Summary
En protokol til udførelse unilaterale 6-OHDA-læsioner i den mediale forhjernen bundtet i mus er beskrevet. Denne fremgangsmåde har en lav dødelighed (13,3%) med 89% af de overlevende dyr, som udviser> 95% tab af striatal dopamin og 90,63 ± -4,02% ipsiversive roterende forspænding mod den side af læsionen.
Abstract
Den ensidigt læderet 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-læderede rotte model af Parkinsons sygdom (PD), har vist sig at være uvurderlig i at fremme vores forståelse af de mekanismer, der ligger parkinson symptomer, da den redegør for de ændringer i basalganglierne kredsløb og farmakologi observeret i patienter med Parkinsons sygdom 1-4. Den nøjagtige cellulære og molekylære forandringer i cortico-striatale synapser i output pathways i striatum, som er den største bidrag region af basalganglierne forbliver uklar, og dette menes at være stedet, hvor patologiske afvigelser ligger parkinson symptomerne opstår 3 , 5.
I PD er forstå de mekanismer, der ligger ændringer i basalganglierne kredsløb efter degeneration af den nigro-striatale pathway i høj grad blevet fremført af udviklingen af bakterielle kunstige kromosomer (BAC)-mus over-udtrykker grønt fluorescerende proteiner, som drives af fremmers specifikke for de to striatale output veje (direkte vej: EGFP-D1 indirekte vej: EGFP-D2 og EGFP-A2a) 8, giver dem mulighed for at blive undersøgt i isolation. For eksempel har nylige undersøgelser antydet, at der er patologiske ændringer i synaptisk plasticitet hos Parkinson mus 9,10. Disse undersøgelser anvendes juvenile mus og akutte modeller af parkinsonisme. Det er uklart, om de beskrevne ændringer i voksne rotter med stabile 6-OHDA-læsioner forekommer også i disse modeller. Andre grupper har forsøgt at skabe et stabilt ensidigt-læderede 6-OHDA voksen musemodel af PD ved læsion af mediale forhjernen bundt (MFB), desværre dødeligheden i dette studie var ekstremt høj, med kun 14% overlever operationen for 21 dage eller længere 11. Nyere undersøgelser har genereret inden nigrale læsioner med både en lav dødelighed> 80% tab af dopaminerge neuroner, men ekspression af L-DOPA-induceret dyskinesi 11,12,13,14 var variabeli disse forsøg. Anden veletableret musemodel for PD er den MPTP-læderede mus 15. Mens denne model har vist sig nyttig ved vurderingen af potentielle neurobeskyttende midler 16, er mindre egnet til at forstå mekanismerne bag symptomer på PD, som det model ofte ikke at inducere motoriske mangler, og viser en bred variation i graden af læsionen 17, 18 .
Her har vi udviklet en stabil unilaterale 6-OHDA-læderede musemodel for PD ved direkte administrering af 6-OHDA i MFB, som konsekvent forårsager> 95% tab af striatal dopamin (som målt ved HPLC) såvel som fremstilling af adfærdsmæssige ubalancer observeret i velkarakteriserede unilaterale 6-OHDA-læderede rottemodel for PD. Denne nyudviklede musemodel af PD vil vise sig et værdifuldt værktøj til at forstå de mekanismer, der ligger generation af Parkinsons symptomer.
Protocol
1. Boliger og forberedelse af mus
- Oprethold en koloni af bakteriel kunstigt kromosom (BAC) drevet transgene mus 8 (Mutant Mouse Regional Resource Center (MMRRC) FVB i en 12:12 h lys-mørke cyklus med fri adgang til mad og vand. Disse mus er rene FVB mus, og Det er ikke nødvendigt at krydse disse mus med en anden stamme, enten til avl, eller for at sikre vellykket 6-OHDA læsion procedure.
- For at generere et parkinsonlignende model er voksne mus i alderen postnatal dag 31-42 (P31-42), der kræves for 6-OHDA-læsioner og fingeret operationer.
- At reducere risikoen for infektion, administrere Baytril (antibiotikum) i drikkevandet i 24 timer før kirurgi.
2. Udarbejdelse af lægemidler til kirurgi
En præmedicinering for desipramin og pargylin sædvanligvis administreres til gnavere før injektion af 6-hydroxydopamin (6-OHDA) at øge selektiviteten og efficacy af 6-OHDA-inducerede læsioner. Noradrenalin / 5HT uptake-inhibitor, desipramin reducerer 6-OHDA-inducerede noradrenalin og 5HT depletion 22, mens monoaminoxidaseinhibitor, forøger pargylin følsomhed af dopaminerge terminaler til 6-OHDA, ved at reducere ekstrasynaptiske nedbrydning af 6-hydroxydopamin 31.
- Præmedicineringen (desipramin-hydrochlorid (HCl) og pargylin HCl) kan fremstilles i store mængder og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Afvej en passende mængde af desipramin HCl at forsyne hver enkelt mus med 25 mg / kg for det antal dyr, som modtager kirurgi på denne dag. Den lave vægt af muse gør det svært at levere små volumener nøjagtigt, således fremstille desipramin-hydrochlorid i en koncentration på 2,5 mg / ml og administreret til dyret ved 10 ml / kg. Vægten af saltbestanddelen af forbindelsen skal tages hensyn til, således at den korrekte koncentration opnås. Korrektion for vægten afHCl-salt i desipramin hydrochlorid: Molekylvægt (MW) af desipramin HCl: 302,84 MW HCl: 36,46 MW af fri base: 266,38 Korrektionsfaktor: 302,84 / 266,38 = 1,137 for 10 ml opløsning: = 2.5mg/ml desipramin x 10,0 ml x Korrektionsfaktor = 2.5mg/ml x 10,0 ml x 1,137 = 28.43mg af desipramin hydrochlorid
- Afvej den passende mængde af pargylin HCl at forsyne hver mus med 5mg/kg til antallet af dyr, der modtog kirurgi, dag. Korrigere for saltbestanddelen af forbindelsen som beskrevet ovenfor. Den lave vægt af muse gør det svært at levere små volumener nøjagtigt, således fremstille pargylinhydrochlorid i en koncentration på 0,5 mg / ml og administreres til dyret på 10 ml / kg.
Korrigere for vægten af HCl-saltet i pargylinhydrochlorid:
MW pargylin HCl: 195,69 MW HCl: 36,46
MW fri base: 159,23 Korrektionsfaktor: 195,69 / 159,23 = 1,229
For 10 ml af opløsning afvejes: <br /> = 0,5 mg / ml pargylin x 10,0 ml x Korrektionsfaktor
= 0,5 mg / ml x 10,0 ml x 1,229
= 6.15mg af pargylinhydrochlorid - Kombiner 28.43mg desipramin HCI og 6.15mg pargylin HCI i et 10 ml glas-måleglas, og der tilsættes 8 ml sterilt saltvand (0,9%). Vortex, og opvarmes til 45 ° C, indtil blandingen er opløst. PH af opløsningen vil nu blive omkring 3, som hvis de administreres til mus vil forårsage ubehag og post-operative komplikationer omfatter urin-og mave-tarmkanalen funktion. Tilsættes dråber NaOH (1 M) indtil pH er 7,4. Fyld op for lyden til 10 ml med sterilt saltvand (0,9%), og vortex. Label, dato og fryse på ~ 80 ° C. Idet pargylin HCl ikke er opløselig i saltvand ved stuetemperatur, under hele den kirurgiske periode opbevares præmedicinering blandingen i et vandbad opvarmet til 37 ° C i operationsstuen.
- Opløsninger af 6-OHDA skal fremstilles umiddelbart før kirurgi. Køretøjet anvendes til at opløse 6-OHDA-hydrobromid (6-OHDA.Br) opløsning steril saltopløsning (0,9%)-opløsning indeholdende ascorbinsyre (0,2%). Ascorbinsyre er nødvendig for at stabilisere 6-OHDA.Br, da det forhindrer oxidation af 6-OHDA.Br til en inaktiv form. Afvejes 0,2 g ascorbinsyre, og derefter tilsættes til en tom en L måleglas, top til 1 l med sterilt saltvand (0,9%) og omrøres. Label, dato, og opbevar ved ~ 80 ° C indtil brug.
- Afvej en passende mængde af 6-OHDA.HBr at foretage en 15,0 mg / ml opløsning til at forsyne hver enkelt mus med 3,0 ug. Da 6-OHDA.Br er lys og varme følsomme undgå udsættelse for lys, og anbring på is før vejning.
Korrigere for vægten af HBr-saltet i 6-OHDA.HBr:
MW af 6-OHDA.HBr: 250,09 MW HBr: 79,9 MW af fri base: 170,19
Korrektionsfaktor: 250,09 / 170,19 = 1,47
For 0,5 ml af opløsningen afvejes:
= 15,0 mg / ml 6-OHDA x 0,5 ml x Korrektionsfaktor
= 15,0 mg / ml 6-OHDA x 0,5 ml x 1,47
= 11,03 mg 6-OHDA.HBr - For sham-opererede dyr, udgør en ækvivalent mængde vehikel (sterilt saltvand (0,9%), ascorbinsyre 0,02% pH 7,4) til den, der 6-OHDA-læderede dyr modtager, og anbringes i en 1,0 ml sterilt pakket rør i sølvpapir, etiket og sted straks på is indtil brug.
3. Opsætning af kirurgiske apparater
Kirurgiske værktøjer skal steriliseres ved hjælp af en autoklave forud to kirurgi. Mellem hver funktion, skal kirurgiske værktøj skal steriliseres i 95% ethanol efterfulgt af opvarmning til 250 ° C i 2 minutter. Alle forsøg skal udføres i overensstemmelse med de retningslinjer for de relevante Animal Care udvalg af tilknyttede institution og land.
- Rengør alle overflader og udstyr med isopropylalkohol før opsætning af udstyr. Brug sterile handsker ved håndtering af rent kirurgisk udstyr.
- Set-up en mus opsving bur med papirservietter på basen. Sted under en varmelampe eller oven på en opvarmet pude.
- Opsæt anæstesi vognen, sikre, at ilt indstrømningen er tilsluttet og åben, og isofluran reservoiret er helt fuld. Indstille oxygen flowet til 1 l / min, og isofluran til 2-4%. Ideelt vil der være to udadgående porte fra anæstetiske maskinen til tildeling af oxygen isofluran blandingen til en induktion kammer, samt vedligeholdelse, medens dyret er i stereotaktisk ramme.
- Correct samling af infusionsapparatet, er kritisk for at sikre en vellykket læsioner, som indesluttet luft eller blokerede nåle formindsker mængden af 6-OHDA infuseret ved læsionsstedet. Samle infusionsapparatet som vist i figur 1. Gevind en RN nut på den ene side af PEEK slangen (RN kompression kit (fitting 1/16 th inch)), efterfulgt af PEEK bæger rørringen, så den kanoniske PFA rørringen. Orientere rørringe, således at konussen på kanoniske PFA rørringen vil glide ind i den samvirkende del af PEEK koppen ferul. Sted til det dobbelte lille hub RN kobling (# 1), sikre, at forbindelsen er tæt. På den anden ende af det dobbelte lille nav RN kobler indsætte 33 gauge injektionsnål. Før nålen gennem en af de RN metal nødder og spænd. Sikre 33 gauge nål er en 180 ° vinkel i forhold til to små navet RN kobler (# 1). På den anden ende af PEEK rør, tråd én af RN metal møtrikker efterfulgt af en PEEK rørring, PFA derefter ferul. Indsæt nut ennd bøsningsenhed ind i en anden dobbelt lille hub RN kobling og stram tilslutningen. På den anden ende af en anden lille dobbelt RN hub kobling (# 2) Sæt luer til lille hub RN adapter (luer adapter), og spænd forbindelsen.
- Dernæst infusionsapparatet primes (se figur 1). Fylde 250 pi og 1,0 ul Hamilton sprøjter med sterilt vand, sikres der ingen luftbobler. Fastgøre 250 pi sprøjten til luer adapteren og nedtrykke stemplet i 250 pi sprøjten, således at vand frigives gennem 33 gauge injektionsnål på den anden ende af røret. Fortsæt skubbe vand gennem systemet, medens trækker 250 ul sprøjten ud af luer adapteren, hvilket efterlader et lille vand vulst på enden af luer adapteren. Nedtrykke stemplet i 1,0 ul sprøjten, indtil en lille vand perle udstødes. Sæt forsigtigt 1,0 gl sprøjten i luer adapteren, skal du sørge for at vandet perle på 1,0 gl sprøjten forbinder med vand perle nuværende on luer adapteren, og helt indsætte 1,0 gl sprøjten i luer adapteren. Sikre, at ingen bobler i den lille dobbelte RN hub kobling.
- Nu, at systemet er primet, kan perfusion apparatet fastgjort til stereotaktisk ramme og infusionspumpe. Fastklemme lille dobbelte RN nav kobler med 33 gauge injektionskanyle forbundet med manipulatorarm af stereotaktisk ramme, så klemme 1,0 pi sprøjten til perfusion, således at når perfusion begynder sprøjten presses mod klemmen og kan ikke bevæge sig. Programmet infusionspumpen for at tillade en infusionshastighed på 0,1 ul / min.
4. Unilaterale 6-OHDA læsion kirurgi
- Tredive minutter før operationer, vejer hvert dyr, og massen noteres. Systemisk administration desipramin-hydrochlorid (2,5 mg / ml, Sigma Aldrich) og pargylinhydrochlorid (0,5 mg / ml, Sigma Aldrich) (0,9% sterilt saltvand, pH 7,4) ved 10 ml / kg ved intraperitoneal injektion (ip) med en musved anvendelse af en 27 g nål fastgjort til en 1 ml sprøjte. For eksempel ville en 30,0 g mus modtager 300 pi præmedicinering. Varm op for varmen disken og placere dette under øret og fortand bar. Den varme skive vil hjælpe til at holde temperaturen af dyret under kirurgi og holde dyret i en ideel højde til at passe i øret og fortand tremmer stereotaktisk ramme.
- Femten minutter efter indgivelse af desipramin HCI og pargylin HCI-opløsning, den placeres i et lukket anæstesi kammer, og anesthetise dyret med isofluran inhalation (2-3% i O2). Dyret er tilstrækkeligt bedøvet, når det viser noget svar på bagben pinch og ingen blinker.
- Barber toppen af musens hoved, og anvende den aktuelle smertestillende lidokain direkte på huden ved hjælp af vat. Fem minutter efter lidocain ansøgning, sterilisere hovedet af dyret med betadinopløsning.
- Sende dyret i en stereotaktisk ramme indrettet til mus. For det første sende dyret i incisivus stænger (fortandsstangen indstilling: -3,0 til 2,0 mm) med anæstesi masken placeret over overfladen af dyret. Justere oxygen flowet til 1 l / min, og isofluran til 1,5-2%. Den fortand bar skal være på et niveau i forhold til de ørekopper, således at toppen af kraniet er plan. Sæt ørekopper (diameter 5,0 mm). De ørekopper er blevet indsat korrekt, når hovedet er helt flad, og ikke kan flyttes i begge retninger.
- Skåret langs midterlinien af huden på toppen af hovedet af musen med et skalpelblad og trække huden. Tørre overflade af kraniet ved gaze.
- Skubbes ned stemplet i 1,0 ul sprøjten, og anbring 33 gauge injektionsnål ind i 1 ml rør dækket med aluminiumsfolie indeholdende 6-OHDA-opløsning (15 mg / ml). Trække tilbage langsomt på stemplet i 1,0 ul sprøjten samtidig med at 33 gauge injektionskanyle nedsænket i 6-OHDA-opløsning (15 mg / ml).
- Skabe en 1 cm incision langs midtenlinie af kraniet. Før spidsen af kanylen mod Bregma, dispensere en lille mængde af 6-OHDA-opløsningen fra 33 gauge kanyle til dannelse af en lille perle. Langsomt sænke injektion nålespidsen til Bregma, når vulsten rører Bregma standse fremføring af spidsen af nålen og optage disse koordinater. Tilbagetrække kanylen 2 mm i den dorsale retning og bevæger sig langs den sagittale sutur i en rostral caudal retning lambda. Fremføre en lille mængde 6-OHDA-opløsningen fra 33 gauge kanyle til dannelse af en lille perle. Langsomt sænke injektion nålespidsen til Lambda, når vulsten kontakter Lambda standse fremføring af spidsen af nålen og optage disse koordinater. Den mediale laterale (ML), og dorsale ventrale (DV) koordinater skal være ens for Bregma og Lambda, hvis de ikke er, justere fortandsstangen derfor til AP koordinater, og øre barer for ML koordinater. Flyt nålen koordinerer AP: -1,2 mm, ML: -1,1 mm i forhold til Bregma i henhold til Mouse Brain Atlas stereotaxisk Koordinater 25. Trække nålen og burr et hul i kraniet ved hjælp af en 25 gauge nål.
- Retur kanylen til ovenstående koordinater, og indfør nålen til DV:-5mm. Tilføre 0,2 ul af 6-OHDA eller vehikel ensidigt i midterplanet forhjernen bundt med en hastighed på 0,1 ul / min (3 ug totalt). Efter afslutning af administration af 6-OHDA eller vehikel, efterlader kanylen på plads i yderligere fem minutter for at tillade diffusion bort fra injektionsstedet.
- Langsomt trækkes nålen.
- Lukke snittet på hovedbunden med tre suturer, og leverer 1 ml Ringer-lactatopløsning subkutant (sc).
- Fjern dyret fra stereotaktisk ramme, og lejres i aflåst buret indtil bevidstheden er genvundet.
5. Postoperativ pleje af 6-OHDA-læderede dyr
- Placer dyr i bure (3 mus / bur) og giver fri adgang til mad og sugared vand (10 mM). Giv Nutra-gel og KMR (killing mælk udskiftning) i fødevarer containere på gulvet i buret til at stimulere appetitten og gastrointestinale motilitet.
- Efterse mus daglige post-operation for 2 uger 24. Ved hver inspektion særlig opmærksomhed bør rettes mod årvågenhed af dyret ved at vurdere evnen af dyret til at bevæge sig rundt i buret. Mad og vand indtag fra sidste observationsperiode, samt tilstedeværelse og konsekvens i fecal sagen skal også overholdes. En almindelig postoperativ komplikation er dehydrering det er tydeligt ved langsom tilbagetrækning af huden efter huden knivspids. Hvis dette observeres levere 1 ml Ringer-lactat opløsning fm i 1 uge eller indtil symptomerne forbedres. I tilfælde af handyr, bør kønsdelene overvåges nøje penis prolaps identificeret ved rødme af penis. Hvis dette sker anvendelse mucol gel til penis af det inficerede dyr og levere 1 ml Ringer-lactatopløsning sc for 1 ugeeller indtil symptomerne forbedres.
- Afvejes dyr dagligt at overvåge ændringer i kropsvægt.
- I det tilfælde, hvor IP-injektion har medført en lille revne i det gastrointestinale system, kan abdominal infektion resultere. Derfor vurderer for prsence af infektion i maven, viser sig ved hævede udspilet mave. Behandl ved at administrere Baytril i drining vand i 3-4 dage eller indtil symptomerne forbedres.
6. Parkinson vurdering
At estimere omfanget af læsion, blev adfærdsmæssige vurdering udført 14-21 dage efter 6-OHDA-læsioner kirurgi, når mængden af dopaminudtømning er maksimal og stabil 26.
- Efter ip injektion af 0,01 ml / g 0,9% sterilt saltvand, optage plads mus i glascylindre (11 cm x 9,5 cm) og deres aktivitet under anvendelse af et videokamera (CG9, Sanyo).
- Se videoen, antallet af hele 360 ° omdrejninger foretaget i både ipsiversive og contrav tælleersive retning i forhold til læsionen.
- Jo større forskydning i retning ipsiversive rotationer, jo mere parkinson dyret, således beregne andelen af ipsiversive rotationer som en procentdel af net (contraversive og ipsiversive) rotationsadfærd.
7. Bestemmelse af striatal dopamin ved HPLC
- Mindst 21 dage efter den 6-OHDA læsion kirurgi, og ved afslutningen af de adfærdsmæssige undersøgelser, ofre musene af over-dosis af anæstesi, og fjern forsigtigt hjernen. Bevarer en skive af striatum (230 um) fra hver hemisfære i hver mus, og snap fryse umiddelbart efter sektionering og opbevares ved -80 ° C indtil fremstillingen af striatale prøver.
- HPLC-prøvebuffer (0,1 M PSA med 2 mM glutathion) forhindrer dopamin ekstraheret fra striatale prøver fra bryder sammen.
Til 100 ml prøvepuffer:
= 100 ml HPLC-kvalitet H2O
= 0,862 ml PSA (70%) (Sigma)
= 61,5 mg glutathion (reduceret)
Afmåle den HPLC-kvalitet H2O tilsættes PSA, opløse glutathion i opløsningen, blandes godt og filtreres. Prøvebufferen kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned. - Optø striatale skiver på is, derefter homogeniseres i 200 pi prøve buffer under anvendelse af en ultrasonisk Cell Disrupter (Fisher Sonic, USA). Holde prøverne på is hele tiden og homogenisere hver prøve tre gange i 10 sekunder hver sikre, at prøverne lov til at køle ned mellem homogenisering perioder.
- Afsat 20 ul af hver homogeniseret prøve (opbevares ved -80 ° C) i et protein-assay.
- Centrifuger prøver (20.800 xg, 20 min (4 ° C, Eppendorf 58 - 04R, USA)), og fjern derefter supernatanten og filtreres gennem et 0,2 um PVDF-membran (Pall, Cat #: 1935-28143-310) og fryse på -80 ° C indtil HPLC-analyse. Bevarer proteinpellet som en back-up for proteinassay.
- Fremstillinq af den mobile fase til HPLC for at køre through HPLC-søjlen.
For en L af mobil fase:
60 mM NaH 2PO 4. H2O (monobasisk) = 8,27 g
30 mM citronsyre = 5,7 g
0,13 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) dinatriumsalt dehydrere = 48 mg
0,16 mM natriumdodecylsulfat (SDS) = 45 mg
850 ml HPLC-kvalitet vand (Caledon, Cat #: 8801-7)
15% v / v acetonitril-190 (pH 3,35) = 150 ml HPLC-kvalitet (Caledon, Cat #: 1401-7)
~ 2 pi af 10 M NaOH (i HPLC-kvalitet H2O)
Alle reagenser skal være ≥ 99,0% ren og af HPLC-kvalitet så vidt muligt. Vand og acetonitril være HPLC-kvalitet. Mobile fase skal anvendes inden for en uge efter fremstilling. Har dedikeret, rene glas og rør barer udelukkende til udarbejdelse af mobile fase (en 1 L glas måleglas og mindst 2 1 L glasflasker). Før fremstilling af mobile fase har to rene 1 L kolber fremstilles et til at gøre opløsningen ind og en overføre det til under filtrering og degassing. Tillader den mobile fase for at cirkulere gennem HPLC natten over og kontrollere, at basislinjen er fladt før anvendelse. - Afmål 700 ml HPLC-kvalitet vand i et glas måleglas og opløses NaH 2PO 4. H2O, citronsyre, EDTA og SDS i det. Påfyldning af vand til 850 ml.
- PH indstilles til 3,35 med 10 M NaOH, og tilsæt derefter acetonitril og bland opløsningen under anvendelse af en Teflon-overtrukket rørestang.
- Sætte en omrørerstav i den anden ren, tom 1 l kolbe og vakuum filtrere den mobile fase ind i den gennem et 0,22 um HVLP Millipore-filter (Cat #: SLGP033RS). Fugte filteret i forholdet 85:15 H2O / ACN før filtrering. Når den mobile er fuldt filtreres, den mobile fase afgasses ved omrøring under vakuum i mindst 10 min.
- Fremstille de standarder, mod hvilken dopamin koncentrationen af striatale prøver måles. Standarder køres gennem HPLC ved begyndelsen og slutningen af hver batch af striatale prøver. A 1mg / ml stamopløsning af dopamin kan fremstilles i forvejen og opbevares i 20 ul alikvoter ved -80 ° C. For at forberede stamopløsning opløses 5 mg dopamin i 5 ml prøve buffer (se ovenfor), og bland det grundigt. Begynde at forberede de standarder under 5 ul af 1 mg / ml stamopløsning, tilsætte den til 2,5 ml prøvebuffer og blande grundigt til opnåelse af en 2 mg / ml dopamin opløsning.
- Fire standarder køres gennem HPLC til frembringelse af en koncentrationskurve. For dopamin koncentrationer er følgende: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml og 12,5 ng / ml. For at generere disse fire koncentrationer af dopamin tage 10 ul af 2 ug / ml dopamin-opløsning fremstilles i 7,10). og føje det til 190 ul prøvebuffer at give dig en 100 ng / ml dopamin-løsning. Efter denne udføre en 01:01 seriefortynding af 100 ng / ml dopamin opløsning med prøvepuffer. Blot tage 100 pi 100 ng / ml dopamin, og der tilsættes 100 ul prøvebuffer og blandes til fremstilling af 50 ng / ml dopamin tag 100pi 50 ng / ml dopamin, og der tilsættes 100 ul prøvebuffer og blandes til fremstilling af 25 ng / ml dopamin og så videre.
- Til fremstilling af HPLC-system (Waters 1525μ Binært pumpe, 717plus autosampler, Symmetry C-18 revers-fase-søjle (15 cm x 4,6 mm id, 5 um partikelstørrelse) (30 ° C), elektrokemisk detektor (ESA Coulochem III) er udstyret med en dobbelt elektrode analytisk celle (ESA 5011A) og kontrolleres af Breeze software (Waters)) først rense systemet med mobil fase ved at vælge rensestrømmen protokol i computersoftware eller ved at følge producentens instruktioner. Denne udveksling alle tidligere løsning på HPLC-system med frisk mobil fase.
- Indstilles elektrokemiske potentialer på 400 mV og -300 mV for de første og anden elektroder hhv. Derefter systemet i ligevægt ved at køre det mindst 2 timer og ideelt natten over med den mobile fase ved en strømningshastighed på 1 ml / min. I ligevægt cellerne skal være tændt og baseline reading overvåges, når læsningen bliver stabil systemet er klar til brug. For den første time af ækvilibrering lade den mobile fase, der forlader systemet går ind i en waster beholder, efter at dette kan give den mobile fase for at recirkulere gennem HPLC-systemet ved at udløbet slangen i den mobile fase kolben.
- Optø striatale prøverne på is og derefter injicere 20 ul af hver dopamin standard efterfulgt af 2 x 20 ul af hver prøve, og yderligere 20 ul af hver dopamin standard i ækvilibreret HPLC-system med den mobile fase strømningshastighed på 1 ml / min.
- Anvende HPLC-system software til at analysere det område af dopamin toppe produceret af standarder og prøver. Sammenligning af arealet af dopamin toppe til stede i de striatale prøver til standard dopamin koncentrationskurve vil identificere mængden af dopamin til stede i 20 ul af hver striatal prøve. Skalere dette tal op for at finde den totale dopamin stede i hele striatale skive.
- Perform en standard proteinanalyse på 20 ul striatal homogenat, at du afsætter i 7,4). Dette vil måle mængden af protein til stede i de striatale prøverne i mg / ml. Fra denne beregne mængden af dopamin i de striatale prøverne som en værdi i ng / mg giver dig mulighed for at sammenligne dopamin koncentrationer mellem halvkugle og mellem mus.
8. Repræsentative resultater
Femten til tyve dage, efter 6-OHDA-læsioner kirurgi, når mængden af celledød forårsaget af neurotoksinet har nået completion26, måling af spontan 360 ° omdrejninger efter administration af saltvand (ip) 28 kan anvendes til at vurdere succesen af 6 -OHDA-læderede (figur 2). Denne fremgangsmåde til adfærdsmæssige vurdering er enkel og hurtig og undgår de potentielle priming virkninger ved dopaminerge midler såsom amfetamin eller apomorfin udfordringer. Desuden spontan rotation vurdering er en bedre predictor af dyr med <95% dopaminudtømning forhold til forben pote indplaceringstest 27. Ved at korrelere striatale dopamin-niveauer fra striatale prøver (fremstillet ved afslutningen af adfærdsmæssige forsøg med HPLC) med procentdelen af spontane ipsiversive rotationer i hvert dyr, har vi fundet, at dyr, som udviser 70% eller derover ipsiversive omdrejninger mod 6-OHDA læsion har mistet> 95% striatale dopamin (fig. 3) 27. Efter delvis 6-OHDA-inducerede læsioner (59,44 ± 17,20) (figur 3) af den mediale forhjernen bundtet var der ingen rotationshastighed forspænding mellem ipsiversive versus contraversive sider ved måling spontane rotationer (40,91 ± 8,01) (figur 2). Således, som det er blevet fundet efter 6-OHDA administration til MFB i rotter, er det muligt at bevirke en kraftig tab af dopaminerge nigro-striatale neuroner, og saltvand administration (ip) er en nøjagtig metode til screening af omfanget af 6-OHDA læsion i disse dyr.
Figur 1. Skematisk diagram til at vise konstruktionen af injektionsnålen apparat til 6-OHDA-læsioner operationer.
Figur 2. Vurdering af roterende adfærd i skinopererede og 6-OHDA læderede mus. Spontane rotationer i sham-opererede og 6-OHDA-læderede mus. Dataene er præsenteret som middelværdier procentvise ipsiversive rotationer ± SEM, hvor nettet contraversive og ipsiversive rotationer er 100%. Åbne stænger: sham-opererede dyr; Grå stænger: 6-OHDA-læderede dyr med> 95% dopamin tab; sorte bjælker: dyr, der undergik 6-OHDA-læsioner kirurgi, blev delvist læderet. *** P <0,001 sammenlignet med sham-opererede dyr. Envejs ANOVA efterfulgt af Dunns multiple sammenligningstest (s skinke betjent: n = 17; 6-OHDA-læderede (> 95%): n = 23; delvis 6-OHDA-læsioner: n = 3).
Figur 3. Vurdering af striatale dopaminniveauer i skinopererede og 6-OHDA læderede mus ved anvendelse af HPLC. Striatale dopaminindhold blev bestemt i den opererede og ikke-opererede halvkugle af sham-og 6-OHDA-læderede dyr. Dataene er præsenteret som gennemsnit procent ± SEM af striatale dopaminniveauer i ikke bevæges striatum. Åbne stænger: sham-opererede dyr; Grå stænger: 6-OHDA-læderede dyr med> 95% dopamin tab; sorte bjælker: dyr, der undergik 6-OHDA-læsioner kirurgi, blev delvist læderet. *** P <0,001, ** P <0,01 sammenlignet med sham-opererede dyr. Envejs ANOVA efterfulgt af Dunns multiple sammenligningstest (skinopererede: n = 17, 6-OHDA-læderede (> 95%): n = 23, delvis 6-OHDA-læsioner: n = 3).
EAK ">
Figur 4. Vurdering af tyrosinhydroxylase immunreaktivitet i SNC i skinopererede og 6-OHDA læderede mus. Som en markør af dopamin celletab i substantia nigra pars compacta (SNC), tab af tyrosinhydroxylase (TH) positiv immunohistochemisty i den opererede og ikke-opererede halvkugle af sham-og 6-OHDA-læderede dyr blev bestemt som beskrevet i Thiele et al. In Press. Dataene er præsenteret som gennemsnit procent ± SEM af TH-positive celler i ikke bevæges striatum. Åbne stænger: sham-opererede dyr; Grå stænger: 6-OHDA-læderede dyr med> 95% dopamin tab; sorte bjælker: dyr, der undergik 6-OHDA-læsioner kirurgi, blev delvist læderet. *** P <0,001, ** P <0,01 sammenlignet med sham-opererede dyr. Envejs ANOVA efterfulgt af Dunns multiple virksomRison test (skinopererede: n = 17, 6-OHDA-læderede (> 95%): n = 23, delvis 6-OHDA-læsioner: n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskrives en fremgangsmåde til generering af en stabil unilaterale 6-OHDA-læderede musemodel af Parkinsons sygdom, hvilket er meget reproducerbar, med en høj læsion succesrate, og en lav dødelighed. Succes 6-OHDA læsion kirurgi kan let vurderes ved måling af spontan roterende adfærd med> 70% ipsiversive omdrejninger indikative på> 95% dopaminudtømning i den læderede striatum 27. Kvantificering af striatale dopaminniveauer er den mest nøjagtige måling af omfanget af striatal dopamin udtømning sammenlignet quantificiation af antal TH-positive celler i substantia nigra pars compacta, da det giver en direkte måling af striatale dopaminniveauer 28. Idet denne protokol gengiver injektionsstedet (MFB) og længden af læsionsudvikling (21 dage) af velkarakteriserede unilaterale 6-OHDA-læderede rottemodel for Parkinsons sygdom 1,4, kan det antages thpå denne musemodel, som med rotte-modellen, ændringer i farmakologi og hjerne kredsløb rekapitulerer observeret hos patienter med Parkinsons sygdom. Således denne fremgangsmåde tilvejebringer et middel til at frembringe en symptomatisk model af Parkinsons sygdom i transgene mus. I betragtning af at transgene mus er meget stærke værktøjer til at tillade os at forstå betydningen af molekyler og proteiner in vivo på molekylært, igennem til den cellulære og hele vævsniveau, at kombinere disse to teknikker vil vise sig særdeles nyttige i yderligere afgrænse de molekylære og cellulære mekanismer underliggende generering af symptomer på Parkinsons sygdom.
Cenci har tidligere beskrevet en lignende fremgangsmåde til frembringelse af et unilaterale 6-OHDA-læderede mus af Parkinsons sygdom, men denne forbundet med en høj dødelighed, med kun 14% af dyrene overlever mere end 21 dage efter kirurgi efter injektion af 6 - OHDA i MFB 11. Der er adskillige POSS ible forklaringer for den manglende dødelighed i protokollen beskrevet her. Første, det stereotaksiske koordinater valgt i denne protokol tillader kanylen helt at undgå hypothalamus. Idet musehypothalamus er så lille, kan beskadigelse af dette struktur påvirke spise og drikke centre i mus, hvilket dyret at tabe og bliver dehydreret, og sidst dør. For det andet, i protokollen beskrevet her, blev den samme koncentration af 6-OHDA (3 mg) anvendes som i undersøgelse af Lundblad og kolleger 11, men blev administreret i et mindre volumen (0,2 ml sammenlignet med 1 ml) med en langsommere infusion hastighed (0.1ml/min forhold til 0.5ml/min). Den mindre volumen og lavere infusionshastighed sikre minimal skade på strukturer, der omgiver MFB. Endelig diameter af kanylen er signifikant mindre (0,33 vs 50mm), hvilket vil minimere skade på hjernen struktur nålen bevæger ventralt gennem hjernen.
ontent "> Cenci er også beskrevet en anden fremgangsmåde til generering unilaterale 6-OHDA-læsioner, med 6-OHDA blev injiceret i striatum 11. Som beskrevet efter striatale injektion af 6-OHDA i rotter, resulterer dette i en lavere dopamin tab, som er mere variabel mellem mus.En afsluttende behandling, der skal tages i betragtning, er den potentielle virkning af stamme af mus. Det er blevet veldokumenteret stammen har en dramatisk virkning på vellykket dopaminudtømning efter systemisk administration af MPTP, hvilket også forårsager selektiv celledød af dopaminerge nigro-striatale pathway 29. Medens denne forskel mellem arter ikke synes at forekomme i rotter efter 6-OHDA administration, er det muligt, at det kan være en faktor til bestemmelse af succes 6-OHDA læsion hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Institut for udenrigsanliggender og international handel (Canadas regering), University of Toronto Connaught fond, den canadiske Institut for Innovation, NSERC, den Krembil Foundation og Cure Parkinsons Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desipramine HCl | Sigma-Aldrich | D125 | 25mg/kg |
| pargyline HCl | Sigma-Aldrich | P8013 | 5mg/kg |
| 6-OHDA HBr | Sigma-Aldrich | H116 | 3mg / mouse |
| stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| mouse ear cups | Kopf Instruments | Model 921 Zygoma Ear Cups | |
| mouse incisor bar | Kopf Instruments | Model 923B | |
| mouse anaesthesia mask | Kopf Instruments | Model 923B | |
| priming kit (containing 250ml syringe) | Hamilton Co | PRMKIT 81120 | |
| RN compression fitting kit (1 mm) | Hamilton Co | 55750-01 | |
| PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) | Hamilton Co | 55751-01 | |
| dual small hub RN Coupler | Hamilton Co | 55752-01 | |
| luer to small hub RN adaptor | Hamilton Co | 55753-01 | |
| 1ml 25S syringe model 7001KH | Hamilton Co | 80100 | |
| *33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10035-20 | |
| Forcep | Fine Science Tools | 11608-15 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 02241315 | 2-3% |
| Suters (Vicryl 4.0) | Syneture | SS-683 | |
| Steriliser | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | PhD 22/2000 | |
| Needles (27G) | BD Biosciences | 305109 | |
| Needles (25G) | BD Biosciences | 305127 | |
| Syringes (1ml) | BD Biosciences | 309692 | |
| Anaesthesia trolley | LEI medical | M2000 | |
| Baytril | CDMV, St. hyacinthe, QC | 102207 | |
| Lidocaine | CDMV, St. hyacinthe, QC | 3914 | |
| Betadine solution | CDMV, St. hyacinthe, QC | 19955 |
References
- Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
- Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
- Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
- Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
- Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
- Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
- Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
- Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
- Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
- Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
- Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
- Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
- Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
- Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
- Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
- Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
- Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
- Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
- Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
- Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
- Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
- Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
- Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).
