Summary
オープンリーディングフレーム1（ORF1）ORF2接合領域に特異的なプライマーとTaqManプローブを利用して子どもの便からノロウイルス分離株の検出および遺伝子型の識別のためのワンステップRT-PCRアッセイ、ノロウイルスゲノムの中で最も保存領域です。説明します。非商業的、費用対効果の高いRNA抽出法が詳述されている。
Abstract
ノロウイルス（NoVs）はすべての年齢の人間の世界的な散発的な急性胃腸炎の集団発生の主要原因となっています。彼らは、ロタウイルスに似た公衆衛生上の影響を持つ子どもの入院の重要な原因となっています。 NoVsは偉大な遺伝的多様性のRNAウイルスであり、新しい株の連続的な外観があります。五genogroupsが認識され、GIとGIIを彼らの多くの遺伝子型とヒトへの感染のために最も重要なサブタイプである。しかし、これら2つの遺伝子型の診断は、診断と治療を遅らせることは、問題のままである。1、2、3
糞便検体からのRNA抽出のために最も一般的に使用されるメソッドは、QiagenからQIAmpウイルスRNA市販のキットです。このメソッドは、コントロールRNaseがそのバッファを、シリカゲルメンブレンの結合特性を組み合わせて、マイクロスピンの速度と一緒にカラムにRNAの最適な結合を提供しています。このメソッドは、簡単で高速かつ信頼性が高く、カーです。製造元から提供されている記述で詳述されているいくつかのステップでiedを。
ノロウイルスは、下痢の最も一般的な原因として、ロタウイルスに次ぐです。ノロウイルスの診断は、下痢の病因のすべての研究で同様の発生、または個々の下痢症で使用できる必要があります。現在ではしかし、ノロウイルスの診断は、診断の簡単な方法の欠如に起因するわずか数センターに限定されています。この遅延の診断と治療1、2、3。さらに、国内および間に腐食性のバッファのコストと規制輸送に起因するこれらの製造キットの使用ロジスティック問題を引き起こします。結果として、このプロトコルで我々は、グアニジニウムチオシアネートの抗ヌクレアーゼのプロパティと一緒にシリカ粒子の核酸結合特性を使用して、元のブームらの方法4に基づいて、代替的、経済的、社内の方法を説明。
らによって記載されたプライマーを用いて5の主要タンパク質から高可変N末端 シェルをターゲットにして、従来のRT-PCRのために詳述されている。従来のPCRからのPCR産物のシークエンシングは、GIとGII genogroupsに属する遺伝子の分化を可能にします。
Protocol
1。糞便サンプル
- 糞便サンプルは、RNAを維持するために凍結保存する必要があります。 10パーセント糞便懸濁液を作成するには、解凍糞便サンプルの約0.1グラムをとり、PBS 1 mlに完了します。
- 繰り返し凍結融解を避けるために、200μlのアリコート。 -70℃でアリコートを格納する
- 解凍および抽出に使用する前に、10分間4000グラムでアリコートを遠心分離します。
2。グアニジン＆シリカの抽出のためのシリカ粒子の調製
- RTで、二酸化珪素の30グラムを中断し、最大250 mLのdH 2 Oで完了します。
- 沈降の24時間後、吸引により上清215 mLを削除します。最大250 mLまでのdH 2 Oを追加し、振とうすることによりシリカペレットを中断します。
- 別の24時間後、吸引により上清を除去し、塩酸（HCl）を用いて、pHを2.0にシリカ懸濁液のpHを調整します。アリコートガラスのボットで得られたシリカ懸濁液tles、オートクレーブ。
3。グアニジン＆シリカの抽出のためのL6バッファーの調製
- 室温で、0.1 Mトリス塩酸50mLのpHは6.4と0.2 M EDTA、pH8.0の溶液を11 mLのグアニジニウムチオシアネート（GuSCN）とトリトンX-100の1.3グラムの60グラムを溶解させたL6バッファを準備します。
4。グアニジン＆シリカの抽出のためのL2バッファの準備
- 室温で、0.1 Mトリス塩酸150mLを、pHを6.4にグアニジニウムチオシアネート（GuSCN）の180グラムを溶解させたL2バッファを準備します。
5。抽出法
- 各抽出年11肯定的な糞便サンプルは、ポジティブコントロール、およびDEPC処理水として、ネガティブコントロールとして、含まれるべきである。
- マイクロ遠心チューブに次のように混ぜる。バッファL6、シリカ粒子の20μLを1 mL、10％糞便抽出懸濁液200μLを追加します。簡単にボルテックスし、15マイルRTで残すN。
- 10秒間6000グラムで、懸濁液を遠心分離し、70％エタノールで2回洗浄し、アセトンで1時間、続いて二回バッファL2の1ミリリットルでペレットを洗浄する。 56℃乾燥した加熱ブロックにペレットを乾燥℃で5分間。
- RNaseフリーのdH 2 O50μLを追加することにより、シリカペレットの水和物は、RNA。 15分間RNasinの1μL、56で反転管とインキュベートすることにより混合°Cを追加します。
- 卓上遠心機で、フルスピードで3分間遠心し、RNAを含む上清の40μLを収集します。
- 光度計2000分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して抽出したRNAサンプルを定量化する。次いで-70℃で保存を使用するまで、6ヶ月まで。 （ 注：完全なトータルRNAを維持する良い方法は、cDNAに変換されます）。
6。商業RNA別途準備ウイルスRNAキットを使用して別の抽出
完全な手順については、冊子プロブで発見されQIAGENキットでided。簡単に手順は次のとおりです。
- バッファAVLのピペットで560μLを1.5 mLチューブにキャリアRNAを含む、10％糞便懸濁液140μLを追加します。 15秒間パルスボルテックスで混和。 10分間室温でインキュベートします。
- 15秒間パルスボルテックスサンプルと混合するエタノール560μL（96〜100％）を追加し、手短に遠心します。
- 2 mlのコレクションチューブに入れ、スピンカラムに、このソリューションの630μLを適用します。 6000グラムで1分間遠心してから、クリーンな2 mLのチューブにスピンカラムを配置します。
- 1分間6000グラムで、バッファAW1および遠心の500μLと結合したRNAを含むカラムを洗浄します。きれいな2 mlのコレクションチューブにカラムを配置します。
- 3分間、フルスピード（20,000 gまたは14,000 rpmで）500 Buffer AW2をμLの遠心でカラムを洗浄します。
- 、新しい1.5 mlマイクロ遠心チューブにスピンカラムを置き40μLDEPC処理水を追加し、フルスピードでRNAを溶出します。を繰り返す溶出したRNAの最後の80μL用のce。
- 光度計2000分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して抽出したRNAサンプルを定量化する。次いで-70℃で保存を使用するまで、6ヶ月まで。 （ 注：完全なトータルRNAを維持する良い方法は、cDNAに変換されます）。
7。特異的なTaqManプローブによるワンステップリアルタイムRT-PCRにより抽出したRNA中のノロウイルスの検出
楽器StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems社）。
方法論
- 潜在的なRNaseのコンタミを除去するためにAWAY RNase Aですべての作業面、ピペット、および遠心分離機を拭いて清掃してください。
- ピペットNOV GIとGIIスクリーニングマスターは、 表1によるとミックスします。プライマーとTaqManプローブは、 表2に記載されています。
- 各反応チューブに適したマスターミックスのアリコートを10μL。
- 原液未知のサンプルの5μLを追加します。対応する反応ウェルにRNAを、陰性対照としてDEPC処理水、またはそれぞれGI GII陽性コントロールRNA、。すべての検体をduplicateで実行する必要があります。それぞれ300μg/μLのおよび500μg/μLの濃度の正のコントロールと基準は、疾病管理予防のための国立カリシウイルス研究所センター（CDC）によって提供されていました。
- 10秒のために6000グラムで、反応プレートを遠心します。
- 実験のプロパティ画面で、実行のための実験のタイプを定義して選択します。のTaqMan試薬は試薬の種類、およびその前のPCR増幅読み取りと選択されているように表示されていることを確認します。
- 表3に示す温度プロファイルを用いて15μLの反応を実行します。
- 結果を分析します。
8。従来のRT-PCRおよびシーケンシングを用いたGIとGII月のジェノタイピング
（それが一般的で広く使われている方法ですので、それはこのビデオに記載されていません。）
楽器。アプライドバイオシステムズStepOneとQuantitecテンプレートを使用してStepOnePlusリアルタイムPCRシステム。
方法論
- タイピングの前に、サンプルの遺伝子型（GIまたはGII）は、RT-PCRは、上記のスクリーニングによって決定されます。 GI NOV RNAは、GIのジェノタイピングマスターミックスとGII遺伝子タイピングマスターミックスとGII月RNAを増幅する必要があります。
- ピペットNOV GIとGII遺伝子タイピングマスターは表4に従って混合します。プライマーGI SKF / SKRとG2 SKF / SKRは、 表5に記載されています。
- 0.2mLの反応チューブに適したマスターミックスのアリコートを45μL。
- それぞれ陰性対照チューブにDEPC処理水の5μL、事前スクリーニング、11（GIおよび/またはGII）は、対応する反応チューブへの積極的なRNAの5μLを追加します。
- 表6の熱プロファイルを使用して50μLの反応を実行します。
- PCR産物contaiを送る少なくとも100は、増幅されたカプシド領域のng /μLの精製と配列決定のために会社をマクロゼンする寧。 （9700大セネカハイウェイ。ロックビル、MD 20850およびシークエンシングサンプルあたり10ドル）。
9。代表的な結果
図1は、TaqMan下痢子供から糞便サンプルから抽出したRNAアッセイに使用されるワンステップRT-PCRから代表的な結果を示しています。ポジティブサンプルの閾値サイクル（Ct）がGIIのGIとCt 39未満またはCT 37に等しく設定された。ポジティブコントロール用のCT-値は、それぞれ27およびGIとGIIのためのORF1-ORF2のジャンクションの18未満であることが判明した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2
| マスターミックス | 最終濃度 | 体積（μL） |
| H 2 0 PCR | 2.875 | |
| のQuantiTect RT-PCRマスターミックス | 1X | 6.250 |
| RTミックス | 1X | 0.125 |
| 50μMコグRプライマー | 1μM | 0.250 |
| 50μMコグFプライマー | 1μM | 0.250 |
| 10μMリングプローブ | 1μM | 0.125/0.250 * |
| 10.00 |
各プローブの0.125μLがGIIのテストに使用している間に、各プローブの* 0.250μLは、GIテストのために使用されていました。
スクリーニングGIとGIIについては、 表1を参照。キアゲンのQuantiTectマスターミックス（トルヒーヨら 、2006）7。
| 名 | ジェノグループ | 使用 | 配列（5 'から3'） |
| コグ1R | GI | プライマー | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C |
| コグ1F | GI | プライマー | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| コグ2R | GII | プライマー | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA |
| コグ2F | GII | プライマー | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| リング1A | GI | プローブ | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| リング1B | GI | プローブ | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | GII | プローブ | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
genogroups I、II（影山ら 、のリアルタイム定量的RT-PCRに使用される表2のプライマーおよびプローブオリゴヌクレオチド2003）8。
| 手順 | 温度（°C） | 時間（分） | |
| 1 | 50 | 30:00 | cDNA合成 |
| 2 | 95 | 午前15時 | HotStartのTaqポリメラーゼの活性化 |
| 3 | 95 | 夜12時15分 | |
| 60 | 1時 | 45Xサイクル |
テーブル（3）ワンステップのTaqManリアルタイムRT-PCR用のサーマル·プロファイル（トルヒーヨら 、2006）7。
| マスターミックス | 最終濃度 | 体積（μL） |
| H 2 0 PCR | 29.50 | |
| 5XキアゲンRT-PCRバッファー | 1X | 10.00 |
| 10mMのdNTPミックス | 0.4mMの | 2.00 |
| 酵素ミックス | 2.00 | |
| 40 U /μLRNAsin | 20 U /μL | 0.50 |
| 10μMSKF | 0.1μM | 0.50 |
| 10μMのSKR | 0.1μM | 0.50 |
| 45.00 |
表4。キアゲン遺伝子型GIとGIIのためのワンステップRT-PCRマスターミックス。
| 名 | ジェノグループ | 使用 | 配列（5 'から3'） |
| G1SKF | GI | プライマー | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | プライマー | 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | GII | プライマー | 5'-CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | GII | プライマー | 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
表5。キャプシド領域の領域C（小島ら 、2002）の増幅に用いるプライマー5。
| 手順 | 温度（°C） | 時間（分） | |
| 1 | 60 | 30:00 | cDNA合成 |
| 2 | 96 | 午前15時 | HotStartのTaqポリメラーゼの活性化 |
| 3 | 94 | 夜12時03分0 | |
| 52 | 1時 | 40Xサイクル | |
| 72 | 夜12時30 | ||
| 4 | 72 | 10時 | アニーリング |
表6のTaqManワンステップRT-PCR用のサーマル·プロファイル。
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Discussion
糞便サンプルから核酸を単離するための経済的なインハウス方式を使用して、我々は、キアゲンから商用QIAmpウイルスRNAキットと同じように同じ結果を取得し、一緒に私たちの研究室で開発されたTaqMan RT-PCRで、私たちは月の広い範囲を検出することができますGIとGII遺伝子型に属する品種。領域Cプロトコルの最近の出版物は78％6のタイピング速度を報告した。現代のNOV株の多様性が前の年の間に増加しているので、成功率はテストされている標本の領域Cのプライマーのミスマッチに依存します。それがこうして時間7ターンアラウンドを短縮し、増幅後の製品の処理を排除するようにアッセイは、通常の診断に有用である。別に診断から、このプロトコルはまた、この疾患の公衆衛生上のコントロールに有用であるため、11月の感染症の疫学を明確にするために使用することができます。
スクリーニングを実行するときにRT-PCR、プライマー/プローブセット用のネガティブコントロール（NC）反応が閾値ラインを通過蛍光成長曲線を示すべきではありません。偽陽性は、プライマー/プローブセットのNCの反応のいずれかまたは複数が発生した場合、サンプルの汚染が発生した可能性があり、このようなすべてのケースでは、全体の実行が無効化されたとガイドラインへの厳格な順守を繰り返した。
スクリーニングRT-PCRのためのクロス反応は、CDCによって提供されたGIとGII陽性の標準を使用してテストされています。の交差反応はGIIのRNAおよびその逆のGIプライマーとプローブの間に観察されなかった。スクリーニングRT-PCRの再現性はCT-値が高かったところ陽性コントロールからのRNAの反復実行のために似ています。 NOVのために陽性、20、その後、従来のRT-PCRにより増幅し、ジェノタイピングのために送られ33との間にCT-値を持っていた子供の糞便サンプルからのRNA。 35と38との間のCt値を持つ五陽性検体は、シーケンシャルのために送信されませんでした従来のRT-PCRを使用して後続の増幅のための低すぎることが判明し、ウイルス負荷として清朝。
メソッドは、基本的な機器を使用してローカルの研究室で実装することができないため、現在、ノロウイルスの診断の有用性は限られている。個々の下痢症や流行で、この遅延の診断と治療。キット法は、信頼性と高速でありながら国に材料を輸送するための時間と大量のリソースを必要とします。コストは、手法の3倍です。我々は同様にシンプルで、速く、信頼性の高いNOVの検出のために容易に利用できる、国内の試薬を用いて補助的な方法を示している。この費用対効果の高い方法では、海外で購入した材料への依存、最終的にアクセス可能な診断とchの胃腸炎の一つの最も一般的なウイルスの原因の迅速な治療につながる、その輸送に関する国際イントラ国の規制の問題をバイパスするildren。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、NOVのための標準と制御陽性の親切な贈り物を疾病管理予防のための国立カリシウイルス研究所センター（CDC）に感謝したいと試薬を提供するためのジョンズホプキンス大学公衆衛生学部の研究室です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
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