica
- Bij KT, bereid door oplossen L6 buffer 60 g guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) en 1,3 g Triton X-100 in 50 ml 0,1 M Tris-hydrochloride, pH 6,4 en 11 ml van een 0,2 M EDTA, pH 8,0 oplossing.
4. Voorbereiding van de L2-buffer voor Extractie met Guanidine & Silica
- Bij KT, bereid door oplossen L2 buffer 180 g guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) in 150 ml 0,1 M Tris-hydrochloride, pH 6.4.
5. Extractieprocedure
- In elke extractie een NoV positief stoelgangstaal, als positieve controle, en DEPC behandeld water, als negatieve controle, moeten worden opgenomen.
- In een micro-centrifugebuis mengen volgende: 1 ml buffer L6, 20 pi van silicadeeltjes en voeg 200 pi van 10% faecale extract suspensie. Vortex kort en laat bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Centrifugeer de suspensie bij 6000 g gedurende 10 s en was de pellet met 1 ml buffer L2 tweemaal gevolgd door twee wasbeurten met 70% ethanol en eenmaal met aceton. Droog de pellet in een droge verwarmingsblok bij 56 ° C gedurende 5 minuten.
- Hydraat het RNA in de silica pellet door toevoeging van 50 ul van RNAse-vrij dH 2 0. Voeg 1 ul van RNAsin, meng door de buis en incuberen bij 56 ° C gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer 3 min op volle snelheid, in een tafelblad centrifuge, en verzamelen 40 pl van de supernatant die de RNA.
- Kwantificeer de geëxtraheerde RNA monsters met behulp van NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo wetenschappelijke). Dan slaan bij -70 ° C tot gebruik, tot 6 maanden. (Opmerking: Een betere manier om totaal RNA te behouden intact wordt omgezet in cDNA).
6. Alternatief extractie met behulp van het Handelsregister RNA QIAamp Viral RNA kit
Volledige instructies zijn te vinden in het boekje provzijdig de QIAGEN kit. Kort de procedure als volgt:
- Pipetteer 560 pi buffer AVL met de drager RNA in een 1,5 ml buis en voeg 140 pi 10% kruk suspensie. Mix van puls-vortexen gedurende 15 sec. Incubeer bij RT gedurende 10 minuten.
- Voeg 560 ul van ethanol (96-100%) aan het monster en meng door de puls-vortexen 15 sec, dan kort centrifugeren.
- Breng 630 pi van deze oplossing een spin kolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifugeer 1 min bij 6000 g; dan spin kolom te plaatsen in een schone buis 2 mL.
- Was de kolom met gebonden RNA met 500 pl van Buffer AW1 en centrifugeer bij 6.000 g gedurende 1 minuut. Plaats kolom in een schone 2 ml verzamelbuis.
- Was de kolom met 500 pi buffer AW2 en centrifugeer op volle snelheid (20.000 g of 14.000 rpm) gedurende 3 minuten.
- Plaats spin-kolom in een schoon 1,5 ml micro-centrifugebuis, voeg 40 ul DEPC-behandeld water en elueer het RNA op volle snelheid. Herhaal dit aance een laatste 80 pi RNA geëlueerd.
- Kwantificeer de geëxtraheerde RNA monsters met behulp van NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo wetenschappelijke). Dan slaan bij -70 ° C tot gebruik, tot 6 maanden. (Opmerking: Een betere manier om totaal RNA te behouden intact wordt omgezet in cDNA).
7. Detectie van Norovirus in geëxtraheerde RNA door een stap Real Time RT-PCR met specifieke Taqman Probes
Instrument StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).
Methodologie
- Veeg-en Reinig alle werkvlakken, pipetten en centrifuges met RNase AWAY om mogelijke RNase verontreiniging te verwijderen.
- Pipetteer de NOV GI en GII screening mastermengsels volgens tabel 1. Primers en Taqman probes staan in tabel 2.
- Aliquot 10 pi van een passende master mix aan elke reageerbuis.
- Voeg 5 pi zuivere onbekend monsterRNA, DEPC behandelde water als negatieve controle, of GI respectievelijk GII positieve controle RNA aan de overeenkomstige reactie putten. Alle monsters moet worden uitgevoerd in tweevoud. Positieve controles en normen met een concentratie van 300 ug / ul en 500 ug / ul respectievelijk werden verstrekt door de Nationale Calicivirus Laboratorium Center for Disease Control and Prevention (CDC).
- Centrifugeer de reactie plaat bij 6.000 g gedurende 10 sec.
- In het experiment eigenschappen scherm te definiëren en selecteer een soort van experiment voor de run. Zorg ervoor dat TaqMan reagentia worden weergegeven als de reagentia type, en dat de Pre-PCR lezen en versterking zijn geselecteerd.
- Voer 15 pi reacties met het thermische profiel in tabel 3.
- Analyseer de resultaten.
8. Genotypering van NoV GI en GII met behulp van conventionele RT-PCR en Sequencing
(Het is niet in deze video, omdat het een gebruikte en meest gebruikte methode.)
Instrument. Applied Biosystems StepOne en StepOnePlus Real Time PCR-systemen met de Quantitec sjabloon.
Methodologie
- Voor genotypering worden de genogroup (GI of GII) van de monsters door de screening RT-PCR zoals hierboven beschreven. GI NoV RNA moet worden versterkt met het GI-genotypering master mix en de GII NoV RNA met de GII genotypering master mix.
- Pipetteer de NOV GI en GII genotypering mastermengsels volgens tabel 4. Primers GI SKF / SKR en G2 SKF / SKR staan vermeld in tabel 5.
- Aliquot 45 pl van de juiste master mix met 0,2 ml reageerbuisjes.
- Voeg 5 pi DEPC-behandeld water elke negatieve controle buis en 5 pi gescreende, NoV (GI en / of GII) positief RNA de bijbehorende reactiebuis.
- Voer 50 pL reacties met het thermische profiel in tabel 6.
- Stuur PCR-producten containing ten minste 100 ng / pl van de versterkte capside regio Company Macrogen voor de zuivering en sequencing. (9700 Grote Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 en $ 10 per monster per sequencing).
9. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont representatief resultaat van de Taqman een-staps RT-PCR assay gebruikt als RNA, geëxtraheerd uit ontlasting van diarree kinderen. De drempel cyclus (Ct) voor een positief monster werd vastgesteld op minder of gelijk aan Ct 37 voor gastro-intestinale en Ct 39 voor GII. De Ct-waarden voor de positieve controles bleken te zijn minder dan 27 en 18 van het ORF1-ORF2 knooppunt voor GI en GII, respectievelijk. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2
| Master Mix | Laatste Conc | Volume (pi) |
| H 2 0 PCR | 2,875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6,250 |
| RT Mix | 1x | 0,125 |
| 50 pM Cog R primer | 1 pM | 0,250 |
| 50 pM Cog F primer | 1uM | 0,250 |
| Ring 10 uM probe | 1 pM | 0.125/0.250 * |
| 10,00 |
* 0,250 pi van elke probe werd gebruikt voor testen GI, terwijl 0,125 pi van elke probe werd gebruikt voor testen GII.
Tabel 1. Qiagen Quantitect master mix voor screening GI en GII (Trujillo et al., 2006). 7.
| Naam | Geno-groep | Gebruiken | Sequentie (5 'naar 3') |
| Cog 1R | GI | Grondverf | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C |
| Cog 1F | GI | Grondverf | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | GII | Grondverf | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA |
| Cog 2F | GII | Grondverf | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Ring 1A | GI | Sonde | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring 1B | GI | Sonde | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | GII | Sonde | FAM-TGG GAG GAT GGC CGC AAT CT-BHQ-1 |
Tabel 2. Primer en probe-oligonucleotiden gebruikt voor real-time kwantitatieve RT-PCR voor genogroepen I, II (Kageyama et al..,2003). 8
| Stap | (° C) | Tijd (min) | |
| 1 | 50 | 30:00 | cDNA synthese |
| 2 | 95 | 15:00 | HotStart Taq polymerase activering |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | 45X cycli |
Tafel3. Thermische profiel voor een stap Taqman Real-time RT-PCR (Trujillo et al., 2006). 7.
| Master Mix | Laatste Conc | Volume (pi) |
| H 2 0 PCR | 29,50 | |
| 5x Qiagen RT-PCR-buffer | 1x | 10,00 |
| 10 mM dNTP Mix | 0,4 mM | 2,00 |
| Enzymmengsel | 2,00 | |
| 40 U / ul RNAsin | 20 U / ul | 0,50 |
| 10 uM SKF | 0,1 uM | 0,50 |
| 10 uM SKR | 0,1 uM | 0,50 |
| 45,00 |
Tabel 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix voor genotypering GI en GII.
| Naam | Geno-groep | Gebruiken | Sequentie (5 'naar 3') |
| G1SKF | GI | Grondverf | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT-GA - 3 |
| G1SKR | GI | Grondverf | 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | GII | Grondverf | 5'-CNT GGG GCG AGG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | GII | Grondverf | 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Tabel 5. Primers gebruikt voor amplificatie van gebied C van capside Region (Kojima et al.. 2002) 5.
| Stap | (° C) | Tijd (min) | |
| 1 | 60 | 30:00 | cDNA synthese |
| 2 | 96 | 15:00 | HotStart Taq polymerase activering |
| 3 | 94 | 00:030 | |
| 52 | 01:00 | 40X cycli | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Gloeien |
Tabel 6. Thermische profiel voor Taqman One-Step RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De economische eigen methode voor het isoleren van nucleïnezuur uit ontlasting wij gelijke resultaten verkregen als bij de commerciële QIAmp Viraal RNA kit Qiagen, samen met de TaqMan RT-PCR ontwikkeld in ons laboratorium kunnen detecteren breed NoV genotypen die behoren tot de GI en GII genogroup. Een recente publicatie van de regio C-protocol gemeld genotypering tarieven van 78% 6. Omdat de diversiteit van de hedendaagse NoV stammen is toegenomen in de voorgaande jaren zal het succes afhankelijk is van de mismatches van de primers in de regio C voor de specimens die worden getest. De test is nuttig voor routine diagnostische aangezien op deze wijze post-amplificatie product verwerken, waardoor het verkorten van de doorlooptijd 7. Naast diagnose kan dit protocol ook worden gebruikt voor het verduidelijken van de epidemiologie van NoV infecties, dus bruikbaar voor de volksgezondheid controle van de ziekte.
Bij het uitvoeren van de screening RT-PCR, negatieve controle (NC) reacties voor primer / probe sets zou niet vertonen fluorescentie groeicurven dat de drempel lijn over te steken. Als er een vals-positieve optreedt met een of meer van NC de primer / probe set de reacties, monster besmetting kan hebben plaatsgevonden, en in al deze gevallen werd de gehele run ongeldig en herhaald met een striktere naleving van de richtlijnen.
Steek reactie voor de screening RT-PCR werd getest met behulp van de GI en GII positieve normen van CDC. Geen kruisreactie waargenomen tussen GI primers en probes met GII RNA en vice versa. De reproduceerbaarheid van de screening RT-PCR werd hoog Ct-waarden bij dergelijke voor herhaalde loopt met RNA van de positieve controle. RNA van kinderen ontlasting die was positief gevonden voor nov en had Ct-waarden tussen 20 en 33, waar vervolgens versterkt door de conventionele RT-PCR en gestuurd voor genotypering. Vijf positieve monsters met Ct-waarden tussen 35 en 38 werden niet verstuurd voor de achtereenvolgendeCing de virale belasting zijn gevonden te laag voor verdere amplificatie met de conventionele RT-PCR.
Op dit moment wordt de beschikbaarheid van norovirus diagnose beperkt, omdat de methoden niet in staat zijn uit te voeren in de lokale laboratoria met slechts basisuitrusting. Dit vertraagt de diagnose en behandeling in individuele gevallen of diarree in uitbraken. De kit methode is betrouwbaar en snel maar vereist een aanzienlijke hoeveelheid tijd en middelen om materialen te vervoeren naar landen. De kosten zijn drie keer die van onze methode. We hebben laten zien een extra methode met behulp van gemakkelijk verkrijgbare in het land reagentia voor de detectie van NoV dat is net zo eenvoudig, snel en betrouwbaar. Deze kosten-effectieve methode omzeilt de afhankelijkheid van materialen die worden aangekocht in het buitenland, de problemen van internationale en intra-nationale regelgeving op het vervoer, die uiteindelijk zal leiden tot een toegankelijke diagnose en snelle behandeling van een van de meest voorkomende virale oorzaak van gastro-enteritis in de lildren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag naar het Nationaal Calicivirus Laboratorium Center for Disease Control and Prevention (CDC) bedanken voor de vriendelijke gift van een standaard en controle positieven voor de NOV, en de laboratoria van de School of Public Health aan de Johns Hopkins voor het leveren van de reagentia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
