Summary
Um protocolo para a realização unilaterais 6-OHDA lesões do feixe prosencéfalo medial em ratinhos é descrito. Este método tem uma baixa taxa de mortalidade (13,3%) com 89% dos animais sobreviventes mostrando> perda de 95% da dopamina do estriado e 90,63 ± -4,02% viés ipsiversive rotacional para o lado da lesão.
Abstract
O unilateralmente lesados 6 hyroxydopamine-(6-OHDA)-lesionado modelo do rato da doença de Parkinson (DP) provou ser inestimável para avançar na compreensão dos mecanismos subjacentes a sintomas parkinsonianos, uma vez que ele recapitula as mudanças no circuito gânglios da base e farmacologia observada em pacientes parkinsonianos 1-4. No entanto, as alterações celulares e moleculares precisos que ocorrem em cortico-estriatais sinapses das vias de saída dentro do estriado, que é a região de entrada principal dos gânglios da base permanecem ainda desconhecidos, e este é acreditado para ser local onde as anormalidades patológicas subjacentes sintomas parkinsonianos surgir 3 , 5.
Na DP, compreendendo os mecanismos subjacentes alterações na degeneração dos gânglios basais circuito seguinte da via nigro-estriatal tem sido grandemente avançado pelo desenvolvimento do cromossoma artificial bacteriano (BAC) ratinhos sobre-expressam proteínas fluorescentes verdes conduzidos por promoverrs específico para as duas vias de saída do estriado (via direta: EGFP-D1; via indireta: eGFP-D2 e eGFP-A2a) 8, permitindo-lhes a ser estudado isoladamente. Por exemplo, estudos recentes sugeriram que há mudanças patológicas em plasticidade sináptica em ratinhos parkinsonianos 9,10. No entanto, estes estudos utilizaram ratos juvenis e modelos agudos de parkinsonismo. Não é claro se as alterações descritas em ratos adultos com estáveis 6-OHDA lesões também ocorrem nestes modelos. Outros grupos têm tentado gerar um estável unilateralmente, lesionado 6-OHDA modelo do rato adulto de DP por lesão do feixe medial do prosencéfalo (MFB), infelizmente, a taxa de mortalidade neste estudo foi extremamente elevada, com apenas 14% de sobreviver à cirurgia para o dia 21 dias ou mais 11. Estudos mais recentes têm gerado intra-nigral lesões tanto com taxa de mortalidade mais baixo> perda de 80% dos neurônios dopaminérgicos, no entanto expressão de L-DOPA discinesia induzida 11,12,13,14 foi variávelnestes estudos. Outro modelo de mouse bem estabelecida de PD é o mouse MPTP lesada 15. Embora este modelo tem se mostrado útil na avaliação de potenciais agentes neuroprotetores 16, é menos adequado para a compreensão dos mecanismos subjacentes sintomas da DP, já que este modelo muitas vezes não consegue induzir déficits motores, e mostra uma grande variabilidade na extensão da lesão 17, 18 .
Aqui temos desenvolvido um modelo de rato estável unilateral 6-OHDA lesionada de PD por administração directa de 6-OHDA na MFB, que faz com que consistentemente> perda de 95% da dopamina do estriado (como medido por HPLC), bem como a produção do comportamental desequilíbrios observado no modelo de rato bem caracterizado unilateral 6-OHDA lesionada de PD. Este modelo de camundongo recém-desenvolvida da PD será uma ferramenta valiosa para a compreensão dos mecanismos subjacentes à geração dos sintomas parkinsonianos.
Protocol
1. Habitação e preparação de ratos
- Manter uma colônia de cromossomo artificial bacteriano (BAC) conduzido camundongos transgênicos 8 (Mutant mouse Resource Regional Centro (MMRRC) FVB em uma 12:12 h ciclo claro-escuro, com livre acesso à comida e água. Estes ratos são ratos FVB puros, e não é necessário para atravessar estes ratos com qualquer outra estirpe, quer para fins de procriação, ou para garantir o sucesso do procedimento de lesão de 6-OHDA.
- A fim de gerar um modelo de parkinsonianos, camundongos adultos com idades entre 31-42 dias pós-parto (P31-42) são necessários para cirurgias 6-OHDA lesão e fraude.
- Para reduzir o risco de infecção, administrar Baytril (antibiótico) na água de beber durante 24 horas antes da cirurgia.
2. Preparação de drogas para a cirurgia
Um pré-medicação de desipramina e pargilina é geralmente administrada a roedores antes da injecção de 6-hidroxidopamina-(6-OHDA) para aumentar a selectividade e FEPicacy de 6-OHDA lesões induzidas. O inibidor da absorção de noradrenalina / 5HT, desipramina diminui 6-OHDA induzida por noradrenalina e 5HT depleção 22, ao passo que o inibidor da monoamina oxidase, pargilina aumenta a sensibilidade dos terminais dopaminérgicos a 6-OHDA, por redução da destruição do extrasynaptic de 6-hidroxidopamina 31.
- A pré-medicação (cloridrato de desipramina (HCl) e pargilina HCl) pode ser feito em grandes volumes e armazenadas a -80 ° C até à utilização. Pesar a quantidade apropriada de desipramina HCl para fornecer a cada rato com 25 mg / kg para o número de animais que vai receber a cirurgia no mesmo dia. O baixo peso do rato torna difícil para entregar pequenos volumes com precisão; portanto preparar cloridrato de desipramina a uma concentração de 2,5 mg / ml e administrado ao animal a 10 ml / kg. O peso do componente sal do composto deve ser responsáveis por tal que a concentração correcta é alcançada. De correcção para o peso doSal de HCl em desipramina cloridrato: peso molecular (Mw) de desipramina HCl: 302,84 MW HCl: 36,46 MW de base livre: 266,38 factor de correcção: 302,84 / 266,38 = 1,137 para 10 ml de solução: = desipramina 2.5mg/ml x 10.0ml x = factor de correcção 2.5mg/ml x 10.0ml x 1,137 = 28.43mg de cloridrato de desipramina
- Pesar a quantidade apropriada de pargilina HCl para fornecer a cada rato com 5mg/kg, para o número de animais que receberam a cirurgia que dia. Corrigir para o componente de sal do composto como descrito acima. O baixo peso do rato torna difícil para entregar pequenos volumes com precisão; portanto preparar cloridrato de pargilina a uma concentração de 0,5 mg / ml e administrar ao animal, a 10 ml / kg.
Corrigir o peso do sal de HCl em cloridrato de pargilina:
MW de pargilina HCl: 195,69 MW HCl: 36,46
MW de base livre: 159,23 Fator de Correção: 195,69 / 159,23 = 1,229
Para 10 ml de solução de pesar: <br /> = 0,5 mg / ml pargilina x 10,0 ml x fator de correção
= 0,5 mg / ml x 10,0 x 1,229 ml
= 6.15mg de cloridrato de pargilina - Combinar 28.43mg desipramina HCl e 6.15mg pargilina HCl em um copo graduado de 10 ml de cilindro, e adicionar 8 ml de solução salina estéril (0,9%). Vortex e calor a 45 ° C até a mistura se dissolver. O pH da solução será agora de cerca de 3, que, se administrado aos ratinhos irá causar desconforto e complicações pós-operatórias, envolvendo a função do tracto urinário e gastrointestinal. Adicionar gotas de NaOH (1M) até que o pH é de 7,4. Encher o volume para 10 ml com solução salina estéril (0,9%), e de vórtice. Data Label, e congelar a -80 ° C. Dado que pargilina HCl não é solúvel em solução salina à temperatura ambiente, durante todo o período cirúrgico, armazenar a mistura pré-medicação em um banho de água aquecida a 37 ° C, na sala de operação.
- Soluções de 6-OHDA deve ser preparada imediatamente antes de cirurgias. O veículo utilizado para dissolver 6-OHDA bromidrato (6-OHDA.Br solução) é solução salina estéril (0,9%) contendo solução de ácido ascórbico (0,2%). O ácido ascórbico é necessário para estabilizar 6-OHDA.Br, uma vez que evita a oxidação de 6-OHDA.Br para uma forma inactiva. Pesar 0,2 g de ácido ascórbico, em seguida, adicionar a uma L 1 vazio cilindro graduado, de cima até 1 L, com solução salina estéril (0,9%) e agita-se. Rótulo, a data, armazenar e em ~ 80 ° C até serem necessárias.
- Pesar a quantidade apropriada de 6-OHDA.HBr para fazer uma solução 15,0 mg / ml para fornecer a cada rato com 3,0 ug. Desde 6-OHDA.Br é leve e sensível ao calor evitar a exposição à luz, e local em gelo antes da pesagem.
Corrigir o peso do sal de HBr em 6-OHDA.HBr:
MW de 6-OHDA.HBr: 250,09 MW HBr: 79,9 MW de base livre: 170,19
Fator de correção: 250,09 / 170,19 = 1,47
Para 0,5 ml de solução de pesar:
= 15,0 mg / ml de 6-OHDA x 0,5 ml factor de correcção x
= 15,0 mg / ml de 6-OHDA x 0,5 ml x 1,47
= 11,03 mg de 6-OHDA.HBr - Para sham operados animais, perfazer um volume equivalente de veículo (solução salina estéril (0,9%), ácido ascórbico a 0,02% pH 7,4) para o que os animais 6-OHDA lesionados irá receber, e colocar num tubo de 1,0 ml estéril envolto no rótulo de estanho, tiras e lugar imediatamente em gelo até à utilização.
3. Configurar o aparelho cirúrgico
Os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados usando um autoclave t antescirurgia o. Entre cada operação, instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados em etanol a 95%, seguido por aquecimento a 250 ° C durante 2 minutos. Todos os experimentos devem ser realizados em conformidade com as orientações das Comissões de animais apropriadas de cuidados da instituição afiliada e do país.
- Limpe todas as superfícies e equipamentos com álcool isopropílico antes de configurar o equipamento. Usar luvas estéreis ao manusear equipamento cirúrgico limpo.
- Set-up de uma gaiola de recuperação do mouse com toalhas de papel sobre a base. Colocar sob uma lâmpada de aquecimento ou em cima de uma almofada aquecida.
- Configure o carrinho de anestesia, garantindo que o aporte de oxigênio está ligado e aberto, eo reservatório isoflurano está completamente cheio. Ajuste o fluxo de oxigénio para 1 L / min, eo isoflurano para 2-4%. Idealmente, haverá duas portas de saída da máquina de anestésico para proporcionar a mistura de oxigénio isoflurano para uma câmara de indução, bem como para a manutenção enquanto o animal está no quadro estereotáxico.
- Correct montagem do aparelho de perfusão é crítico para assegurar lesões de sucesso, como o ar preso ou de agulhas bloqueados diminui o volume de 6-OHDA infundida no local da lesão. Montar o aparelho de infusão, como demonstrado na figura 1. Discussão uma porca de metal RN para o mesmo lado da tubagem de PEEK (RN compressão kit (encaixe 1/16 polegadas th)), seguido pela taça PEEK virola, então o canónica PFA virola. Orientar as ponteiras para que o cone no canônica PFA ponteira vai cair na parte de acasalamento do copo PEEK ponteira. Lugar no duplo pequeno hub RN acoplador (# 1), garantindo a conexão fique firme. Na outra extremidade do cubo dupla pequena RN acoplador inserir o agulha de injecção 33 gauge. Passe a agulha através de uma das porcas metálicas RN e aperte. Assegurar a agulha de calibre 33 é em um ângulo de 180 ° para o dual pequeno hub RN acoplador (# 1). Na outra extremidade do segmento de tubagem de PEEK, uma das porcas de metal RN seguido por uma virola PEEK, em seguida, o PFA virola. Insira uma porca de metalnd ponteira de montagem em um segundo duplo pequeno hub RN acoplador e aperte a conexão. Na outra extremidade de uma segunda pequena dupla RN cubo acoplador (# 2) para inserir o luer pequeno adaptador RN cubo (adaptador Luer), e apertar a ligação.
- Em seguida o aparelho de infusão deve ser preparada (ver Figura 1). Preencha o ul 250 e 1,0 ul seringas Hamilton com água estéril, assegurando que não existem bolhas de ar. Anexar a seringa 250 uL para o adaptador Luer e pressionar o êmbolo da seringa 250 uL de tal modo que a água é libertada através da agulha de injecção 33 gauge, na outra extremidade do tubo. Continue empurrando a água através do sistema enquanto puxa a seringa 250 ul para fora do adaptador Luer, deixando uma pequena esfera de água sobre a extremidade do adaptador Luer. Pressionar o êmbolo da seringa 1,0 uL até um pequeno de água é ejectado do grânulo. Insira cuidadosamente a seringa 1,0 ul ao adaptador luer, certifique-se que a água talão na seringa 1,0 ul se conecta com o talão de água presente on, o adaptador Luer, e completamente inserir a seringa 1,0 uL para o adaptador Luer. Garantir que não haja bolhas na dupla RN pequeno acoplador hub.
- Agora que o sistema é purgado, o aparelho de perfusão podem ser fixadas à estrutura estereotáxica e bomba de infusão. Prender a pequena dupla RN acoplador cubo com a agulha de injecção 33 gauge ligado ao braço manipulador da armação estereotáxica, então fixar a seringa 1,0 uL para a bomba de perfusão, de tal modo que quando a bomba de perfusão começa a seringa é pressionado contra o grampo e não pode mover. Programa a bomba de infusão para permitir que uma taxa de infusão de 0,1 ul / min.
4. Cirurgia lesão unilateral 6-OHDA
- Trinta minutos antes das operações, pesar cada animal e registrar o peso. Sistemicamente administrar cloridrato de desipramina (2,5 mg / ml, Sigma Aldrich) e cloridrato de pargilina (0,5 mg / ml, Sigma Aldrich) (0,9% salina estéril, pH 7,4) a 10 ml / kg por injecção intra-peritoneal (ip) de um ratoutilizando uma agulha de 27G ligada a uma seringa de 1 ml. Por exemplo, um rato 30,0 g receberia 300 l de pré-medicação. Aqueça o disco de aquecimento e colocar isso sob a orelha e bar incisivo. O disco de aquecimento irá ajudar a manter a temperatura do animal durante a cirurgia e manter o animal a uma altura ideal para se encaixar nas barras da orelha e incisivo da armação estereotáxica.
- Quinze minutos após a administração da desipramina HCl e solução pargilina HCl, coloque o rato em uma fechado anestesia câmara, e anestesiar o animal usando inalação de isoflurano (2-3% em O 2). O animal é suficientemente anestesiado quando ele não mostra resposta a pitada de pernil e não reflexo de pestanejo.
- Raspar a cabeça do rato, e aplicar o analgésico tópico lidocaína diretamente sobre a pele usando algodão. Cinco minutos após a aplicação de lidocaína, esterilizar a cabeça do animal com uma solução de betadine.
- Colocar o animal numa moldura estereotáxico adaptado para ratinhos. Em primeiro lugar colocar o animal para o barras incisivo (incisivo ajuste de barra: -3,0 a 2,0 milímetros) com a máscara de anestesia colocado sobre a face do animal. Ajustar o fluxo de oxigénio para 1 L / min, eo isoflurano a 1,5-2%. A barra de incisivo deve estar a um nível relativamente aos copos de orelha tais que o topo do crânio é nível. Insira os Fones de ouvido (5,0 mm de diâmetro). Os copos de orelha ter sido inserido correctamente quando a cabeça é completamente plana, e não pode ser movido em qualquer direcção.
- Cortada ao longo da linha mediana da pele na parte superior da cabeça do rato utilizando uma lâmina de bisturi, e retrair a pele. Seca-se a superfície do crânio com gaze.
- Empurrar para baixo do êmbolo da seringa 1,0 uL, e colocar a agulha de injecção 33 gauge para dentro do tubo 1 ml coberto de folha de estanho contendo 6-OHDA solução (15 mg / ml). Recuar lentamente sobre o êmbolo da seringa 1,0 uL, mantendo a agulha de injecção 33 gauge imersos na solução de 6-OHDA (15 mg / ml).
- Criar uma incisão de 1 cm ao longo do meiolinha do crânio. Avançar a ponta da agulha de injecção para Bregma, dispensar uma pequena quantidade de 6-OHDA solução a partir da agulha de injecção 33 gauge para formar uma pequena pérola. Lentamente inferior a ponta da agulha de injecção para Bregma, quando o grânulo toques Bregma parar o avanço da ponta da agulha e gravar estas coordenadas. Retrair a injecção agulha 2 mm na direcção dorsal, e mover-se ao longo da sutura sagital, em direcção rostral caudal para lambda. Avançar uma pequena quantidade de 6-OHDA solução a partir da agulha de injecção 33 gauge para formar uma pequena pérola. Lentamente inferior a ponta da agulha de injecção para Lambda, quando o grânulo contactos Lambda parar o avanço da ponta da agulha e gravar estas coordenadas. O laterais medial (ML), e dorsal ventral (DV) coordenadas devem ser idênticas para Bregma e Lambda, se eles não são, ajustar a barra incisivo em conformidade para as coordenadas AP, e as barras de orelha para as coordenadas ML. Mover a agulha para coordena AP: -1,2 mm, ML: -1,1 milímetros em relação ao Bregma de acordo com o Atlas do cérebro do rato em Estereotáxica Coordenadas 25. Retrair a agulha, e broca de um furo no crânio utilizando uma agulha de calibre 25.
- Retornar a agulha de injecção ao acima coordenadas, e inserir a agulha para DV:-5mm. Infundir 0,2 uL de 6-OHDA ou veículo unilateralmente no feixe prosencéfalo mediana, a uma taxa de 0,1 ul / min (3 total ug). Após a conclusão da administração de 6-OHDA ou veículo, deixar a agulha no lugar por mais cinco minutos para permitir a difusão para longe do local de injecção.
- Lentamente retrair a agulha.
- Feche a incisão para o couro cabeludo com três pontos, e entregar 1ml de solução de Lactato de Ringer por via subcutânea (sc).
- Retire o animal do quadro estereotáxico, e coloque na gaiola de recuperação até que a consciência é recuperada.
5. Cuidados pós-operatórios de 6-OHDA lesionados animais
- Colocar os animais em gaiolas (3 ratinhos / gaiola) e permitir o acesso livre à comida e sugared água (10 mM). Fornecer Nutra-gel e KMR (gatinho substituto do leite), em recipientes de alimentos no chão da gaiola para estimular o apetite e da motilidade gastrointestinal.
- Inspecione os ratos diariamente no pós-operatório, durante 2 semanas 24. Em cada inspeção atenção especial deve ser dada ao estado de alerta do animal através da avaliação da capacidade do animal para se mover ao redor da gaiola. Consumo de alimentos e água a partir do último período de observação, bem como a presença e consistência da matéria fecal também deve ser observado. A complicação pós-operatória comum é a desidratação isso é evidente pela retração lenta do pitada pele pele seguinte. Se isso for constatado entregar 1 ml de solução de Ringer com lactato sc por 1 semana ou até que os sintomas melhoram. No caso de animais machos, os órgãos genitais devem ser cuidadosamente observados para prolapso pênis identificado por vermelhidão no pênis. Se isso ocorrer aplicar gel mucol para o pênis do animal afetado, e entregar 1 ml de solução de Ringer com lactato sc por 1 semanaou até que os sintomas melhoram.
- Pesar animais diários para monitorar as alterações no peso corporal.
- No caso em que a injecção ip causou um pequeno rasgo no sistema gastrointestinal, infecção abdominal pode resultar. Portanto, avaliar a prsence de infecção do abdômen, evidente pelo abdômen distendido inchado. Tratar com a administração de Baytril na água drining por 3-4 dias ou até que os sintomas melhoram.
6. Parkinsoniana avaliação
Para estimar a extensão da lesão, a avaliação comportamental foi realizada 14-21 dias após a cirurgia 6-OHDA lesão, quando a quantidade de depleção de dopamina é máxima e estável 26.
- Após a injeção ip de 0,01 ml / g solução salina 0,9% estéril, ratos lugar em garrafas de vidro (11 cm x 9,5 cm) e gravar a sua actividade utilizando uma câmera de vídeo (CG9, Sanyo).
- Assistindo o vídeo, contar o número de rotações de 360 ° completos feitos tanto no ipsiversive e contraversive direcção em relação à lesão.
- O maior viés para o ipsiversive rotações, mais parkinsoniana o animal, assim, calcular a proporção de rotações ipsiversive como uma porcentagem da receita líquida (Contraversive e ipsiversive) comportamento rotacional.
7. Determinação do teor de dopamina do estriado por HPLC
- Pelo menos 21 dias após a cirurgia lesão 6-OHDA, e após a conclusão dos estudos comportamentais, sacrificar os camundongos por mais de doses de anestesia, e remova cuidadosamente o cérebro. Reter uma fatia de striatum (230 mm) a partir de cada hemisfério em cada rato, e encaixe congelamento imediatamente após seccionamento e armazenar a -80 ° C até preparação de amostras do estriado.
- O tampão de amostra de HPLC (0,1 M APC com 2 mM de glutationa) impede que a dopamina extraído das amostras do estriado de quebrar.
Para 100 ml de tampão de amostra:
= 100 ml grau HPLC de H2O
= 0,862 ml PCA (70%) (Sigma)
= 61,5 mg glutationa (reduzida)
Medir o grau HPLC H2O, adicionar a APC, dissolver o glutationa na solução, misturar bem e filtrar. O tampão de amostra pode ser armazenada a 4 ° C durante até 1 mês. - Descongelar fatias do estriado em gelo, em seguida homogeneizar em 200 uL de tampão de amostra usando um disruptor de células ultra-sons (Fisher Sonic, EUA). Manter as amostras em gelo em todos os momentos e homogeneizar cada amostra três vezes durante 10 segundos cada assegurar que as amostras são arrefecidos à temperatura ambiente entre os períodos de homogeneização.
- Anular 20 uL de cada amostra homogeneizada (armazenar a -80 ° C) durante um ensaio de proteína.
- Centrifugar as amostras (20.800 xg, 20 min (4 ° C, a Eppendorf 58 - 04R, EUA)), em seguida, remover o sobrenadante e filtrar através de um 0,2 uM PVDF membrana (Cat Pall, #: 1935-28143-310) e congelamento em -80 ° C até análise por HPLC. Reter a proteína como um pelete de back-se o ensaio de proteína.
- Preparação da fase móvel para a HPLC para executar through a coluna de HPLC.
Para 1 litro de fase móvel:
60 mM NaH 2 PO 4. H2O (monobásico) = 8,27 g
30 mM de ácido cítrico = 5,7 g
0,13 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) sal dissódico desidratar = 48 mg
0,16 mM de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) = 45 mg
850 ml de água de grau HPLC (Caledon, Cat #: 8801-7)
15% v / v de acetonitrilo-190 (pH 3,35) = 150 ml grau HPLC (Caledon, Cat #: 1401-7)
~ UL 2 de 10 M de NaOH (em HPLC H2O)
Todos os reagentes devem ser ≥ 99,0% puro e de qualidade para HPLC, sempre que possível. A água e acetonitrilo deve ser de grau HPLC. Fase móvel deve ser usado dentro de uma semana de preparação. Já dedicado objectos de vidro, limpo e agita-se barras de somente para a preparação de fase móvel (um cilindro de vidro 1 L de medição e, pelo menos, 2 frascos de vidro 1 L). Antes da preparação da fase móvel ter dois frascos contendo 1 L limpas preparado, um para fazer a solução em uma e transferi-la para durante a filtração e degassing. Permitir que a fase móvel a circular através da HPLC durante a noite e verificar que a linha de base é plana antes de usar. - Medir 700 ml de água de grau HPLC em um cilindro de vidro de medição e dissolver o. NaH 2 PO 4. H2O, ácido cítrico, EDTA e SDS nele Complete a água para 850 ml.
- Ajustar o pH a 3,35 utilizando NaOH 10 M, em seguida, adicionar o acetonitrilo e misturar a solução usando uma barra de agitação revestida de Teflon.
- Coloque uma barra de agitação no segundo frasco limpo L, vazia e um vácuo filtrar a fase móvel para ele através de um 0,22 um Millipore HVLP filtro: (Cat #: SLGP033RS). Molhar o filtro em 85:15 de H2O / ACN antes da filtração. Uma vez que a unidade móvel está totalmente filtrado, desgaseificar a fase móvel agitando-se sob vácuo durante pelo menos 10 min.
- Preparar as normas contra o qual a concentração de dopamina do estriado das amostras será medido. Os padrões são executados através da HPLC no início e no final de cada lote de amostras do estriado. Um 1mg / ml de solução stock de dopamina pode ser feita com antecedência e armazenado em alíquotas de 20 uL a -80 ° C. Para preparar a solução de reserva de dissolver 5 dopamina mg em 5 ml de tampão de amostra (ver acima) e misturá-lo completamente. Começar a preparar as normas tomando 5 uL de 1 mg / ml de solução concentrada, adicionando-a a 2,5 ml de tampão de amostra e misturando-o completamente para obter uma ug 2 / solução de dopamina ml.
- Quatro padrões são executados através da HPLC para produzir uma curva de concentração. Para as concentrações de dopamina são: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, e 12,5 ng / ml. A fim de gerar estes quatro concentrações de dopamina tomar 10 ul da solução de dopamina 2 ug / ml preparado no 7.10). e adicioná-lo a 190 ul de tampão de amostra para lhe dar uma de 100 ng / ml solução dopamina. Seguindo este efectuar uma diluição 1:01 de série do 100 ng / ml solução de dopamina com tampão de amostra. Simplesmente assumir 100 uL de 100 ng / ml e dopamina adicionar 100 uL de tampão de amostra e misturar para produzir 50 dopamina ng / ml, em seguida, tomar 10050 ul de dopamina ng / ml e adicionar 100 uL de tampão de amostra e misturar para produzir 25 ng / ml de dopamina e assim por diante.
- Para preparar o sistema de HPLC, (Waters bomba binária 1525μ, 717plus amostrador automático, Symmetry coluna C-18 de fase reversa (15 cm x 4,6 mm id, tamanho das partículas 5 micrómetros) (30 ° C), electroquímica detector (ESA Coulochem III) equipado com uma célula de eléctrodo duplo analítica (ESA 5011A) e controlada por um software Breeze (Waters)) de purga primeiro o sistema com a fase móvel através da selecção do protocolo de purga no software de computador ou seguindo as instruções do fabricante. Esta solução trocas todos anterior no sistema de HPLC com fase móvel fresco.
- Ajuste o potencial electroquímico a 400 mV e -300 mV para os primeiro e segundo eléctrodos, respectivamente. Após isso, o equilíbrio do sistema executando-lo por pelo menos 2 horas e, idealmente, durante a noite com a fase móvel a um caudal de 1 ml / min. Durante o equilíbrio das células deve ser ligado e re baseADing monitorado, quando a leitura torna-se estável o sistema está pronto para ser usado. Durante a primeira hora de equilibração deixar a fase móvel, que sai do sistema de ir para um recipiente waster, seguindo este pode permitir que a fase móvel para recircular através do sistema de HPLC, colocando o tubo de saída para o balão de fase móvel.
- Descongelar amostras do estriado em gelo, em seguida, injectar 20 uL de cada padrão de dopamina seguido por 2 x 20 uL de cada amostra e um uL mais 20 de cada padrão de dopamina no sistema de HPLC equilibrada com a taxa de fluxo da fase móvel a 1 ml / min.
- Use o software do sistema de HPLC para analisar a área dos picos de dopamina produzidos pelos padrões e amostras. Comparando a área dos picos de dopamina presentes nas amostras do estriado com a curva padrão de dopamina concentração irá identificar a quantidade de dopamina presente em 20 uL de cada amostra estriatal. Escale esse número até encontrar o presente dopamina total na fatia inteira estriatal.
- Perform um ensaio de proteína padrão no ul 20 de homogeneizado de estriado que você reserve em 7,4). Isto irá medir a quantidade de proteína presente nas amostras do estriado em mg / ml. A partir desta calcular a quantidade de dopamina no corpo estriado as amostras como um valor em ng / mg permitindo-lhe para comparar as concentrações de dopamina entre os hemisférios, e entre os ratos.
8. Os resultados representativos
Quinze a vinte e um dias após a cirurgia 6-OHDA lesão, quando a quantidade de morte celular causada pela neurotoxina atingiu completion26, medição de 360 ° espontânea rotações após a administração de solução salina (ip) 28 pode ser usado para avaliar o sucesso de 6 -OHDA lesionada (Figura 2). Este método de avaliação comportamental é simples e rápido, e evita efeitos de priming potenciais causados por agentes dopaminérgicos, como a anfetamina ou apomorfina desafios. Além disso, a avaliação da rotação espontânea é a melhor predictor de animais com <depleção de dopamina 95% em comparação com a colocação forelimb teste pata 27. Ao correlacionar os níveis de dopamina do estriado a partir de amostras do estriado (preparada após a conclusão dos estudos comportamentais utilizando HPLC) com uma percentagem da espontâneas rotações ipsiversive em cada animal, descobrimos que os animais que exibem 70% ou mais rotações ipsiversive em relação a lesão de 6-OHDA perderam> 95% de dopamina do estriado (Figura 3) 27. Após parciais 6-OHDA lesões induzidas (59,44 ± 17,20) (Figura 3) do feixe prosencéfalo medial, não houve viés de rotação entre ipsiversive contra os lados Contraversive quando se mede rotações espontâneas (40,91 ± 8,01) (Figura 2). Assim, como foi encontrado na sequência de 6-OHDA administração ao MFB em ratos, é possível provocar uma profunda perda de dopaminérgicos nigro-estriatal neurónios, e administração de solução salina (ip) é um método preciso para o rastreio da extensão de 6-OHDA lesão nestes animais.
Figura 1. Diagrama esquemático para demonstrar a montagem do aparelho de agulha de injecção para 6-OHDA lesão cirurgias.
Figura 2. Avaliação do comportamento rotacional em sham-operados e 6-OHDA ratos lesionados. Rotações espontâneas em ratos sham-operados e 6-OHDA lesionado. Os dados são apresentados como médias rotações percentuais ipsiversive ± EPM, onde líquido Contraversive e as rotações são ipsiversive 100%. Bares abertos: sham-operados animais; bares cinzentos: 6-OHDA lesionados animais com> perda de dopamina 95%, bares Preto: animais submetidos à cirurgia de 6-OHDA lesão que foram parcialmente lesados. *** P <0,001 comparado com o sham-operados animais. One-way ANOVA seguido pelo teste Dunn de comparação múltipla (s ham-operado: n = 17; 6-OHDA lesionada (> 95%): n = 23; parcial 6-OHDA lesão: n = 3).
Figura 3. Avaliação dos níveis de dopamina do estriado em sham-operado e 6-OHDA ratinhos lesionados usando HPLC. Teor de dopamina do estriado foi determinada no hemisfério operado e não operados de Sham e 6-OHDA lesionados animais. Os dados são apresentados como percentagem média ± SEM de níveis de dopamina do estriado no estriado não operados. Bares abertos: sham-operados animais; bares cinzentos: 6-OHDA lesionados animais com> perda de dopamina 95%, bares Preto: animais submetidos à cirurgia de 6-OHDA lesão que foram parcialmente lesados. *** P <0,001, ** P <0,01 comparado com o sham-operados animais. One-way ANOVA seguido pelo teste Dunn de comparação múltipla (sham-operado: n = 17, 6-OHDA lesionada (> 95%): n = 23, parciais de 6-OHDA lesão: n = 3).
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Figura 4. Avaliação da imunorreactividade tirosina hidroxilase no SNC em sham-operado e 6-OHDA ratinhos lesionados. Como um marcador de perda de células de dopamina na substância negra pars compacta (SNC), a perda da tirosina hidroxilase (TH) de imunoistoquímica positiva no hemisfério operado e não operados de Sham e 6-OHDA lesionados animais foi determinada como descrito no Thiele et al. In Press. Os dados são apresentados como percentagem média ± SEM de TH células positivas no estriado não operados. Bares abertos: sham-operados animais; bares cinzentos: 6-OHDA lesionados animais com> perda de dopamina 95%, bares Preto: animais submetidos à cirurgia de 6-OHDA lesão que foram parcialmente lesados. *** P <0,001, ** P <0,01 comparado com o sham-operados animais. One-way ANOVA seguido por empresas múltipla de DunnRison teste (sham-operado: n = 17, 6-OHDA lesionada (> 95%): n = 23, parciais de 6-OHDA lesão: n = 3).
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Discussion
Este protocolo descreve um método para a geração de um modelo de rato estável unilateral 6-OHDA lesionada da doença de Parkinson, que é extremamente reprodutíveis, com uma elevada taxa lesão sucesso, e uma baixa taxa de mortalidade. O sucesso de 6-OHDA cirurgia lesão pode ser facilmente estimada pela medição do comportamento rotacional espontânea com> rotações ipsiversive 70% indicativos de> depleção de dopamina 95% no striatum lesionada 27. Quantificação dos níveis de dopamina do estriado é a medida mais precisa da extensão da depleção de dopamina do estriado em comparação com quantificiation do número TH células positivas na substantia nigra pars compacta, porque fornece uma medição directa dos níveis de dopamina do estriado 28. Dado que este protocolo reproduz o local da injecção (MFB) e do comprimento do desenvolvimento da lesão (21 dias) do modelo de rato bem caracterizado unilateral 6-OHDA lesionada de 1,4 a doença de Parkinson, pode presumir-se thneste modelo de rato, como com o modelo de rato, recapitula as mudanças na farmacologia e circuitos do cérebro observada em pacientes com doença de Parkinson. Assim, o presente método proporciona um meio de produção de um modelo de sintomático da doença de Parkinson em ratinhos transgénicos. Dado que camundongos transgênicos são ferramentas extremamente poderosas para nos permitir compreender o papel de moléculas e proteínas in vivo no molecular, até o nível do tecido celular e todo, a combinação dessas duas técnicas vão ser extremamente útil em mais delineando os mecanismos moleculares e celulares geração subjacente dos sintomas da doença de Parkinson.
Cenci foi anteriormente descrito um método semelhante para gerar um rato 6-OHDA lesionada unilateral da doença de Parkinson, no entanto, esta foi associada com uma elevada taxa de mortalidade, com apenas 14% dos animais sobreviventes mais de 21 dias de injecção após a cirurgia a seguir, de 6 - OHDA na MFB 11. Existem vários poss vel explicações para a falta de mortalidade no protocolo descrito aqui. Em primeiro lugar, as coordenadas estereotáxicas escolhidos neste protocolo permitir que a agulha de injecção para evitar completamente o hipotálamo. Desde o hipotálamo do rato é tão pequena, qualquer dano a esta estrutura pode afetar os centros comendo e bebendo do mouse, fazendo com que o animal a perder peso e ficar desidratados e, finalmente, morrer. Em segundo lugar, no protocolo aqui descrito, a mesma concentração de 6-OHDA (3mg) foi utilizada como no estudo de Lundblad e colegas 11, no entanto, foi administrado em um volume menor (0,2 ml em comparação com 1 ml) com uma perfusão mais lenta taxa (em comparação com 0.1ml/min 0.5ml/min). A taxa de infusão de volume menor e mais lento garantir o mínimo de danos às estruturas vizinhas do MFB. Finalmente, o diâmetro da agulha de injecção é significativamente menor (0,33 vs 50mm), o que irá minimizar os danos para a estrutura do cérebro como a agulha viaja ventralmente através do cérebro.
ONTEÚDO "> Cenci também descritos outro método para gerar unilaterais 6-OHDA lesões, com 6-OHDA sendo injectado no corpo estriado 11. Como já foi descrito a seguir à injecção estriatal de 6-OHDA em ratos, isto resulta num nível mais baixo de perda de dopamina, que é mais variável entre ratinhos.Uma consideração final que deve ser tomado em consideração é o potencial efeito da estirpe de ratinhos. Tem sido bem documentada a estirpe tem um efeito dramático sobre o sucesso da depleção de dopamina após a administração sistémica de MPTP, que também provoca a morte celular selectiva da via dopaminérgica nigro-estriatal 29. Embora esta diferença entre as espécies não parece ocorrer em ratos após a 6-OHDA administração, é possível que ele pode ser um factor na determinação do sucesso de 6-OHDA lesão em murganhos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Assuntos Exteriores e Comércio Internacional (Governo do Canadá), Universidade de Toronto Connaught Fund, a Fundação Canadense para Inovação, NSERC, a Fundação Krembil e Confiança do Cure Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desipramine HCl | Sigma-Aldrich | D125 | 25mg/kg |
| pargyline HCl | Sigma-Aldrich | P8013 | 5mg/kg |
| 6-OHDA HBr | Sigma-Aldrich | H116 | 3mg / mouse |
| stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| mouse ear cups | Kopf Instruments | Model 921 Zygoma Ear Cups | |
| mouse incisor bar | Kopf Instruments | Model 923B | |
| mouse anaesthesia mask | Kopf Instruments | Model 923B | |
| priming kit (containing 250ml syringe) | Hamilton Co | PRMKIT 81120 | |
| RN compression fitting kit (1 mm) | Hamilton Co | 55750-01 | |
| PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) | Hamilton Co | 55751-01 | |
| dual small hub RN Coupler | Hamilton Co | 55752-01 | |
| luer to small hub RN adaptor | Hamilton Co | 55753-01 | |
| 1ml 25S syringe model 7001KH | Hamilton Co | 80100 | |
| *33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10035-20 | |
| Forcep | Fine Science Tools | 11608-15 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 02241315 | 2-3% |
| Suters (Vicryl 4.0) | Syneture | SS-683 | |
| Steriliser | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | PhD 22/2000 | |
| Needles (27G) | BD Biosciences | 305109 | |
| Needles (25G) | BD Biosciences | 305127 | |
| Syringes (1ml) | BD Biosciences | 309692 | |
| Anaesthesia trolley | LEI medical | M2000 | |
| Baytril | CDMV, St. hyacinthe, QC | 102207 | |
| Lidocaine | CDMV, St. hyacinthe, QC | 3914 | |
| Betadine solution | CDMV, St. hyacinthe, QC | 19955 |
References
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