Summary
一个6-OHDA单侧病变，内侧前脑束对小鼠进行的协议说明。该方法具有低死亡率与89％的幸存的动物> 95％的损失纹状体多巴胺和90.63率（13.3％）±-4.02％ipsiversive旋转对病灶侧的偏见。
Abstract
单方面损毁6 hyroxydopamine（6 - 羟基多巴胺），损毁帕金森病大鼠模型（PD）的已证实到是在推进我们基本巴金森氏症症状的机制的理解非常宝贵的，因为它概括在基底神经节电路的变化和药理学观察中帕金森患者1-4。然而，在纹状体内的输出途径，这是基底节的主要输入地区的皮质纹状体突触发生的确切的细胞和分子的变化仍然是难以捉摸的，这被认为是网站，在这里出现潜在的帕金森病症状的病理异常5。
在PD，了解基底节电路以下尼格罗 - 纹状体通路变性的变化机制已大大提前过度表达绿色荧光蛋白，通过促进推动发展由细菌人工染色体（BAC）的小鼠RS具体纹状体两个输出途径（EGFP-D1的直接途径，间接的途径：EGFP-D2和EGFP-A2A）让他们在隔离研究。例如，最近的研究表明，有在突触可塑性的病理变化在帕金森病小鼠9,10。然而，这些研究利用幼年小鼠和急性帕金森模型。目前还不清楚是否与稳定的6 - 羟多巴胺损毁大鼠中所描述的变化也发生在这些模型中。其他团体都试图产生一个稳定的单方面的损毁6-OHDA成年PD小鼠模型，损毁内侧前脑束（MFB），不幸的是，在这项研究中的死亡率是非常高，只有14％存活21手术天或更长时间11。最近的研究已产生内黑质病变与低死亡率> 80％的多巴胺能神经元的损失，但表达左旋多巴引起的运动障碍11,12,13,14变量在这些研究中。另一个PD小鼠模型MPTP的损伤小鼠15。虽然这种模式已被证明在评估潜在神经保护剂16有用的，它是不适合理解机制帕金森病的症状，这种模式往往未能引起运动障碍，在18 17病变程度，显示了一个很大的可变性。
在这里，我们已经开发了6-OHDA直接管理到稳定单方面的PD小鼠模型6-OHDA损毁MFB的，一贯导致95％的损失纹状体多巴胺（高效液相色谱法测定），以及生产的行为，不平衡的特点以及单方面的6-OHDA损毁PD大鼠模型中观察到。这个新开发的PD小鼠模型，将被证明是有价值的工具，在了解帕金森病症状的生成机制。
Protocol
1。住房和小鼠的制备
- 这些老鼠是纯FVB小鼠，保持驱动的转基因小鼠8（突变小鼠区域资源中心（MMRRC）的FVB在12:12 h光照黑暗免费获得食物和水的循环细菌人工染色体（BAC）的殖民地。越过这些小鼠与任何其他应变是没有必要的，无论是繁殖的目的，或6-OHDA损伤过程，以确保成功。
- 为了产生帕金森病模型，出生后一天31-42岁的成年小鼠（P31-42）6-OHDA损伤和假手术的需要。
- 为了减少感染的风险，在饮用水管理Baytril（抗生素），手术前24小时。
2。手术药物的制备
通常的地昔帕明和优降宁的术前用药管理啮齿动物注射6 - 羟基多巴胺（6-OHDA）前增加了选择性和EFFicacy 6-OHDA诱导病变。去甲肾上腺素/的5HT吸收抑制剂，地昔帕明下降6 -羟基多巴胺诱导的去甲肾上腺素和5HT消耗22，而单 胺氧化酶抑制剂，优降宁6-OHDA提高多巴胺终端的敏感性，减少突触外细分为6 -羟31。
- 可以在大量的术前用药（desipramine的盐酸（HCl）和优降宁盐酸），并储存于-80°C，直到使用。称取适量的盐酸地昔帕明，每个鼠标提供25毫克/公斤的动物数量将收到当天的手术。鼠标的低体重使得它具有挑战性的准确提供小批量，因此准备在浓度为2.5毫克/毫升，地昔帕明盐酸和管理的动物在10毫升/公斤。必须考虑正确的浓度达到了盐的复合组件的重量。修正的重量盐酸盐，盐酸地昔帕明：分子量（MW）“的地昔帕明盐酸：302.84兆瓦盐酸：36.46兆瓦自由基地：266.38校正因子：302.84 / 266.38 = 1.137 10毫升的解决方案：= 2.5mg/ml西帕明x10.0毫升像x校正系数= 2.5mg/ml x10.0毫升x 1.137 = 28.43mg，盐酸地昔帕明
- 称取适量的盐酸优降宁，提供每个鼠标，按5mg/kg动物的数量，接受手术的那一天。更正如上所述复合盐组件。鼠标的低体重使得它具有挑战性的准确提供小批量，因此准备在浓度为0.5毫克/毫升，优降宁盐酸和管理的动物，在10毫升/公斤。
更正为优降宁盐酸盐酸盐的重量：
兆瓦的优降宁盐酸：195.69兆瓦盐酸：36.46
游离碱：分子量159.23校正因子：195.69 / 159.23 = 1.229
为掂量出10毫升的解决方案：<BR /> = 0.5毫克/毫升优降宁X 10.0毫升x修正系数
= 0.5毫克/毫升x 10.0毫升x 1.229
= 6.15mg了优降宁盐酸盐 - 28.43mg盐酸地昔帕明和6.15mg优降宁盐酸合并成一个10毫升的玻璃量筒，加入8毫升无菌生理盐水（0.9％）。涡和加热到45°C，直到混合物溶解。溶液的pH值，现在是3左右，如果管理老鼠会引起不适和术后并发症，涉及泌尿系统和胃肠道功能。加入几滴氢氧化钠（1M），直到pH值是7.4。无菌生理盐水（0.9％），涡补足到10ml的体积。标签，日期和冻结〜80°C。鉴于盐酸优降宁是在室温下不溶于生理盐水中，在整个手术期间，存放在水浴加热至37°C在手术室术前的混合物。
- 6-OHDA的解决方案必须到手术前准备。车辆使用溶于氢溴酸盐6 - 羟基多巴胺（6- OHDA.Br）解决方案是无菌生理盐水（0.9％）溶液中抗坏血酸（0.2％）。抗坏血酸稳定6-OHDA.Br的，，因为它可以防止氧化6-OHDA.Br的非活动形式。称量0.2克，抗坏血酸，然后添加到一个空的1升量筒，顶部用无菌生理盐水至1升（0.9％），搅拌。标签，日期，并存储在〜80°C，直到需要。
- 适量掂量出6-OHDA.HBr的的15.0毫克/毫升的解决方案，提供3.0微克每鼠标。自6 OHDA.Br的是光热敏感避免暴露于光，地方上冰前称重。
纠正6-OHDA.HBr的氢溴酸盐的重量：
兆瓦6 OHDA.HBr：250.09兆瓦氢溴酸：79.9兆瓦的游离碱：170.19
校正因子：250.09 / 170.19 = 1.47
为0.5毫升溶液掂量出：
6-OHDA = 15.0毫克/毫升×0.5毫升x修正系数
= 15.0毫克/毫升6-OHDA×0.5毫升x 1.47
= 11.03毫克6-OHDA.HBr的 - 为假手术动物，使车辆的等效体积（无菌生理盐水（0.9％），抗坏血酸0.02％，pH值7.4），将获得其中的6-OHDA损毁的动物，在1.0毫升无菌包裹管的地方在锡纸，标签，并立即上冰，直到使用的地方。
3。设立手术仪器
手术工具必须消毒，使用高压灭菌器前ţØ手术。手术工具之间的每一个操作，必须在95％乙醇消毒，加热到250°C 2分钟。所有的实验必须按照适当的动物保健委员会的附属机构和国家的指导方针。
- 清洁所有与异丙醇之前设立的设备表面和设备。处理干净的手术设备时，戴无菌手套。
- 设置鼠标与底座上的纸巾回收笼。地方下加热灯或一个加热垫之上。
- 成立麻醉小车，确保氧气流入连接和开放，异氟醚水库是完全充分。设置为1升/分钟，以2-4％的异氟醚氧流量。理想的情况下会有两种麻醉机流出端口感应室提供氧异氟醚的混合物，以及维修，而动物是在立体框架。
- 合作rrect输液器装配确保成功病变的关键，为被困的空气或阻塞针头量降低6-OHDA注入病变部位。组装的输液器，如图1所示。主题PEEK管一侧的一个护士到金属螺母（RN压缩包（接头1/16 日英寸）），其次是PEEK杯套圈，那么典型煤灰套圈。东方的套管，使锥上的典型煤灰套圈将陷入的PEEK杯套圈交配部分。成的双枢纽小护士耦合器（1）确保连接的地方是紧的。对小双枢纽护士耦合的另一端插入33个规格注射针头。穿过针的RN金属螺母并拧紧。确保在180°小双枢纽护士耦合器（＃1）33号针头。 PEEK管，螺纹偷看套圈的RN金属坚果之一的另一端，然后煤灰套圈。插入金属螺母ND套圈成为第二个双枢纽小护士耦合器装配和拧紧连接。露儿上第二小双护士枢纽耦合器（＃2）的另一端插入集线器小护士适配器（露儿适配器），并拧紧连接。
- 下一步输液器必须催芽（见图1）。填充用无菌水250μL和1.0μL汉密尔顿注射器，确保没有气泡。将250μl注射器的露儿适配器和抑制柱塞250μl注射器等，水通过油管的另一端上的注射针头33计发布。继续推动水通过该系统，同时拉动250μl注射器露儿适配器，留下一个小的水上露儿适配器年底珠。压低1.0μl注射器的柱塞，直到小水珠被弹出。小心地插入1.0μl注射器鲁尔适配器，确保水1.0μl注射器珠与珠水目前Ø连接n为露儿适配器，并完全插入到1.0μl注射器鲁尔适配器。在小双的护士枢纽耦合确保无气泡。
- 现在，该系统底漆，灌注设备可以抵押的立体框架和输液泵。钳的33计注入的立体框架的操纵臂针的小双护士枢纽耦合器，然后夹紧，1.0μL注射器灌注泵，这样，在灌注泵开始时注射器是对钳按下并不能动议。程序允许输液泵注入0.1μL/ min的速率。
4。 6 - 羟基多巴胺单侧病变手术
- 操作前三十分钟，权衡每一种动物，并记录重量。全身盐酸地昔帕明（2.5毫克/毫升，Sigma Aldrich公司），优降宁盐酸（0.5毫克/毫升，Sigma Aldrich公司）（0.9％无菌生理盐水，pH值7.4），一只老鼠在10毫升/公斤，腹腔内注射（IP）管理使用27克针连接到1ml注射器。例如，30.0Ğ鼠标会收到300μL术前用药。热身加热盘置于耳下切牙酒吧。加热盘，将有助于在手术过程中保持温度的动物和动物保持在一个理想的高度，以适应的立体框架的耳朵和切牙酒吧。
- 十五分钟后，盐酸地昔帕明和优降宁盐酸溶液的管理，将鼠标放置在一个封闭的麻醉室，和anesthetise使用异氟醚吸入在O 2（2-3％）的动物。在动物是充分anesthetised的，当它显示没有后腿捏和不眨眼的反应。
- 刮胡子鼠标的头部上方，适用于外用止痛药利多卡因直接使用棉花的皮肤。五分钟后，利多卡因应用，消毒用优碘溶液的动物的头。
- 放置在立体定向框架适应对小鼠的动物。首先放入动物的门齿，酒吧（切牙栏设置：-3.0到+2.0毫米）放置在面对动物的麻醉面罩。调整氧流量1 L / min时和异氟醚1.5-2％。切牙酒吧应该是在耳杯等，头骨的顶部是水平相对水平。插入耳杯（直径5.0毫米）。已正确插入耳杯的时候头是完全平坦的，并不能在任何一个方向移动。
- 削减沿中线鼠标使用手术刀刀片头顶部皮肤，并收回皮肤。干燥使用纱布头骨的表面。
- 1.0μl注射器的活塞向下推，并放入1毫升含6 - 羟基多巴胺溶液（15毫克/毫升）在锡铝箔覆盖的管的33个规格注射针头。退1.0μl注射器的柱塞上，缓慢而保持的33个计沉浸在6-OHDA溶液（15毫克/毫升）的注射针。
- 沿中创建一个1厘米的切口行的头骨。推进注射针针尖对囟门，取少量6 OHDA解决方案，形成一个小珠子从33规格注射针头。慢慢地降低注射针头前囟门，珠触及前囟门时停止前进的针尖，并记录这些坐标。收回的注射针在背方向2毫米，并沿矢状缝在头侧对拉姆达尾方向移动。提前从33规格注射针头少量6 OHDA解决方案，形成一个小珠子。慢慢地降低拉姆达，珠接触的Lambda时停止推进针尖和记录这些坐标的注射针头。内侧外侧（ML）和背腹（DV）的坐标应该是相同的，如果他们不前囟门和Lambda，相应地调整切牙酒吧AP的坐标，为ML坐标耳酒吧。针移动的合作，统筹AP：-1.2毫米，ML：-1.1毫米，相对要BREG马根据在老鼠大脑图谱立体定向统筹25。缩回针头，将使用25号针头的颅骨孔和毛刺。
- 返回上述统筹注射针，针插入DV：输入-5mm的。单方面入中位数的前脑束注入0.1μL/分钟（共3微克）的速度在0.2μL6-OHDA或车辆。 6-OHDA或车辆管理完成后，再五分钟离开针，以便从注射部位扩散距离的地方。
- 慢慢地缩回针头。
- 头皮使用三种缝合关闭切口，并提供乳酸林格氏液1毫升皮下（SC）。
- 从立体框架，并在回收笼的地方，直到重新获得意识的动物。
5。手术后护理的6-OHDA损毁的动物
- 地方动物在笼子里（3只/笼），并允许免费获得食物和sugareð水（10毫米）。在地板上笼，以刺激食欲和肠胃蠕动的食品容器，提供Nutra - 凝胶和KMR（小猫牛奶替代品）。
- 检查小鼠每日手术后2周24。在每次检查应特别注意动物的警觉性评估能力的动物笼子里走动。食物和水的摄入量从过去的观察期，以及排泄物的存在和一致性，也应得到遵守。手术后一种常见的并发症是脱水皮肤下面的皮肤捏慢回缩，这是显而易见的。如果这是1个星期的观察提供的乳酸林格氏溶液SC1毫升或直到症状改善。在雄性动物的情况下，应该仔细观察阴茎发红确定的阴茎脱垂生殖器。如果发生这种情况应用mucol凝胶受影响动物的阴茎，并提供1周1毫升乳酸林格氏溶液SC直到症状改善。
- 衡量动物每日监测体重的变化。
- 在腹腔注射造成了肠胃系统的小撕裂的情况下，可能会导致腹腔感染。因此，评估腹部prsence感染，肿腹胀明显。 Baytril在3-4天drining的水管理或治疗，直到症状改善。
6。帕金森病的评估
估计病变程度，进行行为评估6-OHDA损伤手术后的14-21天，当多巴胺耗竭量是最大的和稳定的26。
- 地方小鼠在玻璃圆筒（11厘米×9.5厘米）和腹腔注射0.01毫升/克0.9％的无菌生理盐水，使用videocamera（CG9三洋）记录他们的活动。
- 观看视频，计算完整的360°旋转的ipsiversive和contraversive方向相病变。
- 对ipsiversive旋转更大的偏见，更多的帕金森病的动物，因此计算的净百分比（contraversive和ipsiversive）旋转行为ipsiversive旋转的比例。
7。纹状体多巴胺含量的测定高效液相色谱法
- 6-OHDA损伤手术后至少21天，与行为研究完成后，牺牲的小鼠麻醉剂量，并小心地取出大脑。保留从每个鼠标在每个半球纹状体片（230微米），捕捉后立即冻结切片并储存在-80℃直到准备纹状体样品Ç。
- HPLC样品缓冲液（0.1米PCA的2毫米谷胱甘肽）防止从打破纹状体样品中提取的多巴胺。
对于100毫升样品缓冲液：
= 100毫升高效液相色谱等级H 2 O的
= 0.862毫升PCA（70％）（SIGM一）
= 61.5毫克谷胱甘肽（减少）
测量出的HPLC等级H 2 O的 ，添加了PCA，溶解在溶液中的谷胱甘肽，拌匀和过滤器。在4°C样本缓冲区可以存储长达1个月。 - 在冰上解冻纹状体切片，然后在200μL的样品使用超声波细胞破碎（费舍尔声波，美国）的缓冲区均质。在任何时候都保持冰的样品均质每个样品各10秒，确保样品冷却之间的同质化时期的3倍。
- 预留的蛋白质检测每个均质样品20μL（存储于-80°C）。
- 离心样品（20,800 XG，20分钟（4℃，离心58 - 04R，美国）），然后取出上清，过滤器通过0.2微米的PVDF膜（Pall公司，猫＃：1935-28143-310）冻结在-80°C，直到高效液相色谱分析。保留一个备份的蛋白质检测蛋白质沉淀。
- 制备高效液相色谱流动相运行THRough的色谱柱。
1 L流动相：
60毫米的NaH 2 PO 4 H 2 O（一元）= 8.27Ğ
30毫米柠檬酸= 5.7Ğ
0.13毫米乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐脱水= 48毫克
0.16毫米的十二烷基硫酸钠（SDS）= 45毫克
850毫升HPLC级水（克力，猫＃：8801-7）
15％V / V乙腈-190（pH值3.35）= 150毫升HPLC级（卡利登，猫＃：1401-7）
〜2μL10 M氢氧化钠（HPLC级H2O）
所有试剂应≥99.0％的纯和HPLC级尽可能。水和乙腈必须是HPLC级。流动相必须在一个星期的准备。有专用，清洁玻璃器皿和搅拌酒吧专为流动相（1升玻璃量筒和至少2 1升玻璃瓶）的准备。前准备的流动相有两个干净的1升瓶的准备，使溶液中和一个转移到在过滤和degassi纳克。允许流动相流通一夜之间通过高效液相色谱法和检查基线是平的，在使用前。 - HPLC级水700毫升玻璃量筒测出和化解的NaH 2 PO 4计 ，柠檬酸，EDTA和SDS中H 2 O。补足到850毫升的水。
- 使用10 M氢氧化钠，调节pH值至3.35，然后加入乙腈和混合解决方案，使用特氟隆涂层的搅拌棒。
- 把轰动栏，在第二次清洁，空1升瓶和真空过滤机通过0.22微米HVLP的微孔过滤器把它的流动相：（猫＃：SLGP033RS）。弄湿85:15 H2O /乙腈过滤前过滤器。一旦移动充分过滤，脱气的流动相，在真空状态下搅拌至少10分钟。
- 准备对将被测其中纹状体样品的多巴胺浓度的标准。通过高效液相色谱法标准，在开始和结束每个纹状体样品批次。一个1毫克/毫升股票多巴胺的解决方案，可以提前，并在20μL分装保存在-80°C。准备原液溶于5毫升样品缓冲液5毫克的多巴胺（见上文）和混合彻底。开始准备的标准，以5μL1毫克/毫升原液，加入2.5毫升样品缓冲和混合彻底获得2微克/毫升多巴胺溶液。
- 四个标准通过高效液相色谱法，产生浓度曲线。多巴胺浓度分别为：100毫微克/毫升50毫微克/毫升25毫微克/毫升和12.5纳克/毫升。为了生成这四个浓度的多巴胺在7.10准备在2微克/毫升多巴胺溶液）10μL。并把它添加到190μL的样品缓冲液，给你一个100毫微克/毫升多巴胺的解决方案。在此之后的100毫微克/毫升样品缓冲多巴胺解决方案执行1:1系列稀释。只需100μL100毫微克/毫升多巴胺添加100μL的样品缓冲液和组合，以产生50毫微克/毫升的多巴胺，然后取100微升50毫微克/毫升的多巴胺，添加100μL的样品缓冲液和组合，以产生25毫微克/毫升多巴胺等。
- 准备高效液相色谱系统，（水域1525μ二元泵，717plus自动进样器，对称性的C-18反相柱（15厘米×4.6 mm内径，5微米颗粒大小）（30℃），电化学检测器（ESA Coulochem三）配备双电极分析细胞（ESA 5011A）和微风软件（水域））首先清除系统与流动相选择在计算机软件清除协议或按照制造商的指示控制。此交流所有以前的解决方案，与新鲜的流动相HPLC系统。
- 设置在400 mV的电化学势，分别为第一和第二电极和-300毫伏。在此之后，系统的平衡运行至少2小时，最好在1毫升/分钟的流速流动相过夜。细胞在平衡过程中，应开启和基线重ading监测，当读数稳定系统是随时可以使用。对于第一个小时的平衡，让流动相，退出系统去成废品容器中，这可以允许流动相HPLC系统循环，把流动相瓶的出口软管。
- 在冰上解冻纹状体的样本，然后注入20μL的2×20μL，每个样品和20μL每多巴胺标准进一步与流动相流速平衡的高效液相色谱系统在1毫升/分钟每多巴胺标准。
- 用高效液相色谱系统软件分析的标准和样品所产生多巴胺峰面积。比较的纹状体多巴胺浓度标准曲线的样品中的多巴胺峰面积将确定每个纹状体样品在20μL多巴胺目前的金额。这个数字扩大总多巴胺目前在整个纹状体切片。
- P级erform上纹状体匀浆20μL设置在7.4除外）的标准蛋白检测。这将测量蛋白质目前毫克/毫升的纹状体样本量。从这个计算量的多巴胺纹状体样品让你比较南北半球之间小鼠的多巴胺浓度在毫微克/毫克价值。
8。代表结果
管理生理盐水（IP）28十五至二十日6-OHDA损伤手术后，当神经毒素引起细胞死亡的数量已达到completion26，测量自发的360°旋转，可用于评估6成功-OHDA损毁（图2）。这种行为评估方法简单，快速，并避免潜在的吸效应引起的多巴胺能药物，如安非他明或阿朴吗啡挑战。此外，自发旋转的评估是一个更好的predi<95％的多巴胺耗竭动物的构造函数相比，前肢的爪子分班考试27。在每个动物的自发ipsiversive旋转的百分比从纹状体样品用高效液相色谱法的行为研究完成后，准备通过关联纹状体多巴胺水平，我们发现，已经失去了的动物表现出70％或对6-OHDA损伤ipsiversive旋转> 95％的纹状体多巴胺（图3）27。部分6 -羟基多巴胺诱导病灶（59.44±17.20）（图3）的内侧前脑束，有ipsiversive与contraversive双方之间没有旋转的偏见时测量自发旋转（40.91±8.01）（图2）。因此，已发现6-OHDA政府在大鼠MFB功能后，它有可能造成的多巴胺尼格罗纹状体神经元深刻的损失，与生理盐水管理（IP）是一种精确的方法筛选6 - 羟基程度多巴胺在这些动物的病变。
图1。装配注射针装置示意图6-OHDA损伤手术证明。
图2。假手术和6-OHDA损毁小鼠旋转行为的评估。假手术和6-OHDA损毁小鼠的自发旋转。数据以平均百分比ipsiversive旋转±扫描电镜（SEM），其中净contraversive和ipsiversive旋转是100％。开放式的酒吧：假手术动物;灰色酒吧：6-OHDA损毁的动物与多巴胺损失> 95％;黑条：动物，经历了6-OHDA损伤手术，部分被损毁。 ***，P <0.001相比，假手术动物。随后邓恩的多重比较试验（单向ANOVA火腿操作：N = 17; 6-OHDA损毁（> 95％）：N = 23;部分6-OHDA损伤：N = 3）。
图3。假手术纹状体多巴胺水平和6-OHDA损毁小鼠，用高效液相色谱法评估。假和6-OHDA损毁动物手术和腭裂半球纹状体多巴胺含量测定。数据以平均百分比±在腭裂纹状体纹状体多巴胺水平的SEM。开放式的酒吧：假手术动物;灰色酒吧：6-OHDA损毁的动物与多巴胺损失> 95％;黑条：动物，经历了6-OHDA损伤手术，部分被损毁。 ***，P <0.001，**示P <0.01相比，假手术动物。随后邓恩的多重比较试验单向ANOVA（假手术组：17例，6-OHDA损毁（> 95％）：N = 23，部分6-OHDA病变：N = 3）。
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图4。假手术和6-OHDA损毁小鼠SNC酪氨酸羟化酶免疫反应的评估。由于在黑质致密部（SNC）的多巴胺细胞损失，损失的酪氨酸羟化酶（TH）在深水和6-OHDA损毁动物的手术和腭裂半球阳性免疫组化标记被确定为蒂勒等。出版社。数据以平均百分比±SEM腭裂纹状体TH阳性细胞。开放式的酒吧：假手术动物;灰色酒吧：6-OHDA损毁的动物与多巴胺损失> 95％;黑条：动物，经历了6-OHDA损伤手术，部分被损毁。 ***，P <0.001，**示P <0.01相比，假手术动物。邓恩的多个COMPA其次是单向ANOVArison测试（假手术17例，6-OHDA损毁（> 95％）：N = 23，部分6-OHDA病变：N = 3）。
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Discussion
本协议描述了一个稳定的单方面6-OHDA损毁的帕金森氏症，这是非常重复性高病变的成功率，低死亡率，小鼠模型的生成方法。 6-OHDA损伤手术的成功，可以很容易地估计> 70％> 95％，在27的损毁纹状体多巴胺耗竭的指标ipsiversive旋转自发旋转行为的测量。纹状体多巴胺水平的量化纹状体多巴胺耗竭的程度相比，在黑质致密部TH阳性细胞数量quantificiation是最精确的测量，因为它提供了直接测量纹状体多巴胺水平28。鉴于此协议重新注入网站（MFB）和长度（21天）病变发展的特点以及单方面的6-OHDA损毁大鼠模型的帕金森氏病1,4，我们可以假设日在这种小鼠模型，大鼠模型，概括与帕金森氏症患者在药理学和大脑电路的变化观察。因此，这种方法提供了在转基因小鼠模型的帕金森氏症的症状产生的一种手段。鉴于转基因小鼠是极其强大的工具，让我们了解分子和蛋白质在体内的作用，在分子，细胞和整个组织的水平，结合这两种技术将证明极其有用，进一步划定的细胞和分子机制相关代帕金森氏症的症状。
先驰已先前描述产生1单方面6 - 羟多巴胺，损毁帕金森氏病的小鼠类似的方法，然而，这是相关的死亡率很高，只有14％的动物存活超过21天后手术6以下注射 - 多巴胺成MFB的11。有几个POSS这里所描述的协议缺乏死亡率ible解释。首先，在这个协议中选择的立体坐标，可以完全避免下丘脑注射针。由于老鼠的下丘脑是如此之小，这种结构的损害可能会影响鼠标进食和饮水的中心，导致动物减肥，成为脱水，并最终死亡。其次，在这里描述的协议，是在研究相同浓度的6 -羟基多巴胺（3毫克）11 Lundblad和同事利用，但是，它是在一个更小的体积（0.2毫升至1ml）管理与较慢的输液率（0.1ml/min相比的，以0.5ml/min）。体积小，慢输液速度，确保结构周围MFB的损害最小。最后的注射针头的直径明显较小（0.33比50毫米），这将最大限度地减少损害大脑的结构作为大脑腹侧通过针头传播。
内容】“>先驰还介绍了另一种方法，产生单方面6-OHDA病变，与6-OHDA注入纹状体11。已在大鼠纹状体注射6-OHDA后，这个结果在一个较低的水平多巴胺的损失，这是多变量之间的小鼠。必须考虑的是最后考虑的小鼠品系的潜在影响。它已经有据可查，应变多巴胺耗竭的成功后，MPTP的，这也导致了选择性的多巴胺尼格罗纹状体通路29细胞死亡的系统性管理上有巨大的影响。虽然这种物种之间的差异似乎并没有出现在大鼠6-OHDA管理，这是可能的，它可能是在确定的6-OHDA损伤小鼠成功的一个因素。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
这项工作是支持的外交事务和国际贸易（加拿大政府），多伦多大学，加拿大创新，NSERC，Krembil的基金会和治疗帕金森氏信托基金会诺基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desipramine HCl | Sigma-Aldrich | D125 | 25mg/kg |
| pargyline HCl | Sigma-Aldrich | P8013 | 5mg/kg |
| 6-OHDA HBr | Sigma-Aldrich | H116 | 3mg / mouse |
| stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| mouse ear cups | Kopf Instruments | Model 921 Zygoma Ear Cups | |
| mouse incisor bar | Kopf Instruments | Model 923B | |
| mouse anaesthesia mask | Kopf Instruments | Model 923B | |
| priming kit (containing 250ml syringe) | Hamilton Co | PRMKIT 81120 | |
| RN compression fitting kit (1 mm) | Hamilton Co | 55750-01 | |
| PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) | Hamilton Co | 55751-01 | |
| dual small hub RN Coupler | Hamilton Co | 55752-01 | |
| luer to small hub RN adaptor | Hamilton Co | 55753-01 | |
| 1ml 25S syringe model 7001KH | Hamilton Co | 80100 | |
| *33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10035-20 | |
| Forcep | Fine Science Tools | 11608-15 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 02241315 | 2-3% |
| Suters (Vicryl 4.0) | Syneture | SS-683 | |
| Steriliser | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | PhD 22/2000 | |
| Needles (27G) | BD Biosciences | 305109 | |
| Needles (25G) | BD Biosciences | 305127 | |
| Syringes (1ml) | BD Biosciences | 309692 | |
| Anaesthesia trolley | LEI medical | M2000 | |
| Baytril | CDMV, St. hyacinthe, QC | 102207 | |
| Lidocaine | CDMV, St. hyacinthe, QC | 3914 | |
| Betadine solution | CDMV, St. hyacinthe, QC | 19955 |
References
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