Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Utvikling av en ensidig-lesioned 6-OHDA mus modell av Parkinsons sykdom

Published: February 14, 2012 doi: 10.3791/3234
Automatic Translation
1, 1, 1
1Centre for Neurobiology of Stress, Dept Biological Sciences, University of Toronto at Scarborough

Summary

En protokoll for å utføre ensidige 6-OHDA lesjoner i mediale forebrain bunten i mus er beskrevet. Denne metoden har lav dødelighet (13,3%) med 89% av de overlevende dyrene viser> 95% tap av striatale banene dopamin og 90,63 ± -4,02% ipsiversive roterende bias mot siden av lesjonen.

Abstract

Den ensidig lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rotte modell av Parkinsons sykdom (PD) har vist seg å være uvurderlig i fremme vår forståelse av mekanismene bak parkinsonsymptomer, siden det sammenfatter endringene i basalgangliene kretser og farmakologi observert i parkinsonsymptomer pasienter 1-4. Men de nøyaktige cellulære og molekylære endringer som skjer ved Cortiço-striatale banene synapser av produksjonen trasé innenfor striatum, som er den viktigste innspill regionen i basalgangliene forblir unnvikende, og dette antas å være stedet der patologiske forandringer underliggende parkinsonsymptomer oppstår 3 , 5.

I PD, har forståelse for mekanismene bak endringene i basalgangliene kretser følgende degenerasjon av nigro-striatale banene veien vært sterkt frem med utviklingen av bakteriell kunstig kromosom (BAC) mus over-uttrykke grønne fluorescerende proteiner drevet av fremmers spesifikk for de to striatale banene output stier (direkte vei: eGFP-D1, indirekte vei: eGFP-D2 og eGFP-A2a) 8, slik at de kan studeres i isolasjon. For eksempel har nyere studier antydet at det er patologiske forandringer i synaptisk plastisitet i parkinsonsymptomer mus 9,10. Men disse studiene benyttes juvenile mus og akutte modeller av parkinsonisme. Det er uklart om endringene beskrevet hos voksne rotter med stabile 6-OHDA lesjoner også forekomme i disse modellene. Andre grupper har forsøkt å gi en stabil ensidig-lesioned 6-OHDA voksen mus modell av PD ved lesioning den mediale forebrain bundle (MFB), dessverre, var dødeligheten i denne studien ekstremt høy, med bare 14% overleve operasjonen for 21 dager eller lengre 11. Flere nyere studier har generert intra-nigral lesjoner med både lav dødelighet> 80% tap av dopaminerge nevroner, men uttrykk for L-DOPA indusert dyskinesier 11,12,13,14 var variabeli disse studiene. Et annet godt etablert mus modell av PD er den MPTP-lesioned mus 15. Mens denne modellen har vist seg nyttig i vurderingen av mulige nervecellene agenter 16, er det mindre egnet for å forstå mekanismene bak symptomene på PD, som denne modellen ofte unnlater å indusere motor underskudd, og viser et bredt variasjon i omfanget av lesjon 17, 18 .

Her har vi utviklet en stabil ensidig 6-OHDA-lesioned mus modell av PD ved direkte administrasjon av 6-OHDA i MFB, som konsekvent fører> 95% tap av striatale banene dopamin (målt ved HPLC), samt produsere det atferdsmessige ubalanser observert i brønnen karakterisert ensidige 6-OHDA-lesioned rotte modell av PD. Denne nyutviklede mus modell av PD vil være et verdifullt verktøy for å forstå mekanismene bak generasjon av parkinsonsymptomer.

Protocol

1. Bolig og utarbeidelse av mus

  1. Opprettholde en koloni av bakteriell kunstig kromosom (BAC) drevet transgene mus 8 (Mutant Mouse Regional Resource Center (MMRRC) FVB i en 12:12 h lys-mørke-syklusen med fri tilgang til mat og vann. Disse musene er rene FVB mus, og det er ikke nødvendig å krysse disse musene med andre belastninger, enten for avl, eller for å sikre suksess i 6-OHDA lesjon prosedyre.
  2. For å generere en Parkinsonrelaterte modell, er voksne mus i alderen postnatal dag 31-42 (P31-42) som kreves for 6-OHDA-lesjon og humbug surgeries.
  3. For å redusere risikoen for smitte, administrere Baytril (antibiotika) i drikkevannet i 24 timer før operasjonen.

2. Utarbeidelse av narkotika for kirurgi

En premedisinering av desipramin og pargyline gis vanligvis til gnagere før injeksjon av 6-hydroxydopamine (6-OHDA) for å øke selektivitet og efficacy av 6-OHDA-induserte lesjoner. Den noradrenalin / 5HT opptak inhibitor, senker desipramin 6-OHDA-indusert noradrenalin og 5HT utarming 22, mens monoaminooksidasehemmer, forbedrer pargyline følsomheten av dopaminerge terminaler til 6-OHDA, ved å redusere extrasynaptic nedbrytning av 6-hydroxydopamine 31.

  1. Den premedisinering (desipramin hydroklorid (HCl) og pargyline HCl) kan lages i store mengder og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Vei ut riktig mengde desipramin HCl å forsyne hver mus med 25 mg / kg for det antall dyr som vil motta kirurgi på denne dagen. Den lave vekten på musen gjør det utfordrende å levere små mengder nøyaktig, derfor forberede desipramin hydroklorid i en konsentrasjon på 2,5 mg / ml og gis til dyret på 10 ml / kg. Vekten av salt komponenten av det sammensatte må tas hensyn til slik at den riktige konsentrasjonen oppnås. Korreksjon for vekten avHCl salt i desipramin hydroklorid: Molekylvekt (MW) av desipramin HCl: 302,84 MW HCl: 36,46 MW fri base: 266,38 Korreksjonsfaktor: 302,84 / 266,38 = 1.137 For 10 ml: = 2.5mg/ml desipramin x 10.0ml x Korreksjonsfaktor = 2.5mg/ml x 10.0ml x 1,137 = 28.43mg av desipramin hydroklorid
  2. Vei ut riktig mengde pargyline HCl å forsyne hver mus med 5mg/kg for antall dyr som mottar kirurgi den dagen. Korrigere for salt komponenten av det sammensatte som beskrevet ovenfor. Den lave vekten på musen gjør det utfordrende å levere små mengder nøyaktig, derfor forberede pargyline hydroklorid i en konsentrasjon på 0,5 mg / ml og administrere til dyret på 10 ml / kg.
    Korriger for vekten av HCl salt i pargyline hydroklorid:
    MW pargyline HCl: 195,69 MW HCl: 36.46
    MW av fri base: 159,23 Korreksjonsfaktor: 195,69 / 159,23 = 1.229
    For 10 ml veier ut: <br /> = 0,5 mg / ml pargyline x 10,0 ml x Korreksjonsfaktor
    = 0,5 mg / ml x 10,0 ml x 1.229
    = 6.15mg av pargyline hydroklorid
  3. Kombiner 28.43mg desipramin HCl og 6.15mg pargyline HCl i et 10 ml glass uteksaminert sylinder, og legg 8 ml sterilt saltvann (0,9%). Vortex og varme til 45 ° C til blandingen er oppløst. PH i løsningen vil nå være rundt 3, noe som hvis det gis til musene vil føre til ubehag og postoperative komplikasjoner involverer urin og mage-tarmkanalen funksjon. Legg dråper NaOH (1M) til pH er 7,4. Fyll opp volumet til 10 ml med sterilt saltvann (0,9%), og virvle. Etikett, dato og fryse på ~ 80 ° C. Gitt at pargyline HCl er ikke løselig i saltvann ved romtemperatur, i hele det kirurgiske perioden, lagre premedisinering blandingen i et vannbad varmes til 37 ° C i operasjonsstuen.
  4. Løsninger av 6-OHDA må tilberedes umiddelbart før operasjoner. Kjøretøyet som brukes til å oppløse 6-OHDA hydrobromide (6-OHDA.Br) løsning er sterilt saltvann (0,9%) oppløsning som inneholder askorbinsyre (0,2%). Askorbinsyre er nødvendig for å stabilisere 6-OHDA.Br, som det hindrer oksidasjon av 6-OHDA.Br til en inaktiv form. Vei ut 0,2 g askorbinsyre, deretter legge til en tom en L uteksaminert sylinder, topp opp til 1 L med sterilt saltvann (0,9%) og rør. Etikett, dato og butikk ved ~ 80 ° C til nødvendig.
  5. Vei ut riktig mengde av 6-OHDA.HBr å lage en 15,0 mg / ml oppløsning til å forsyne hver mus med 3,0 mikrogram. Siden 6-OHDA.Br er lys og varme følsomme unngå eksponering for lys, og plass på is før veiing.
    Korriger for vekten av HBr salt i 6-OHDA.HBr:
    MW av 6-OHDA.HBr: 250,09 MW HBr: 79,9 MW fri base: 170.19
    Korreksjonsfaktor: 250,09 / 170,19 = 1,47
    For 0,5 ml veier ut:
    = 15,0 mg / ml 6-OHDA x 0,5 ml x Korreksjonsfaktor
    = 15,0 mg / ml 6-OHDA x 0,5 ml x 1,47
    = 11,03 mg av 6-OHDA.HBr
  6. For sham-opererte dyr, utgjør en tilsvarende volum av kjøretøy (sterilt saltvann (0,9%), askorbinsyre 0,02% pH 7,4) og som deres 6-OHDA-lesioned dyr vil motta, og plass i en 1,0 ml sterilt rør innpakket i aluminiumsfolie, etikett og sted umiddelbart på is inntil bruk.

3. Sette opp kirurgiske apparater

Kirurgiske verktøy må steriliseres ved hjelp av en autoklav før to kirurgi. Mellom hver bruk må kirurgisk verktøy steriliseres i 95% etanol etterfulgt av oppvarming til 250 ° C i 2 minutter. Alle eksperimenter må utføres i samsvar med retningslinjer for de aktuelle Animal Care Committees av de tilknyttede institusjonen og land.

  1. Rengjør alle overflater og utstyr med isopropylalkohol før du sette opp utstyret. Bruk sterile hansker ved håndtering av rent kirurgisk utstyr.
  2. Set-up en mus utvinning bur med papirhåndklær på basen. Plasser under en varmelampe eller på toppen av en oppvarmet blokk.
  3. Sett opp bedøvelse tralle, slik at oksygen tilsig er tilkoblet og åpen, og isofluran reservoaret er helt full. Sett oksygenstrømmen til 1 L / min, og isofluran til 2-4%. Ideelt vil det være to utstrømmende porter fra Anestesiapparat å levere oksygen isofluran blandingen til en induksjon kammer, samt for vedlikehold mens dyret er i stereotaxic rammen.
  4. Correct montering av infusjon apparatet er kritisk for å sikre vellykkede lesjoner, som fanget luft eller blokkerte nåler reduserer volumet av 6-OHDA tilført ved lesjon stedet. Monter infusjon apparatet som vist i figur 1. Tråd en RN metall mutter på ene siden av PEEK slangen (RN komprimering kit (montering 1/16 th tomme)), etterfulgt av PEEK koppen ferrul, da det kanoniske PFA ferrul. Orient de endehylser slik at kjeglen på den kanoniske PFA ferrul vil skli inn i paring delen av PEEK koppen ferrul. Plass i dobbel lille navet RN coupler (# 1), som sikrer forbindelsen er tett. På den andre enden av dual lille navet RN coupler inn 33 gauge kanylen. Tre nålen gjennom en av RN metall nøtter og stram til. Sørg for at 33 gauge kanyle er på en 180 ° vinkel til den doble liten hub RN coupler (# 1). På den andre enden av PEEK rør, tråd en av RN metall nøtter etterfulgt av en PEEK ferrule, så PFA ferrul. Sett metall mutter ennd ferrul forsamlingen inn en andre dobbel liten hub RN coupler og stram tilkoblingen. På den andre enden av et sekund liten dobbel RN hub coupler (# 2) sett inn luer til lille hub RN adapter (luer adapter), og stram tilkoblingen.
  5. Neste infusjonen apparatet må grunnes (se figur 1). Fyll 250 mL og 1,0 mL Hamilton sprøyter med sterilt vann, slik det ikke er luftbobler. Fest 250 mL sprøyten til luer-adapter og trykke ned stempelet på 250 mL sprøyte slik at vannet slippes gjennom 33 gauge kanylen på den andre enden av slangen. Fortsett å skyve vann gjennom systemet mens du trekker den 250 mL sprøyte ut av luer adapter, og etterlater en liten vann perle på enden av luer adapter. Trykk stempelet på 1,0 mL sprøyten før en liten vann perle kommer ut. Forsiktig inn 1,0 mL sprøyten inn i luer adapter, sørg for at vannet perle på 1,0 mL sprøyte forbinder med vannet bead nåværende on luer adapter, og helt inn 1,0 mL sprøyten inn i luer adapter. Sørg ingen bobler i den lille dobbel RN hub coupler.
  6. Nå som systemet er primet, kan perfusjons apparatet være festet til stereotaxic ramme og infusjonspumpe. Klem lille dual RN hub kopling med 33 gauge kanylen er festet til manipulator arm av stereotaxic rammen, så klemme den 1,0 mL sprøyten til perfusjon pumpe, slik at når perfusjon pumpen begynner sprøyten er presset mot klemmen og kan ikke flytte. Program infusjonspumpen å tillate en infusjonshastighet på 0,1 mL / min.

4. Unilateral 6-OHDA lesjon kirurgi

  1. Tretti minutter før operasjoner, veie hvert dyr og registrere vekten. Systemisk administrere desipramin hydroklorid (2,5 mg / ml, Sigma Aldrich) og pargyline hydroklorid (0,5 mg / ml, Sigma Aldrich) (0,9% sterilt saltvann, pH 7,4) ved 10 ml / kg av intra-peritoneal injeksjon (ip) til en mushjelp av en 27g nål festet til en 1 ml sprøyte. For eksempel vil en 30,0 g mus motta 300 mL av premedisinering. Varm opp varme platen og legg dette under øret og fortann bar. Den varme platen vil bidra til å opprettholde temperaturen på dyret under operasjonen og holde dyret i en ideell høyde for å passe øret og fortann sprinklene i stereotaxic rammen.
  2. Femten minutter etter administrasjon av desipramin HCl og pargyline HCl løsning, plasserer musen i et lukket kammer anestesi, og anesthetise dyret ved hjelp av isofluran inhalasjon (2-3% i O 2). Dyret er tilstrekkelig bedøvet når det viser ingen respons på bakbenet klype og ingen blunkerefleksen.
  3. Barbere toppen av musen hode, og anvende aktuell smertestillende lidokain direkte på huden ved hjelp av bomull ull. Fem minutter etter lidokain søknad, sterilisere hodet på dyret med Betadine løsning.
  4. Plasser dyret i en stereotaxic ramme tilpasset for mus. Først plasserer dyret inn i fortann barer (fortann bar innstilling: -3,0 til 2,0 mm) med bedøvelse maske plassert over ansiktet på dyret. Juster oksygenstrømmen til 1 L / min, og isofluran til 1,5-2%. Den fortann bar bør være på et nivå i forhold til de øreklokkene slik at toppen av skallen er nivået. Sett øreklokkene (diameter 5,0 mm). Øreklokkene har blitt satt riktig når hodet er helt flat, og kan ikke flyttes i begge retninger.
  5. Skjær langs midtlinjen av huden på toppen av hodet av musen med en skalpell blad, og trekke huden. Tørk overflaten av hodeskallen med gasbind.
  6. Trykk ned stempelet på 1,0 mL sprøyte, og plasser 33 gauge kanylen inn i 1 ml tube dekket i aluminiumsfolie som inneholder 6-OHDA løsning (15 mg / ml). Tegn tilbake sakte på stempelet på 1,0 mL sprøyten mens du holder 33 gauge kanylen nedsenket i 6-OHDA løsning (15 mg / ml).
  7. Lag en 1 cm snitt langs midtenlinje av skallen. Advance spissen av kanylen mot Bregma, dispensere en liten mengde av 6-OHDA løsning fra 33 gauge kanyle til å danne en liten perle. Sakte senke injeksjon nålespissen til Bregma, når perlen berører Bregma stoppe fremme nålespissen og registrere disse koordinatene. Trekk kanylen 2 mm i dorsal retning, og beveger seg langs den sagittal suturen i en rostral kaudal retning lambda. Advance en liten mengde av 6-OHDA løsning fra 33 gauge kanyle til å danne en liten perle. Sakte senke injeksjon nålespissen til Lambda, når perlen kontakter Lambda stoppe fremme nålespissen og registrere disse koordinatene. Den mediale laterale (ML), og dorsal ventrale (DV) koordinater skal være identisk for Bregma og Lambda, dersom de ikke er, justere fortann baren tilsvarende for AP koordinater, og øret barene for ML koordinatene. Flytt nålen til koordinerer AP: -1,2 mm, ML: -1,1 mm i forhold til Bregma ifølge Mouse Brain Atlas i Stereotaxic koordinater 25. Trekk nålen, og Burr et hull inn i skallen med en 25 gauge nål.
  8. Returner injeksjonsnålen til ovennevnte koordinater, og sette nålen til DV:-5mm. Infuser 0,2 mL av 6-OHDA eller kjøretøy ensidig i median forebrain bunt med en rate på 0,1 mL / min (3 mikrogram total). Ved ferdigstillelse av administrasjon av 6-OHDA eller kjøretøy, la kanylen på plass for ytterligere fem minutter slik at diffusjon bort fra injeksjonsstedet.
  9. Sakte trekke nålen.
  10. Lukk snitt til hodebunnen med tre sting, og levere 1ml av Ringer-laktat oppløsning subkutant (sc).
  11. Ta dyret fra stereotaxic ramme, og plass i utvinningen buret til bevissthet igjen.

5. Postoperativ behandling av 6-OHDA-lesioned dyr

  1. Plasser dyr i bur (3 mus / Cage) og tillate fri tilgang til mat og sugared vann (10 mm). Gi Nutra-gel og KMR (kattunge melk erstatning) i mat containere på gulvet av buret for å stimulere appetitten og gastrointestinal motilitet.
  2. Inspiser mus daglig etter operasjonen i 2 uker 24. Ved hver inspeksjon spesiell oppmerksomhet bør tas hensyn til årvåkenhet av dyret ved å vurdere muligheten for dyret å bevege seg rundt buret. Mat og vann inntak fra den siste observasjonsperioden, samt tilstedeværelse og konsistens av avføring bør også følges. En vanlig postoperativ komplikasjon er dehydrering dette er tydelig ved langsom tilbaketrekking av huden følgende huden klype. Hvis dette observeres levere 1 ml Ringer-laktat oppløsning fm i 1 uke eller til symptomene bedres. I tilfelle av mannlige dyr, bør kjønnsorganene være nøye for penis prolaps identifisert ved rødhet på penis. Hvis dette skjer gjelde mucol gel på penis av de berørte dyret, og levere en ml Ringer-laktat oppløsning fm for en ukeeller inntil symptomene bedres.
  3. Vei dyr daglig for å overvåke endringer i kroppsvekt.
  4. I tilfellet der ip injeksjon har forårsaket en liten rift i mage-systemet, kan abdominal infeksjon føre. Derfor vurdere for prsence av infeksjon i magen, åpenbart av hoven utspilt buk. Unn ved å administrere Baytril i drining vann i 3-4 dager eller til symptomene bedres.

6. Parkinsonrelaterte vurdering

For å estimere omfanget av lesjonen, ble behavioral vurdering utført 14-21 dager etter 6-OHDA-lesjon kirurgi, når mengden av dopamin uttømming er maksimal og stabil 26.

  1. Etter ip injeksjon av 0,01 ml / g 0,9% sterilt saltvann, sted mus i glassylinderne (11 cm x 9,5 cm) og registrere sin aktivitet ved hjelp av en videokamera (CG9, Sanyo).
  2. Se videoen, telle antall komplette 360 ​​° rotasjoner laget i både ipsiversive og contraversive retning i forhold til lesjonen.
  3. Jo større skjevhet mot ipsiversive rotasjoner, jo mer Parkinsonrelaterte dyret, og dermed beregne hvor stor andel av ipsiversive rotasjoner i prosent av netto (contraversive og ipsiversive) rotasjons atferd.

7. Bestemmelse av striatale banene dopamin innhold ved HPLC

  1. Minst 21 dager etter 6-OHDA lesjon kirurgi, og ved gjennomføring av atferdsstudier, ofre musene av over-dose av anestesi, og fjern forsiktig hjernen. Behold en bit av striatum (230 mikrometer) fra hver halvkule i hver mus, og knipse fryse umiddelbart etter seksjonering og oppbevares ved -80 ° C til klargjøring av striatale banene prøver.
  2. HPLC prøven buffer (0,1 M PCA med 2 mm glutation) hindrer dopamin hentet fra striatale banene prøvene fra bryte ned.
    For 100 ml prøve buffer:
    = 100 ml HPLC grade H 2 O
    = 0,862 ml PCA (70%) (Sigma)
    = 61,5 mg glutation (redusert)
    Mål opp HPLC karakteren H 2 O, legger PCA, oppløse glutation i løsningen, bland godt og filter. Prøven buffer kan oppbevares ved 4 ° C i opptil en måned.
  3. Tin striatale banene skiver på isen, så homogenisere i 200 mL prøve buffer med en ultrasonisk celle Disrupter (Fisher Sonic, USA). Hold prøver på is til alle tider og homogenisere hver prøve tre ganger i 10 sekunder hver sikre at prøvene er lov til å kjøle ned mellom homogenisering perioder.
  4. Sett til side 20 mL av hver homogenisert prøve (butikk ved -80 ° C) for et protein analysen.
  5. Sentrifuger prøvene (20 800 xg, 20 min (4 ° C, 58 Eppendorf - 04R, USA)), og fjern supernatanten og filteret gjennom en 0,2 mikrometer PVDF membran (Pall, Cat #: 1935-28143-310) og fryse på -80 ° C til HPLC analyse. Beholde protein pellet som en back-up for protein analysen.
  6. Klargjøring av mobil fase for HPLC å kjøre through HPLC kolonne.
    For 1 L av mobil fase:
    60 mm NaH 2 PO 4. H 2 O (monobasic) = 8,27 g
    30 mm Sitronsyre = 5,7 g
    0,13 mm Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) disodium salt dehydrere = 48 mg
    0,16 mM Sodium dodecyl sulfat (SDS) = 45 mg
    850 ml HPLC grade vann (Caledon, Cat #: 8801-7)
    15% v / v Acetonitrile-190 (pH 3,35) = 150 ml HPLC grade (Caledon, Cat #: 1401-7)
    ~ 2 mL av 10 M NaOH (i HPLC grade H2O)
    Alle reagenser skal være ≥ 99,0% rent og av HPLC kvalitet mulig. Vannet og acetonitril må være HPLC kvalitet. Mobil fase må brukes innen en uke av forberedelse. Har dedikert, rene glass og rør barer utelukkende for utarbeidelse av mobil fase (en 1 L glass målesylinder og minst 2 1 L glass flasker). Før utarbeidelsen av mobil fase har to rene 1 L flakonger forberedt, til en for å gjøre løsningen i og en overføre det inn under filtrering og degassing. La mobil fase å sirkulere gjennom HPLC natten og sjekk at grunnlinjen er flat før bruk.
  7. Mål opp 700 ml av HPLC kvalitet vann i et glass målesylinder og oppløse NaH 2 PO 4. H 2 O, sitronsyre, EDTA og SDS i den. Fyll opp vann til 850 ml.
  8. Juster pH til 3,35 med 10 M NaOH, og tilsett acetonitril og bland løsningen med en Teflon belagt oppsikt bar.
  9. Sett en bevegelse bar i andre rene, tom 1 L termos og vakuum filtrere mobil fase inn i det gjennom et 0,22 mikrometer HVLP Millipore filter: (Cat #: SLGP033RS). Fukt filteret i 85:15 H 2 O / ACN før filtrering. Når mobilen er fullt filtrert, mobil fase Degas ved å røre den under vakuum i minst 10 min.
  10. Forbered standardene mot der dopamin konsentrasjonen av striatale banene prøvene vil bli målt. Standarder blir kjørt gjennom HPLC ved begynnelsen og slutten av hver batch av striatale banene prøver. A 1mg / ml stamløsning av dopamin kan gjøres på forhånd og oppbevares i 20 mL alikvoter ved -80 ° C. For å forberede stamløsning oppløse 5 mg dopamin i 5 ml prøve buffer (se ovenfor) og bland det grundig. Begynne å forberede de standarder ved å ta 5 mL av 1 mg / ml stamløsning, legge det til 2,5 ml prøve buffer og blande det godt å få en 2 mikrogram / ml dopamin løsning.
  11. Fire standarder kjøres gjennom HPLC å produsere en konsentrasjon kurve. For dopamin konsentrasjonene er: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, og 12,5 ng / ml. For å generere disse fire konsentrasjonene av dopamin ta 10 mL av 2 mikrogram / ml dopamin løsning utarbeidet i 7.10). og legge den til 190 mL av prøven buffer for å gi deg en 100 ng / ml dopamin løsning. Etter dette utføre en 1:1 seriell fortynning av 100 ng / ml dopamin løsning med prøven buffer. Bare ta 100 mL av 100 ng / ml dopamin og tilsett 100 mL av prøven buffer og miks til å produsere 50 ng / ml dopamin, så ta 100mL av 50 ng / ml dopamin og tilsett 100 mL av prøven buffer og miks til å produsere 25 ng / ml dopamin og så videre.
  12. For å forberede HPLC system, (Waters 1525μ Binary pumpe, 717plus autosampler, Symmetri C-18 reverse-fase kolonne (15 cm x 4,6 mm id, 5 mikrometer partikkelstørrelse) (30 ° C), elektrokjemisk detektor (ESA Coulochem III) utstyrt med en dobbel elektrode analytisk celle (ESA 5011A) og kontrollert av Breeze programvare (Waters)) første purge systemet med mobil fase ved å velge purge protokollen i dataprogram eller ved å følge produsentens instruksjoner. Dette børsene alle tidligere løsning i HPLC systemet med frisk mobil fase.
  13. Sett elektrokjemiske potensialene på 400 mV og -300 mV for første og andre elektroder henholdsvis. Etter dette, stabilisere systemet ved å kjøre den i minst 2 timer og ideelt natten med den mobile fasen ved en strømningshastighet på 1 ml / min. Under ekvilibrering cellene skal være slått på og grunnlinja reading overvåket, når lesningen blir stabilt systemet er klart til bruk. For den første timen av likevekt la mobile fasen som kommer ut av systemet går inn i en waster container, etter dette kan du tillate den mobile fasen for å resirkulere gjennom HPLC systemet ved å sette avløpsslangen inn i mobile fase kolben.
  14. Tin striatale banene prøver på is, deretter injisere 20 mL av hver dopamin standard etterfulgt av 2 x 20 mL av hver prøve og ytterligere 20 mL av hver dopamin standard i likevekt HPLC systemet med mobil fase flow rate på 1 ml / min.
  15. Bruk HPLC systemet programvare for å analysere området de dopamin topper produsert av standarder og prøver. Sammenligning området av dopamin toppene stede i striatale banene prøvene til standard dopamin konsentrasjonskurven vil identifisere mengden av dopamin til stede i 20 mL av hver striatale banene prøve. Skalere dette tallet opp for å finne den totale dopamin til stede i hele striatale banene skive.
  16. Perform en standard protein assay på 20 mL av striatale banene homogenat at du setter i 7.4). Dette vil måle mengden av protein som finnes i de striatale banene prøvene i mg / ml. Fra denne beregne mengden av dopamin i striatale banene prøvene som en verdi i ng / mg slik at du kan sammenligne dopamin konsentrasjoner mellom halvkulene og mellom mus.

8. Representative Resultater

Femten til tjue ett døgn etter 6-OHDA-lesjon kirurgi, når mengden av celledød skyldes neurotoxin har nådd completion26, måling av spontan 360 ° rotasjoner etter administrering av saltvann (ip) 28 kan brukes til å vurdere hvor vellykket 6 -OHDA-lesioned (figur 2). Denne metoden for behavioral vurderingen er enkel og rask, og unngår potensielle primersystemer effekter forårsaket av dopaminerge midler som amfetamin eller Apomorphine utfordringer. Videre er spontan rotasjon vurdering en bedre predictor av dyr med <95% dopamin utarming sammenlignet med forbena pote innplasseringstest 27. Ved å samkjøre striatale banene dopaminnivåer fra striatale banene prøver (utarbeidet ved gjennomføring av atferdsmessige studier med HPLC) med andel av spontane ipsiversive rotasjoner i hvert dyr, har vi funnet ut at dyr som stiller 70% eller mer ipsiversive rotasjoner mot 6-OHDA lesjon har mistet> 95% striatale banene dopamin (figur 3) 27. Etter delvise 6-OHDA-induserte lesjoner (59,44 ± 17,20) (figur 3) av mediale forebrain bunten, var det ingen roterende skjevhet mellom ipsiversive versus contraversive sider ved måling spontane rotasjoner (40,91 ± 8,01) (figur 2). Dermed Som vi har funnet etter seks-OHDA administrasjonen til MFB i rotter, er det mulig å føre en dyp tap av dopaminerge nigro-striatale banene nevroner, og saltvann administrasjon (ip) er en nøyaktig metode for screening omfanget av 6-OHDA lesjon i disse dyrene.

Figur 1

Figur 1. Prinsippskisse for å demonstrere montering av kanylen apparat for 6-OHDA-lesjon surgeries.

Figur 2

Figur 2. Vurdering av roterende oppførsel i forloren-opererte og 6-OHDA lesioned mus. Spontane rotasjoner i forloren-opererte og 6-OHDA-lesioned mus. Data er presentert som middelverdier prosentpoeng ipsiversive rotasjoner ± SEM, der netto contraversive og ipsiversive rotasjoner er 100%. Åpne barer: humbug-opererte dyr; Grey barer: 6-OHDA-lesioned dyr med> 95% dopamin tap, svart barer: dyr som gjennomgikk 6-OHDA-lesjon kirurgi som ble delvis lesioned. *** P <0,001 sammenlignet med humbug-opererte dyr. Enveis ANOVA etterfulgt av Dunn multippel sammenligningstest (s HAM-opererte: n = 17; 6-OHDA-lesioned (> 95%): n = 23; delvis 6-OHDA-lesjon: n = 3).

Figur 3

Figur 3. Vurdering av striatale banene dopaminnivåer i sham-opererte og 6-OHDA lesioned mus ved hjelp av HPLC. Striatale banene dopamin innhold ble bestemt i det opererte og unoperated halvkule av forloren og 6-OHDA-lesioned dyr. Data er presentert som gjennomsnittlig prosent ± SEM av striatale banene dopamin nivåer i unoperated striatum. Åpne barer: humbug-opererte dyr; Grey barer: 6-OHDA-lesioned dyr med> 95% dopamin tap, svart barer: dyr som gjennomgikk 6-OHDA-lesjon kirurgi som ble delvis lesioned. *** P <0,001, ** P <0.01 sammenlignet med humbug-opererte dyr. Enveis ANOVA etterfulgt av Dunn multippel sammenligningstest (sham-opererte: n = 17, 6-OHDA-lesioned (> 95%): n = 23, delvis 6-OHDA-lesjon: n = 3).

Eak ">

Figur 4

Figur 4. Vurdering av tyrosin hydroksylase immunoreaktivitets i SNC i forloren-opererte og 6-OHDA lesioned mus. Som en markør av dopamin celle tap i substantia nigra pars compacta (SNC), tap av tyrosin hydroksylase (TH) positiv immunohistochemisty i det opererte og unoperated halvkule av forloren og 6-OHDA-lesioned dyr ble bestemt som beskrevet i Thiele et al. I Press. Data er presentert som gjennomsnittlig prosent ± SEM av TH positive celler i unoperated striatum. Åpne barer: humbug-opererte dyr; Grey barer: 6-OHDA-lesioned dyr med> 95% dopamin tap, svart barer: dyr som gjennomgikk 6-OHDA-lesjon kirurgi som ble delvis lesioned. *** P <0,001, ** P <0.01 sammenlignet med humbug-opererte dyr. Enveis ANOVA etterfulgt av Dunns flere selskaperRison test (sham-opererte: n = 17, 6-OHDA-lesioned (> 95%): n = 23, delvis 6-OHDA-lesjon: n = 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode for generering av en stabil ensidig 6-OHDA-lesioned mus modell av Parkinsons sykdom, noe som er svært reproduserbare, med en høy lesjon suksessrate, og en lav dødelighet. Suksessen av 6-OHDA lesjon kirurgi kan lett estimeres ved måling av spontan roterende adferd med> 70% ipsiversive rotasjoner som tyder på> 95% dopamin uttømming i lesioned striatum 27. Kvantifisering av striatale banene dopaminnivåer er den mest nøyaktige måling av omfanget av striatale banene dopamin uttømming sammenlignet quantificiation av nummertastene TH-positive celler i substantia nigra Pars compacta, da det gir en direkte måling av striatale banene dopaminnivåer 28. Gitt at denne protokollen gjengir injeksjonsstedet (MFB) og lengde på lesjon utvikling (21 dager) av brønnen karakterisert ensidige 6-OHDA-lesioned rotte modell av Parkinsons sykdom 1,4, kan det antas thpå denne mus modell, som med rotte modell, sammenfatter endringer i farmakologi og hjernen kretser observert hos pasienter med Parkinsons sykdom. Dermed gir denne metoden et middel for å generere en symptomatisk modell av Parkinsons sykdom i transgene mus. Gitt at transgene mus er ekstremt kraftige verktøy for å la oss til å forstå rollen av molekyler og proteiner in vivo på molekylnivå, gjennom til mobilnettet og hele vev nivå, å kombinere disse to teknikkene vil være svært nyttig i videre opptegning av molekylære og cellulære mekanismer underliggende generasjon av symptomer på Parkinsons sykdom.

Cenci har tidligere beskrevet en lignende metode for generering av en ensidig 6-OHDA-lesioned mus av Parkinsons sykdom, ble imidlertid dette assosiert med høy dødelighet, med bare 14% av dyrene overlever mer enn 21 dager etter inngrepet etter injeksjon av 6 - OHDA i MFB 11. Det er flere Mulig usynlige forklaringer på manglende dødelighet i protokollen beskrevet her. For det første stereotaxic koordinater valgt i denne protokollen tillater kanyle for å helt unngå hypothalamus. Siden musen hypothalamus er så liten, kan enhver skade på denne strukturen påvirke spise og drikke sentrene i musen, slik at dyret å miste vekt og bli dehydrert, og til slutt dø. Dernest i protokollen er beskrevet her, ble den samme konsentrasjonen av 6-OHDA (3 mg) benyttes som i studien ved Lundblad og kolleger 11, ble det imidlertid gitt i et mindre volum (0.2ml forhold til 1ml) med en langsommere infusjon rate (0.1ml/min forhold til 0.5ml/min). Den mindre volum og lavere infusjonshastighet sikre minimal skade på strukturer rundt MFB. Endelig diameteren på kanylen er betydelig mindre (0,33 vs 50mm), som vil minimere skade hjernens struktur som nålen reiser ventrally gjennom hjernen.

ontent "> Cenci har også beskrevet en annen metode for generering av ensidige 6-OHDA-lesjoner, med 6-OHDA blir injisert inn i striatum 11. Som det har blitt beskrevet etter striatale banene injeksjon av 6-OHDA i rotter, dette resulterer i et lavere nivå av dopamin tap, noe som er mer variable mellom mus.

En endelig vurdering som må tas i betraktning er den potensielle effekten av stamme av mus. Det er godt dokumentert at belastningen har en dramatisk effekt på suksess av dopamin uttømming etter systemisk administrasjon av MPTP, som også fører til selektiv celledød av dopaminerge nigro-striatale banene veien 29. Mens denne forskjellen mellom artene ikke synes å forekomme i rotter etter 6-OHDA administrasjon, er det mulig at det kan være en faktor i å avgjøre suksessen av 6-OHDA lesjon i mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Utenriksdepartementet og International Trade (Government of Canada), University of Toronto Connaught Fund, det kanadiske Foundation for Innovation, NSERC, den Krembil Foundation og The Cure Parkinson tillit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
desipramine HCl Sigma-Aldrich D125 25mg/kg
pargyline HCl Sigma-Aldrich P8013 5mg/kg
6-OHDA HBr Sigma-Aldrich H116 3mg / mouse
stereotaxic Frame Kopf Instruments Model 900
mouse ear cups Kopf Instruments Model 921 Zygoma Ear Cups
mouse incisor bar Kopf Instruments Model 923B
mouse anaesthesia mask Kopf Instruments Model 923B
priming kit (containing 250ml syringe) Hamilton Co PRMKIT 81120
RN compression fitting kit (1 mm) Hamilton Co 55750-01
PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) Hamilton Co 55751-01
dual small hub RN Coupler Hamilton Co 55752-01
luer to small hub RN adaptor Hamilton Co 55753-01
1ml 25S syringe model 7001KH Hamilton Co 80100
*33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel Hamilton Co 7803-05
Scissors Fine Science Tools 14084-08
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blades Fine Science Tools 10035-20
Forcep Fine Science Tools 11608-15
Hemostats Fine Science Tools 13004-14
Isoflurane Abbott Laboratories 02241315 2-3%
Suters (Vicryl 4.0) Syneture SS-683
Steriliser Fine Science Tools 18000-45
Infusion Pump Harvard Apparatus PhD 22/2000
Needles (27G) BD Biosciences 305109
Needles (25G) BD Biosciences 305127
Syringes (1ml) BD Biosciences 309692
Anaesthesia trolley LEI medical M2000
Baytril CDMV, St. hyacinthe, QC 102207
Lidocaine CDMV, St. hyacinthe, QC 3914
Betadine solution CDMV, St. hyacinthe, QC 19955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
  2. Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
  3. Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
  4. Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
  5. Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
  6. Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
  7. Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
  8. Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
  9. Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
  10. Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
  11. Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
  12. Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  13. Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
  14. Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
  15. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
  16. Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
  17. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  18. Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
  19. Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
  20. Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
  21. Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
  22. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  23. Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
  24. Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
  25. Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
  26. Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
  27. Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
  28. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
  29. Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
  30. Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
  31. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).

Tags

Medisin mus 6-OHDA Parkinsons sykdom mediale forebrain bunt unilateral
Utvikling av en ensidig-lesioned 6-OHDA mus modell av Parkinsons sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J.… More

Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (60), e3234, doi:10.3791/3234 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter