Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

פיתוח מודל חד צדדי, lesioned מאוס 6-OHDA של מחלת פרקינסון

Published: February 14, 2012 doi: 10.3791/3234
Automatic Translation
1, 1, 1
1Centre for Neurobiology of Stress, Dept Biological Sciences, University of Toronto at Scarborough

Summary

פרוטוקול לביצוע חד צדדיים 6-OHDA נגעים של צרור המוח הקדמי המדיאלי בעכברים מתואר. שיטה זו יש שיעור תמותה נמוך (13.3%) עם 89% מבעלי החיים ששרדו מראה> אובדן 95% של דופמין striatal ו 90.63 ± -4.02% הטיה לכיוון הסיבוב ipsiversive בצד של הנגע.

Abstract

Lesioned באופן חד צדדי 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned במודל חולדה של מחלת הפרקינסון (PD) הוכיח את עצמו רב ערך בקידום הבנתנו את המנגנונים בבסיס הסימפטומים הפרקינסון, שכן היא דומה שינויים המעגלים הגרעינים הבזליים ותרופות שנצפתה הפרקינסון חולים 1-4. עם זאת, השינויים תאית ומולקולרית מדויקים המתרחשים cortico-striatal סינפסות של המסלולים פלט בתוך הסטריאטום, המהווה את אזור הקלט העיקרי של הגרעינים הבזליים להישאר חמקמקה, ואת זה היא ככל הנראה המקום בו ליקויים פתולוגיים שבבסיס הסימפטומים הפרקינסון עולות 3 , 5.

ב PD, בהבנת המנגנונים בבסיס שינויים ניוון המעגלים הבסיסיים הגרעינים הבאה של מסלול הכושי-striatal כבר התקדמו במידה רבה על ידי פיתוח של כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) על עכברים-לבטא חלבונים ניאון ירוק מונע על ידי קידום8, ומאפשר להם להיות למד בבידוד::: ספציפית בין שני המסלולים פלט striatal (eGFP-D2 ו-eGFP A2A מסלול עקיף eGFP-D1 מסלול ישיר) RS. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ישנם שינויים פתולוגיים הפלסטיות הסינפטית הפרקינסון בעכברים 9,10. עם זאת, מחקרים אלה נוצלו עכברים צעירים ומודלים חריפות של פרקינסון. לא ברור אם השינויים המתוארים חולדות מבוגרים עם נגעים יציבים 6-OHDA להתרחש גם במודלים אלה. קבוצות אחרות ניסו ליצור יציבה באופן חד צדדי, lesioned 6-OHDA העכבר מבוגרים מודל של פרקינסון על ידי lesioning צרור המוח הקדמי המדיאלי (MFB), למרבה הצער, שיעור התמותה במחקר זה היה גבוה ביותר, כאשר רק 14% שורדים את הניתוח עבור 21 ימים או יותר 11. מחקרים מאוחרים יותר יצרו התוך nigral נגעים עם שיעור תמותה נמוך גם> אובדן 80% של נוירונים דופאמין, לעומת זאת ביטוי של dyskinesia המושרה L-DOPA 11,12,13,14 היה משתנהבמחקרים אלה. מודל אחר העכבר מבוססת היטב של פ"ד הוא MPTP-lesioned העכבר 15. בעוד המודל הזה הוכיח שימושי בהערכת סוכנים פוטנציאליים neuroprotective של 16, הוא מתאים פחות להבנת מנגנוני שבבסיס הסימפטומים של מחלת הפרקינסון, כמו במודל זה לעיתים קרובות לא מצליח לגרום ליקויים מוטוריים, ומראה השתנות רחב היקף הנגע 17, 18 .

כאן פיתחנו מודל יציב חד צדדית 6-OHDA-lesioned העכבר של PD על ידי הממשל ישירה של 6-OHDA אל MFB, אשר באופן עקבי גורם> אובדן 95% של דופמין striatal (כפי שנמדד על ידי HPLC), כמו גם לייצר התנהגותי חוסר האיזון שנצפה המודל מאופיין גם 6-OHDA-lesioned חד צדדית של עכברוש פ"ד. מודל זה של העכבר החדש שפותח פ"ד יוכיח כלי חשוב בהבנת המנגנונים בבסיס הדור של סימפטומים הפרקינסון.

Protocol

1. דיור והכנת עכברים

  1. לשמור על מושבה של כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) מונע על העכברים הטרנסגניים 8 (מוטנטי עכבר האזורית מרכז (MMRRC) FVB ב 12:12 מחזור אור חשוך שעות עם גישה חופשית למזון ומים. עכברים אלו לעכברים FVB טהור, אין צורך לחצות את העכברים עם זן אחר, או לצרכי רביה, או כדי להבטיח את ההצלחה של הליך 6-OHDA הנגע.
  2. על מנת ליצור מודל פרקינסון, עכברים בוגרים בגילאי 31-42 יום לאחר הלידה (P31-42) נדרשים עבור ניתוחים 6-OHDA-הנגע ולא העמדת פנים.
  3. כדי להקטין את הסיכון לזיהום, לנהל Baytril (אנטיביוטיקה) במי השתייה במשך 24 שעות לפני הניתוח.

2. הכנת תרופות לניתוח

Premedication של desipramine ו pargyline ניתנת בדרך כלל מכרסמים לפני הזרקת hydroxydopamine-6 ​​(6-OHDA) כדי להגביר את הסלקטיביות ו EFFicacy של 6-OHDA המושרה נגעים. מעכב נוראדרנלין / 5HT ספיגת, desipramine יורדת 6-OHDA הנגרמת נוראדרנלין 5HT דלדול 22, בעוד מעכבי מונואמין אוקסידאז, pargyline משפר את הרגישות של מסופי דופאמין ל 6-OHDA, על ידי הקטנת פירוק extrasynaptic של 6-hydroxydopamine 31.

  1. Premedication (hydrochloride desipramine (HCL) ו pargyline HCl) ניתן להכין כמויות גדולות ומאוחסנים ב -80 ° C עד השימוש. שוקלים את הכמות המתאימה של desipramine HCl לספק כל עכבר עם 25 מ"ג / ק"ג עבור מספר בעלי החיים יקבלו ניתוח באותו יום. משקל נמוך של העכבר עושה את זה מאתגר כדי לספק כמויות קטנות באופן מדויק, ולכן להכין hydrochloride desipramine בריכוז של 2.5 מ"ג / מ"ל ​​ו מנוהל על בעלי חיים על 10 מ"ל / ק"ג. המשקל של מרכיב מלח של המתחם יש היוו כך ריכוז נכונה מושגת. תיקון עבור משקל שלHCl מלח desipramine hydrochloride: משקל מולקולרי (MW) של desipramine HCl: 302.84 MW HCl: 36.46 מגה וואט של בסיס חינם: 266.38 גורם התיקון: 302.84 / 266.38 = 1.137 עבור 10 מ"ל של פתרון: x = 2.5mg/ml desipramine 10.0ml X תיקון גורם 2.5mg/ml = x 10.0ml x = 1.137 28.43mg של hydrochloride desipramine
  2. שוקלים את הכמות המתאימה של pargyline HCl לספק כל עכבר עם 5mg/kg מספר בעלי חיים שקיבלו ניתוח באותו יום. לתקן רכיב מלח של המתחם כפי שתואר לעיל. משקל נמוך של העכבר עושה את זה מאתגר כדי לספק כמויות קטנות באופן מדויק, ולכן להכין hydrochloride pargyline בריכוז של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ולנהל את החיה ב 10 מ"ל / ק"ג.
    תקן עבור משקל של מלח HCl ב hydrochloride pargyline:
    מגה וואט של pargyline HCl: 195.69 MW HCl: 36.46
    מגה וואט של בסיס חינם: 159.23 גורם התיקון: 195.69 / 159.23 = 1.229
    עבור 10 מ"ל של תמיסת לשקול את: <br /> = 0.5 מ"ג / מ"ל ​​pargyline x 10.0 x מ"ל גורם התיקון
    = 0.5 מ"ג / מ"ל ​​x 10.0 x 1.229 מ"ל
    = 6.15mg של hydrochloride pargyline
  3. שלב desipramine HCl 28.43mg ו 6.15mg pargyline HCl לתוך כוס 10 מ"ל סיימה גליל, ולהוסיף 8 מ"ל תמיסת מלח סטרילית (0.9%). מערבולת חום עד 45 מעלות צלזיוס עד לקבלת עיסה נמס. ה-pH של התמיסה יהיה כעת סביב 3, אשר אם מנוהל על עכברים יגרום אי נוחות לאחר הניתוח סיבוכים מעורבים בתפקוד מערכת השתן ומערכת העיכול. להוסיף טיפות NaOH (1M) עד pH הוא 7.4. למעלה עד נפח 10 מ"ל עם מי מלח סטרילית (0.9%), ו - וורטקס. , לייבל תאריך ההקפאה ב ~ 80 ° C. נתון זה pargyline HCl לא מסיסים מלוחים בטמפרטורת החדר, במשך כל תקופת כירורגית, לאחסן את התערובת premedication באמבט מים מחומם ל 37 מעלות צלזיוס בחדר הניתוח.
  4. פתרונות של 6-OHDA חייב להיות מוכן מיד לפני ניתוחים. הרכב בו לפרק 6-OHDA hydrobromide (6-OHDA.Br) הפתרון הוא מי מלח סטרילית (0.9%) המכיל פתרון חומצה אסקורבית (0.2%). חומצה אסקורבית יש צורך לייצב 6-OHDA.Br, שכן הוא מונע חמצון של 6-OHDA.Br לטופס לא פעיל. לשקול את 0.2 גרם של חומצה אסקורבית, ולאחר מכן להוסיף את L 1 ריקה סיימה גליל, מלמעלה עד ל 1 עם תמיסת מלח סטרילית (0.9%) ומערבבים. , תאריך תווית, וחנות ב ~ 80 ° C עד נדרש.
  5. שוקלים את הכמות המתאימה של 6-OHDA.HBr לעשות 15.0 מ"ג / מ"ל ​​הפתרון לספק כל עכבר עם 3.0 מיקרוגרם. מאז 6-OHDA.Br הוא אור וחום רגיש להימנע מחשיפה לאור, ומניחים על הקרח לפני השקילה.
    תקן עבור משקל של מלח HBr ב 6-OHDA.HBr:
    מגה וואט של 6-OHDA.HBr: 250.09 MW HBr: 79.9 מגה וואט של בסיס חינם: 170.19
    גורם התיקון: 250.09 / 170.19 = 1.47
    עבור 0.5 מ"ל של תמיסת לשקול את:
    = 15.0 מ"ג / מ"ל ​​6-OHDA x 0.5 x מ"ל גורם התיקון
    = 15.0 מ"ג / מ"ל ​​6-OHDA x 0.5 x 1.47 מ"ל
    = 11.03 מ"ג 6-OHDA.HBr
  6. עבור בלוף המופעלים בעלי חיים, מהווים נפח שווה ערך של הרכב (מי מלח סטרילית (0.9%), חומצה אסקורבית 0.02% pH 7.4) לזו של 6-OHDA-lesioned בעלי חיים יקבלו, ומכניסים צינור 1.0 מ"ל סטרילית עטופה על תווית נייר, פח המקום מיד על הקרח עד לשימוש.

3. הקמת מנגנון כירורגית

כלים כירורגיים יש לעקר שימוש לא לפני החיטויo ניתוח. בין כל פעולה, כלים כירורגיים יש לעקר באתנול 95% ואחריה חימום ל 250 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. כל הניסויים יש לבצע בהתאם להנחיות של טיפול הוועדות המתאימות בבעלי חיים של מוסד המדינה המזוהה.

  1. יש לנקות את כל המשטחים וציוד עם אלכוהול איזופרופיל לפני הקמת הציוד. ללבוש כפפות סטריליות במהלך הטיפול בו בציוד כירורגי נקי.
  2. הגדרת בכלוב העכבר התאוששות עם מגבות נייר בבסיס. מקום תחת מנורת חימום או על גבי משטח לוהט.
  3. הגדרת עגלת הרדמה, להבטיח כי יבוא חמצן מחובר פתוח, מאגר isoflurane מלא לחלוטין. הגדר את זרימת החמצן L 1 / דקה, ו isoflurane ל 2-4%. באופן אידיאלי יהיו שתי יציאות תזרים של מכונת הרדמה כדי לספק את התערובת חמצן isoflurane לתא אינדוקציה, כמו גם עבור התחזוקה בעוד החיה במסגרת stereotaxic.
  4. שיתוףrrect הרכבה של המנגנון עירוי חיונית להבטחת נגעים מוצלחים, כמו אוויר לכוד או מחטים חסומים מקטין את עוצמת הקול של 6-OHDA חדורים באתר הנגע. להרכיב את מכשיר עירוי כפי שעולה באיור 1. 1 חוט מתכת RN אגוז על צד אחד של צינורות הצצה (RN דחיסה KIT (מתאים 1/16 אינץ 'ה)), ואחריה כוס הצצה טבעת חזוק, אז הקנונית PFA טבעת חזוק. אוריינט מתנוצץ בחישוקי המתכת, כך חרוט על הקנונית PFA טבעת חזוק יגלוש לתוך החלק ההזדווגות של כוס הצצה כפת מתכת. המקום לתוך כפול קטן רכזת RN מצמד (# 1), על מנת להבטיח את הקשר הוא הדוק. בצד השני של כפול קטן רכזת RN מצמד להכניס את מחט מד 33 הזרקה. חוט המחט דרך אחד אגוזים מתכת RN והדק. להבטיח את המחט 33 מד הוא בזווית של 180 ° עד כפול קטן רכזת RN מצמד (# 1). בצד השני של החוט צינורות, הצצה אחת אגוזים מתכת RN ואחריו טבעת חזוק הצצה, אז כפת מתכת PFA. הכנס אגוז מתכתND כפת מתכת הרכבה לתוך 2 כפול קטן רכזת RN מצמד ולהדק את הקשר. בצד השני של 2 כפול קטן RN רכזת מצמד (# 2) להכניס את luer למתאם קטן RN הרכזת (מתאם luer), ומהדקים את החיבור.
  5. המנגנון הבא עירוי יש דרוך (ראה איור 1). מלאו את μl 250 ו -1.0 מזרקים μl המילטון עם מים סטריליים, על מנת להבטיח שאין בועות אוויר. צרף את המזרק 250 μl למתאם luer ולירידה של הבוכנה של המזרק 250 μl כך המים משתחררת באמצעות מחט 33 מד זריקה בצד השני של הצינור. להמשיך לדחוף מים דרך המערכת תוך משיכת מזרק 250 μl מתוך מתאם luer, משאיר מים קטן חרוז בקצה מתאם luer. לדכא את הבוכנה של המזרק 1.0 μl עד המים חרוז קטן נפלט. בזהירות להכניס את המזרק 1.0 μl למתאם luer, כדי להיות בטוח שהמים חרוז על המזרק 1.0 μl מתחבר עם מים חרוז הנוכחית on מתאם luer, לחלוטין להכניס את המזרק 1.0 μl למתאם luer. ודא שאין בועות קטנות מצמד כפול רכזת RN.
  6. כעת, המערכת ערוכה, מנגנון זלוף יכול להיות מאובטח על מסגרת stereotaxic ואת משאבת עירוי. הצמד מצמד קטן כפול RN רכזת עם מחט 33 מד הזרקת מחוברת זרוע מניפולטור של המסגרת stereotaxic, ואז להדק את המזרק 1.0 μl למשאבה זלוף, כך שכאשר המשאבה זלוף מתחיל את המזרק הוא נלחץ מהדק ולא יכול לזוז. תוכנית משאבת עירוי כדי לאפשר קצב עירוי של 0.1 μl / דקה.

4. פגיעה חד צדדית 6-OHDA ניתוח

  1. חצי שעה לפני הפעילות, לשקול כל בעל חיים ולהקליט במשקל. מערכתית לניהול hydrochloride desipramine (2.5 מ"ג / מ"ל, סיגמא אולדריץ') ו hydrochloride pargyline (0.5 מ"ג / מ"ל, סיגמא אולדריץ') (0.9% תמיסת מלח סטרילית, pH 7.4) בשעה 10 מ"ל / ק"ג בהזרקה תוך הצפק (IP) על העכבר 1באמצעות מחט 27g מצורף מזרק 1ml. לדוגמה, עכבר 30.0 גרם תקבל 300 μl של premedication. לחמם את הדיסק חימום ומקום זה תחת שן חותכת את האוזן בר. דיסק חימום יסייע לשמור על טמפרטורה של חיים במהלך הניתוח ולשמור חיה בגובה אידיאלי כדי להתאים את האוזן שן חותכת סורגי מסגרת stereotaxic.
  2. רבע שעה לאחר מתן desipramine HCl פתרון pargyline HCl, הצב את העכבר סגור הרדמה בחדר, ואת anesthetise חיים באמצעות שאיפת isoflurane (2-3% ב O 2). חיה היא anesthetised מספיק כאשר לא מראה קמצוץ בתגובה רגלו האחורית ולא רפלקס מצמוץ.
  3. לגלח את הראש של העכבר, ולהחיל משכך כאבים מקומי לידוקאין ישירות על העור בעזרת צמר גפן. חמש דקות לאחר יישום לידוקאין, לחטא את הראש של החיה עם פתרון בבטאדין.
  4. מניחים את חיה בתוך מסגרת stereotaxic מותאם עכברים. ראשית למקם את בעל החיים לתוך ברים שן חותכת (הגדרה חותכת בר: -3.0 עד 2.0 מ"מ) עם מסכת ההרדמה הונחה על פניו של בעל החיים. להתאים את זרימת החמצן L 1 / דקה, ו isoflurane ל 1.5-2%. בר שן חותכת צריך להיות ברמה יחסית כוסות אוזניים כאלה, כי החלק העליון של הגולגולת הוא ברמה. הכנס את האוזן כוסות (5.0 מ"מ קוטר). הגביעים אוזניים הוכנסו תקין כאשר ראש שטוח לחלוטין, ולא ניתן להעביר בכל כיוון.
  5. חותכים לאורך קו האמצע של העור על הראש של העכבר באמצעות סכין אזמל, וגם לחזור בו העור. לייבש את פני השטח של הגולגולת בעזרת גזה.
  6. לדחוף את הבוכנה של המזרק 1.0 μl, ומניחים את המחט 33 הזרקה לתוך צינור מד 1 מ"ל מכוסה נייר אלומיניום המכיל 6-OHDA פתרון (15 מ"ג / מ"ל). לסגת באיטיות על הבוכנה של מזרק 1.0 μl תוך שמירה על 33 הזרקת מחט מד שקוע בפתרון 6-OHDA (15 מ"ג / מ"ל).
  7. יצירת חתך 1 ס"מ לאורך אמצעשורה של הגולגולת. לקדם את קצה מחט הזריקה כלפי גבחת, לוותר על כמות קטנה של פתרון 6-OHDA מ 33 מחט הזריקה מד כדי ליצור חרוז קטן. לאט לאט להוריד את מחט הזריקה עצה כדי גבחת, כאשר נגיעות חרוז גבחת להפסיק לקדם את קצה המחט ולהקליט את הקואורדינטות האלה. לחזור בו מחט הזריקה 2 מ"מ לכיוון הגב, וקדימה תפר sagittal לכיוון הזנב מקורי לקראת למבדה. לקדם כמות קטנה של פתרון 6-OHDA מ 33 מחט הזריקה מד כדי ליצור חרוז קטן. לאט לאט להוריד את מחט הזריקה עצה כדי למבדה, כאשר הקשר חרוז Lambda להפסיק לקדם את קצה המחט ולהקליט את הקואורדינטות האלה. לרוחב המדיאלי (ML), וכן הגב הגחון (DV) קואורדינטות צריך להיות זהה עבור גבחת ו למבדה, אם הם לא, להתאים את סרגל שן חותכת בהתאם עבור קואורדינטות AP, ואת הברים אוזן קואורדינטות מ"ל. להזיז את המחט אל הקואורדינטות AP: -1.2 מ"מ, ML: -1.1 מ"מ יחסית Bregמא פי אטלס עכבר המוח Stereotaxic הקואורדינטות 25. חוזר בי את המחט, ואת בר חור בגולגולת באמצעות מחט מד 25.
  8. להחזיר את מחט הזריקה לאמור לעיל הקואורדינטות, והכנס את המחט אל DV:-5mm. להחדיר 0.2 μl של 6-OHDA או הרכב באופן חד צדדי לצרור המוח הקדמי החציוני בשיעור של 0.1 μl / דקה (3 סך מיקרוגרם). עם סיום הממשל של 6-OHDA או ברכב, להשאיר את המחט במקום במשך חמש דקות נוספות כדי לאפשר דיפוזיה מן הזריקה.
  9. לאט לאט חוזר בי את המחט.
  10. לסגור את החתך בעור הקרקפת באמצעות שלושה תפרים, ולספק 1ml של תמיסת רינגר לקטט של תת עורית (SC).
  11. הסר את החיה ממסגרת stereotaxic, ומכניסים לכלוב התאוששות עד התודעה מחדש.

5. לאחר ניתוח לטיפול 6-OHDA-lesioned בעלי חיים

  1. מקום חיות בכלובים (3 עכברים / קייג') ולאפשר גישה חופשית למזון sugareמים D (10 mM). לספק נוטרה ג'ל ו KMR (תחליף חלב חתלתול) במיכלים האוכל על הרצפה של הכלוב כדי לעורר תיאבון תנועתיות מערכת העיכול.
  2. בדוק עכברים יומיים לאחר הניתוח במשך 2 שבועות 24. על הבדיקה כל תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם על הערנות של בעל החיים על ידי הערכת יכולתה של חיה לנוע בכלוב. מזון וצריכת מים מהתקופה התצפית האחרונה, כמו גם נוכחות ועקביות של צואה צריך להיות גם ציין. הסיבוך השכיח שלאחר הניתוח היא התייבשות זה בא לידי ביטוי על ידי הכחשה איטי של קורט העור הבאה העור. אם זה הוא ציין לספק 1ml של תמיסת לקטט רינגר של SC שבוע 1 או עד לשיפור בתסמינים. במקרה של בעלי חיים ממין זכר, איברי המין צריך לשמור בקפידה על צניחה של הפין מזוהה על ידי אודם של הפין. במקרה זה חלים ג'ל mucol לפין של בעל החיים הנגוע, ולספק 1 מ"ל של תמיסת לקטט רינגר של SC שבוע 1או עד לשיפור בתסמינים.
  3. לשקול בעלי חיים מדי יום כדי לעקוב אחר שינויים במשקל הגוף.
  4. במקרה שבו הזרקת ה-IP גרם דמעה בקצה מערכת העיכול, דלקת הבטן עלול לגרום. לכן, להעריך את prsence של זיהום של הבטן, ניכר על ידי בטן נפוחה נפוחה. לטפל על ידי מתן Baytril במים drining עבור 3-4 ימים או עד לשיפור בתסמינים.

6. הפארקינסוני הערכה

כדי להעריך את היקף הפגיעה, הערכה התנהגותי נערך 14-21 ימים לאחר הניתוח 6-OHDA-הנגע, כאשר כמות דלדול הדופמין היא מקסימלית ויציבות 26.

  1. לאחר הזרקת ה-IP של מי מלח מ"ל / גרם 0.01 סטרילי 0.9%, עכברים במקום במיכלים זכוכית (11 ס"מ X 9.5 ס"מ) להקליט את פעילותם באמצעות מצלמת הווידיאו (CG9, Sanyo).
  2. צפייה בסרטון, לספור את מספר סיבובים שלמים 360 ° שנעשו הן ipsiversive ו contraversive ביחס הנגע כיוון.
  3. ככל הטיה כלפי סיבובים ipsiversive, בעלי חיים הפארקינסוני יותר, וכך לחשב את שיעור סיבובים ipsiversive כאחוז נטו (contraversive ו ipsiversive) התנהגות הסיבוב.

7. קביעת תוכן דופמין striatal ידי HPLC

  1. לפחות 21 ימים לאחר הניתוח 6-OHDA הנגע, ועם השלמת המחקרים ההתנהגותיים, להקריב את העכברים על ידי מינון יתר של הרדמה, ובזהירות להסיר את המוח. לשמור על פרוסה אחת של הסטריאטום (230 מיקרומטר) מחצי הכדור כל עכבר זה, ולהצמיד ההקפאה מיד לאחר חתך וחנות ב -80 ° C עד הכנת דוגמאות striatal.
  2. מאגר מדגם HPLC (0.1 מ 'PCA עם 2 מ"מ גלוטתיון) מונע דופמין שחולצו מן דגימות striatal של פירוק.
    עבור 100 מ"ל של חיץ מדגם:
    = 100 מ"ל HPLC כיתה H 2 O
    = 0.862 מ"ל PCA (70%) (Sigmא)
    = 61.5 מ"ג גלוטתיון (מופחת)
    למדוד את כיתה HPLC H 2 O, מוסיפים את PCA, לפרק את גלוטתיון בתמיסה, לערבב היטב ולסנן. מאגר המדגם ניתן לאחסן 4 ° C עד חודש 1.
  3. להפשיר את פרוסות striatal על הקרח, אז homogenise במאגר מדגם 200 μl באמצעות משבש תא קולי (פישר סוניק, ארה"ב). לשמור על דגימות קרח בכל עת homogenise כל מדגם שלוש פעמים במשך 10 שניות כל אחד להבטיח כי דגימות מותר להתקרר בין תקופות homogenization.
  4. להניח בצד 20 μl של מדגם זה הומוגני (חנות ב -80 ° C) עבור assay חלבון.
  5. צנטריפוגות מדגמים (20,800 XG, 20 דק '(4 ° C, Eppendorf 58 - 04R, ארה"ב)), ולאחר מכן להסיר את supernatant ולסנן דרך 0.2 מיקרומטר PVDF קרום (מל חתול #: 1935-28143-310) ומקפיאים ב -80 ° C עד ניתוח HPLC. לשמור את החלבון גלולה כמו גיבוי עבור assay חלבון.
  6. הכנת שלב הנייד HPLC לרוץ through טור HPLC.
    עבור L 1 של שלב נייד:
    60 מ"מ לאא 2 PO 4. H 2 O (monobasic) = 8.27 גרם
    30 מ"מ חומצה ציטרית = 5.7 גרם
    0.13 חומצה ethylenediaminetetraacetic מ"מ (EDTA) הרכב: מלח מייבשים = 48 מ"ג
    0.16 mM dodecyl נתרן סולפט (SDS) = 45 מ"ג
    850 מ"ל מים כיתה HPLC (Caledon, חתול #: 8801-7)
    15% V / V אצטוניטריל-190 (pH 3.35) = 150 מ"ל HPLC כיתה (Caledon, חתול #: 1401-7)
    ~ 2 μl של 10 מ 'NaOH (ב HPLC כיתה H2O)
    ריאגנטים כל צריך להיות ≥ 99.0% טהור של HPLC כיתה בכל מקום אפשרי. מים אצטוניטריל חייב להיות בכיתה HPLC. בשלב נייד יש להשתמש תוך שבוע הכנה. הקדשנו, כלי זכוכית נקי ומערבבים ברים אך ורק להכנת השלב סלולרי (1 כוס L גליל מדידה לפחות 2 1 צלוחיות זכוכית L). לפני הכנת שלב הנייד יש שתי צלוחיות נקיים 1 L-מוכן, 1 להפוך את פתרון אחד להעביר אותו במהלך סינון degassing. אפשר לשלב הנייד להפיץ באמצעות HPLC לילה ולבדוק כי הבסיס הוא שטוח לפני השימוש.
  7. למדוד את 700 מ"ל מים HPLC כיתה לגליל כוס מדידה לפרק את לאא 2 PO 4. H 2 O, חומצה ציטרית, EDTA ו SDS בו. למעלה עד 850 מ"ל מים.
  8. להתאים את ה-pH ל 3.35 באמצעות 10 מ 'NaOH, ולאחר מכן להוסיף אצטוניטריל ומערבבים את הפתרון באמצעות שורת התרגשות מצופה טפלון.
  9. שים פס מוסיפים את הבקבוק 2 נקי, ריק 1 L ו ואקום לסנן את השלב הנייד לתוכו דרך 0.22 מיקרומטר HVLP Millipore מסנן: (CAT #: SLGP033RS). להרטיב את המסנן 85:15 H 2 O / ACN לפני סינון. לאחר סלולרי מסונן באופן מלא, דגה בשלב הנייד על ידי ערבוב אותו תחת ואקום דקות לפחות 10.
  10. הכן את הסטנדרטים נגדו ריכוז הדופמין של דגימות striatal יהיה למדוד. התקנים מנוהלים באמצעות HPLC בתחילת וסיום של כל אצווה של דגימות striatal. 1מ"ג / מ"ל ​​פתרון מלאי של דופמין ניתן להכין מראש ולאחסן 20 aliquots μl ב -80 ° C. כדי להכין את הפתרון המניות לפזר 5 מ"ג דופמין במאגר מ"ל 5 המדגם (ראה לעיל) ומערבבים היטב. מתחילים בהכנת תקנים על ידי לקיחת 5 μl של 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות, הוספתו למאגר 2.5 מדגם מ"ל ו לערבב אותו היטב כדי להשיג 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון דופמין.
  11. ארבעה תקנים מנוהלים באמצעות HPLC לייצר עקומת הריכוז. עבור דופמין הריכוזים הם: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, ו - 12.5 ng / mL. על מנת ליצור את ארבעת ריכוזי הדופאמין לקחת 10 μl של פתרון 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​דופמין ערוכים 7.10). ולהוסיף אותו μl 190 מתוך חוצץ מדגם לתת לך 100 ng / ml פתרון דופמין. בעקבות זאת לבצע דילול 01:01 הסידורי של 100 ng / ml עם פתרון דופמין חיץ המדגם. פשוט לוקחים 100 μl של 100 ng / ml דופמין ולהוסיף 100 μl של חיץ מדגם ומערבבים לייצר 50 ng / ml דופאמין, ואז לקחת 100μl של דופמין ng / ml 50 ולהוסיף 100 μl של חיץ מדגם ומערבבים לייצר 25 ng / ml דופמין וכן הלאה.
  12. כדי להכין את המערכת HPLC, (ווטרס 1525μ משאבת בינארי, 717plus autosampler, סימטריה C-18 פעולות של שלב עמודה (15 ס"מ X 4.6 מ"מ id, 5 מיקרומטר גודל החלקיקים) (30 ° C), גלאי אלקטרוכימי (ESA Coulochem III) מצויד עם תא כפול אלקטרודה אנליטית (ESA 5011A) ונשלט על ידי תוכנת Breeze (ווטרס)) 1 טיהור המערכת עם השלב הנייד על ידי בחירת פרוטוקול טיהור בתוכנת המחשב או לפי הוראות היצרן. חילופי זה כל פתרון הקודם במערכת HPLC עם השלב סלולרי חדש.
  13. הגדר את פוטנציאל אלקטרוכימי על mV 400 ו -300 mV עבור אלקטרודות הראשון והשני בהתאמה. בעקבות זאת, לאזן את המערכת על ידי הפעלת אותו לפחות 2 שעות הלילה באופן אידיאלי עם השלב הנייד בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה. במהלך איזון התאים צריך להיות מופעל מחדש הבסיסading פיקוח, כאשר הקריאה הופכת יציבה מערכת מוכנה לשימוש. במשך השעה הראשונה של איזון ולתת את השלב נייד היציאות מערכת להיכנס מיכל waster, אחרי זה אתה יכול להרשות את השלב הנייד לזרום בחזרה באמצעות מערכת HPLC על ידי הצבת צינור מוצא את הבקבוק בשלב הנייד.
  14. להפשיר דגימות striatal על הקרח, ואז מזריקים 20 μl של תקן זה דופמין ואחריו μl 2 20 x המדגם כל עוד μl 20 של תקן זה דופמין במערכת HPLC equilibrated עם קצב זרימת בשלב הנייד ב 1 מ"ל / דקה.
  15. להשתמש בתוכנה מערכת HPLC לנתח את אזור הפסגות דופאמין המיוצר על פי אמות המידה דגימות. השוואה בין שטח של פסגות הדופמין הנמצאים דגימות striatal על עקומת דופמין תקן ריכוז יזהה את כמות הדופמין הנוכחי μl 20 של מדגם זה striatal. מדד זה נתון עד היום למצוא את הדופמין סך פרוסת striatal כולו.
  16. Perform assay חלבון סטנדרטי μl 20 של homogenate striatal שאתה לבטלו 7.4). זה יהיה למדוד את כמות החלבון כיום בדגימות striatal ב מ"ג / מ"ל. מכאן לחשב את כמות הדופמין דגימות striatal כערך ng / mg המאפשר לך להשוות ריכוזי דופאמין בין ההמיספרות ובין עכברים.

8. נציג תוצאות

חמש עשרה עד עשרים ואחד יום לאחר הניתוח 6-OHDA-הנגע, כאשר כמות מוות של תאים הנגרם על ידי עצבים הגיע completion26, מדידה של 360 מעלות סיבוב ספונטני לאחר מתן תמיסת מלח (IP) 28 ניתן להשתמש כדי להעריך את ההצלחה של 6 -OHDA-lesioned (איור 2). שיטה זו של הערכת התנהגותי הוא פשוט ומהיר, ומונע תופעות הייזום פוטנציאליים הנגרמת על ידי סוכני דופאמין כגון אמפטמין או אתגרים הידרוכלורידי. יתר על כן, ההערכה היא סיבוב ספונטני predi טוב יותרctor של בעלי חיים עם דלדול <דופמין 95% לעומת הבדיקה כפה forelimb המיקום 27. באמצעות התאמת רמות הדופאמין striatal מדגימות striatal (מוכן עם השלמת מחקרים התנהגותיים באמצעות HPLC) עם אחוז סיבובים ipsiversive ספונטניות של כל חיה, מצאנו כי בעלי החיים אשר התערוכה 70% או יותר סיבובים ipsiversive כלפי הנגע 6-OHDA איבדו> דופמין striatal 95% (איור 3) 27. לאחר 6-OHDA המושרה נגעים חלקית (59.44 ± 17.20) (איור 3) צרור של המוח הקדמי המדיאלי, לא היתה הטיה סיבובית בין הצדדים ipsiversive לעומת contraversive כאשר מודדים סיבובים ספונטניות (40.91 ± 8.01) (איור 2). לכן, כפי שכבר נמצא בעקבות הממשל 6-OHDA כדי MFB בחולדות, אפשר לגרום לאובדן העמוק של דופאמין הכושי-striatal נוירונים, מינהל מלוחים (IP) הוא שיטה מדויקת לסינון היקף 6-OHהתובע פגיעה בבעלי חיים אלה.

איור 1

באיור 1. תרשים סכמטי להפגין הרכבה של המנגנון מחט הזריקה של 6-OHDA-הנגע ניתוחים.

איור 2

איור 2. הערכת התנהגות הסיבוב של העמדת פנים המופעל ו 6-OHDA עכברים lesioned. סיבובים ספונטניים בעכברים דמה המופעלים ו-6-OHDA lesioned. הנתונים מוצגים כפי סיבובים אחוז ממוצע ipsiversive ± SEM, שם נטו contraversive סיבובים ו ipsiversive הם 100%. ברים פתוחים: העמדת פנים המופעלים בעלי חיים, ברים גריי: 6-OHDA-lesioned בעלי חיים עם אובדן> דופמין 95%, פסים שחורים: בעלי חיים שעברו ניתוח 6-OHDA-הנגע שהיו lesioned חלקית. *** P <0.001 לעומת דמה המופעלים בעלי חיים. בכיוון אחד ANOVA ואחריו מבחן השוואה נפוצה של דאן (ים חזיר המופעל: n = 17; 6-OHDA-lesioned (> 95%): n = 23; חלקית 6-OHDA-הנגע: n = 3).

איור 3

איור 3. הערכת רמות הדופאמין striatal ב דמה המופעל ו 6-OHDA עכברים lesioned באמצעות HPLC. תוכן דופמין Striatal נקבע בחצי הכדור שהופעלה unoperated של זיוף ו-6-OHDA lesioned בעלי חיים. הנתונים מוצגים באחוזים ממוצע ± SEM של רמות הדופאמין striatal בסטריאטום unoperated. ברים פתוחים: העמדת פנים המופעלים בעלי חיים, ברים גריי: 6-OHDA-lesioned בעלי חיים עם אובדן> דופמין 95%, פסים שחורים: בעלי חיים שעברו ניתוח 6-OHDA-הנגע שהיו lesioned חלקית. *** P <0.001, ** P <0.01 לעומת דמה המופעלים בעלי חיים. בכיוון אחד ANOVA ואחריו מבחן השוואה נפוצה של דאן (דמה המופעל: n = 17, 6-OHDA-lesioned (> 95%): n = 23, חלקי 6-OHDA-הנגע: n = 3).

eak ">

איור 4

איור 4. הערכת immunoreactivity hydroxylase טירוזין ב SNC ב דמה המופעל ו 6-OHDA עכברים lesioned. כסמן של אובדן התא הדופמין nigra substantia Pars compacta (SNC), אובדן hydroxylase טירוזין (ה ') immunohistochemisty חיובי בחצי הכדור שהופעלה unoperated של זיוף ו-6-OHDA lesioned בעלי חיים נקבע, כמתואר Thiele et al. בעיתונות. הנתונים מוצגים באחוזים ממוצע ± SEM של תאים החיוביים ה בסטריאטום unoperated. ברים פתוחים: העמדת פנים המופעלים בעלי חיים, ברים גריי: 6-OHDA-lesioned בעלי חיים עם אובדן> דופמין 95%, פסים שחורים: בעלי חיים שעברו ניתוח 6-OHDA-הנגע שהיו lesioned חלקית. *** P <0.001, ** P <0.01 לעומת דמה המופעלים בעלי חיים. בכיוון אחד ANOVA ואחריו compa מרובים של דאןRison הבדיקה (דמה המופעל: n = 17, 6-OHDA-lesioned (> 95%): n = 23, חלקי 6-OHDA-הנגע: n = 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור של מודל יציב 6-OHDA-lesioned חד צדדית העכבר של מחלת פרקינסון, שהיא לשחזור ביותר, עם שיעור הצלחה גבוה הנגע, ואת שיעור תמותה נמוך. ההצלחה של הניתוח 6-OHDA הנגע ניתן לאמוד בקלות עם> סיבובים ipsiversive 70% המעידים על דלדול> דופמין 95% ב הסטריאטום lesioned 27 על ידי מדידה של התנהגות הסיבוב ספונטנית. כימות רמות הדופאמין striatal הוא המדידה המדויקת ביותר של היקף דלדול הדופמין striatal לעומת quantificiation של ה-חיוביות מספר תאים ב nigra substantia Pars compacta, כפי שהוא מספק מדידה ישירה של רמות הדופאמין striatal 28. בהתחשב בכך פרוטוקול זה מתרבה באתר ההזרקה (MFB) ואורך של התפתחות הנגע (21 יום) של המודל מאופיין גם 6-OHDA-lesioned חד צדדית של עכברוש 1,4 מחלת פרקינסון, ניתן להניח העל מודל זה עכבר, כמו מודל עכברים, מסכם את השינויים פרמקולוגיה החשמלית במוח אצל חולים עם מחלת פרקינסון. לכן, שיטה זו מספקת אמצעי יצירת מודל סימפטום של מחלת פרקינסון בעכברים הטרנסגניים. בהתחשב בכך העכברים הטרנסגניים הם כלים רבי עוצמה עבור מאפשר לנו להבין את התפקיד של מולקולות חלבונים in vivo ב המולקולרית, דרך רמת רקמות הסלולר כולו, שילוב של שתי הטכניקות הללו יהיה שימושי מאוד נוסף המגדירה את המנגנונים המולקולריים ו הסלולר הדור הבסיסי של הסימפטומים של מחלת פרקינסון.

בני צ'נצ'י תיאר בעבר שיטה דומה ליצירת העכבר חד צדדית 6-OHDA-lesioned של מחלת פרקינסון, לעומת זאת, זה היה קשור עם שיעור תמותה גבוה, עם% 14 בלבד של בעלי חיים ששרדו יותר מ 21 ימים ניתוח שלאחר הזריקה הבאה של 6 - OHDA אל MFB 11. ישנם מספר poss הסברים סים של חוסר התמותה בפרוטוקול המתואר כאן. ראשית, stereotaxic הקואורדינטות שנבחרו בפרוטוקול זה לאפשר את המזרק על מנת להימנע לחלוטין ההיפותלמוס. מאז ההיפותלמוס העכבר הוא כל כך קטן, כל נזק למבנה זה משפיע על אכילה ושתייה מרכזי של העכבר, גורמת חיה לרדת במשקל להתייבש, ובסופו של דבר למות. שנית, הפרוטוקול המתואר כאן, ריכוז זהה של 6-OHDA (3mg) נוצל כמו בתחקיר של Lundblad ועמיתיו 11, לעומת זאת, זה היה מנוהל בהיקף קטן יותר (בהשוואה ל 1ml 0.2ml) עם עירוי איטי יותר שיעור (0.1ml/min לעומת 0.5ml/min). קצב עירוי קטן נפח איטי להבטיח פגיעה מזערית במבנים הסמוכים MFB. לבסוף בקוטר של מחט הזריקה הוא קטן יותר באופן משמעותי (0.33 לעומת 50 מ"מ), אשר יהיה למזער נזקים למבנה המוח כמו מחט נוסע ventrally דרך המוח.

"ontent> בני צ'נצ'י תיאר גם שיטה אחרת ליצירת חד צדדיים 6-OHDA למוצרי נגעים, עם 6-OHDA להיות מוזרק אל הסטריאטום 11. כפי תוארה בעקבות הזרקת striatal של 6-OHDA בחולדות, התוצאה היא רמה נמוכה יותר של איבוד דופמין, שהוא משתנה יותר בין עכברים.

השיקול האחרון שיש לקחת בחשבון הוא ההשפעה הפוטנציאלית של זן של עכברים. זה תועד היטב זן יש השפעה דרמטית על הצלחתם של דלדול הדופמין לאחר ניהול מערכתי של MPTP, אשר גורם גם מוות של תאים סלקטיבי של מסלול דופאמין הכושי striatal-29. אמנם זה ההבדל בין המינים לא נראה להתרחש אצל חולדות לאחר 6-OHDA הממשל, ייתכן כי הוא עשוי להיות גורם בקביעת ההצלחה של הנגע 6-OHDA בעכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החוץ והמסחר הבינלאומי (ממשלת קנדה), אוניברסיטת טורונטו קונוט קרן, קרן קנדה עבור חדשנות, NSERC, קרן Krembil ואמון פרקינסון תרופה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
desipramine HCl Sigma-Aldrich D125 25mg/kg
pargyline HCl Sigma-Aldrich P8013 5mg/kg
6-OHDA HBr Sigma-Aldrich H116 3mg / mouse
stereotaxic Frame Kopf Instruments Model 900
mouse ear cups Kopf Instruments Model 921 Zygoma Ear Cups
mouse incisor bar Kopf Instruments Model 923B
mouse anaesthesia mask Kopf Instruments Model 923B
priming kit (containing 250ml syringe) Hamilton Co PRMKIT 81120
RN compression fitting kit (1 mm) Hamilton Co 55750-01
PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) Hamilton Co 55751-01
dual small hub RN Coupler Hamilton Co 55752-01
luer to small hub RN adaptor Hamilton Co 55753-01
1ml 25S syringe model 7001KH Hamilton Co 80100
*33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel Hamilton Co 7803-05
Scissors Fine Science Tools 14084-08
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blades Fine Science Tools 10035-20
Forcep Fine Science Tools 11608-15
Hemostats Fine Science Tools 13004-14
Isoflurane Abbott Laboratories 02241315 2-3%
Suters (Vicryl 4.0) Syneture SS-683
Steriliser Fine Science Tools 18000-45
Infusion Pump Harvard Apparatus PhD 22/2000
Needles (27G) BD Biosciences 305109
Needles (25G) BD Biosciences 305127
Syringes (1ml) BD Biosciences 309692
Anaesthesia trolley LEI medical M2000
Baytril CDMV, St. hyacinthe, QC 102207
Lidocaine CDMV, St. hyacinthe, QC 3914
Betadine solution CDMV, St. hyacinthe, QC 19955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
  2. Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
  3. Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
  4. Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
  5. Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
  6. Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
  7. Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
  8. Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
  9. Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
  10. Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
  11. Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
  12. Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  13. Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
  14. Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
  15. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
  16. Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
  17. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  18. Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
  19. Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
  20. Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
  21. Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
  22. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  23. Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
  24. Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
  25. Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
  26. Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
  27. Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
  28. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
  29. Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
  30. Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
  31. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).

Tags

רפואה גיליון 60 עכבר 6-OHDA מחלת פרקינסון צרור המוח הקדמי המדיאלי חד צדדית
פיתוח מודל חד צדדי, lesioned מאוס 6-OHDA של מחלת פרקינסון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J.… More

Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (60), e3234, doi:10.3791/3234 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter