Summary
Ett protokoll för att utföra ensidigt 6-OHDA-lesioner i den mediala forebrain bundle i möss beskrives. Denna metod har en låg dödlighet (13,3%) med 89% av de överlevande djuren visade> 95% förlust av striatal dopamin och 90,63 ± -4,02% ipsiversive roterande inriktning mot sidan av lesionen.
Abstract
Den ensidigt lesion 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-skadade råttmodell av Parkinsons sjukdom (PD) har visat sig vara ovärderligt för att föra vår förståelse av mekanismerna bakom parkinsonsymtom, eftersom den sammanfattas de förändringar i basala ganglierna kretsar och farmakologi observerats i patienter med Parkinsons sjukdom 1-4. Men de exakta cellulära och molekylära förändringar som sker vid kortiko-striatala synapser för de utgående vägar inom striatum, vilket är den största ingången regionen i basala ganglierna förblir svårfångad, och detta tros vara platsen där patologiska avvikelser som ligger bakom parkinsonsymtom uppstår 3 , 5.
I PD, har förstå de mekanismer som ligger bakom förändringarna i basala ganglierna kretsar efter degeneration av Nigro-striatala vägen blivit mycket fram genom utvecklingen av bakteriell artificiell kromosom (BAC) möss över uttrycker gröna fluorescerande proteiner som drivs av att främjars specifika för de två striatala utgående vägar (direkt väg: EGFP-D1, indirekta vägen: EGFP-D2 och EGFP-A2a) 8, vilket gör att de kan studeras isolerat. Till exempel har senare studier antytt att det finns sjukliga förändringar i synaptisk plasticitet i Parkinson möss 9,10. Men dessa studier utnyttjas unga möss och akuta modeller av parkinsonism. Det är oklart om de förändringar som beskrivs i vuxna råttor med stabila 6-OHDA lesioner förekommer även i dessa modeller. Andra grupper har försökt skapa en stabil ensidigt-skadade 6-OHDA modell vuxen mus av PD genom att skada den mediala framhjärnan bunt (MFB), tyvärr var dödligheten i denna studie extremt hög, med endast 14% överlevande operationen för 21 dagar eller längre 11. Nyare studier har genererats inom nigrala lesioner med både en låg dödlighet> 80% förlust av dopaminerga neuroner, men expression av L-DOPA-inducerad dyskinesi 11,12,13,14 var variabeli dessa studier. En annan väl etablerad musmodell av PD är den MPTP-lesionerad mus 15. Även denna modell har visat sig användbar vid bedömningen av potentiella nervskyddande ämnen 16, är det mindre lämpligt för att förstå mekanismerna bakom symtom på PD, eftersom denna modell ofta misslyckas med att framkalla motoriska brister, och visar en bred variation i omfattningen av skadan 17, 18 .
Här har vi utvecklat en stabil unilaterala 6-OHDA-skadade musmodell av PD genom direkt administrering av 6-OHDA i MFB, som genomgående ger> 95% förlust av striatal dopamin (mätt med HPLC), såväl som framställning av beteendemässiga obalanser observerades i väl karaktäriserade unilaterala 6-OHDA-skadade råttmodell av PD. Denna nyutvecklade musmodell av PD kommer att visa sig vara ett värdefullt verktyg för att förstå mekanismerna bakom generation parkinsonsymtom.
Protocol
1. Bostäder och förberedelse av möss
- Upprätthålla en koloni av bakteriell artificiell kromosom (BAC) drivs transgena möss 8 (Mutant Mouse regionalt resurscentrum (MMRRC) FVB i en 12:12 h ljus-mörker-cykel med fri tillgång till mat och vatten. Dessa möss är rena FVB-möss, och är det inte nödvändigt att korsa dessa möss med någon annan stam, antingen för avel, eller för att säkerställa framgång för 6-OHDA lesion förfarande.
- För att generera en parkinsonistisk modell är vuxna möss åldern postnatal dag 31-42 (P31-42) krävs för 6-OHDA-lesion och simulerad kirurgi.
- För att minska risken för infektion, administrera Baytril (antibiotika) i dricksvattnet under 24 timmar före operation.
2. Beredning av läkemedel för operation
En premedicinering för desipramin och pargylin är vanligtvis administreras till gnagare före injektion av 6-hydroxidopamin (6-OHDA) för att öka selektiviteten och efficacy av 6-OHDA-inducerade lesioner. Den noradrenalin / 5HT återupptagande inhibitor, minskar desipramin 6-OHDA-inducerad noradrenalin och 5HT utarmning 22, medan den monoaminoxidasinhibitor, förstärker pargylin känsligheten hos dopaminerga terminaler till 6-OHDA, genom att reducera extrasynaptic nedbrytning av 6-hydroxidopamin 31.
- Premedicinering (desipramin-hydroklorid (HCl) och pargylin HCl) kan framställas i stora volymer och förvarades vid -80 ° C fram till användning. Väg in en lämplig mängd av desipramin HCl för att tillhandahålla varje mus med 25 mg / kg för det antal djur som ska ta emot kirurgi på den dagen. Den låga vikten hos mus gör det svårt att avge små volymer noggrant, varför framställning desipramin-hydroklorid vid en koncentration av 2,5 mg / ml och administreras till djuret vid 10 ml / kg. Vikten av saltkomponenten av föreningen måste redovisas så att den korrekta koncentrationen har uppnåtts. Korrigering för vikten hosHCl-saltet i desipramin-hydroklorid: Molekylvikt (MW) av desipramin HCl: 302,84 MW HCl: 36,46 MW fri bas: 266,38 Korrigeringsfaktor: 302,84 / 266,38 = 1,137 För 10 ml lösning: = 2,5 mg desipramin x 10,0 ml x Korrektionsfaktor = 2,5 mg x 10,0 ml x 1,137 = 28.43mg av desipramin-hydroklorid
- Väg in en lämplig mängd pargylin HCl att förse varje mus med 5mg/kg för det antal djur få operation den dagen. Korrigera för saltkomponenten av föreningen som beskrivits ovan. Den låga vikten på musen gör det svårt att leverera små volymer noggrant, därför förbereda pargylin hydroklorid vid en koncentration av 0,5 mg / ml och administrera till djur vid 10 ml / kg.
Korrigera för vikten av HCl-saltet i pargylin-hydroklorid:
MW pargylin HCl: 195,69 MW HCl: 36,46
MW fri bas: 159,23 Korrektionsfaktor: 195,69 / 159,23 = 1,229
För 10 ml Väg ut: <br /> = 0,5 mg / ml pargylin x 10,0 ml x Korrektionsfaktor
= 0,5 mg / ml x 10,0 ml x 1,229
= 6.15mg av pargylin hydroklorid - Kombinera 28.43mg desipramin HCl och 6.15mg pargylin HCl till en 10 ml glasflaska mätcylinder, och tillsätt 8 ml steril koksaltlösning (0,9%). Vortexa och värm till 45 ° C tills blandningen är upplöst. PH-värdet hos lösningen kommer nu att vara omkring 3, som om de administreras till möss kommer att orsaka obehag och postoperativa komplikationer inbegriper urinvägarna och mag-tarmkanalen funktion. Tillsätt droppar NaOH (1 M) tills pH är 7,4. Fyll upp volymen till 10 ml med steril saltlösning (0,9%) och virvelblandades. Etikett, datum och frys vid ~ 80 ° C. Med tanke på att pargylin HCl inte är löslig i saltlösning vid rumstemperatur, under hela det kirurgiska period lagra premedicinering blandningen i ett vattenbad till 37 ° C i operationssalen.
- Lösningar av 6-OHDA måste beredas omedelbart före kirurgi. Den vehikel som används för att upplösa 6-OHDA-hydrobromid (6-OHDA.Br) lösning är steril koksaltlösning (0,9%)-lösning innehållande askorbinsyra (0,2%). Askorbinsyra behövs för att stabilisera 6-OHDA.Br, eftersom den förhindrar oxidation av 6-OHDA.Br till en inaktiv form. Väg upp 0,2 g askorbinsyra, tillsätt sedan till en tom 1 L mätcylinder, fyll till 1 L med steril saltlösning (0,9%) och omrördes. Etikett, datum och lagra vid ~ 80 ° C tills de behövdes.
- Väg in en lämplig mängd av 6-OHDA.HBr att en 15,0 mg / ml lösning att förse varje mus med 3,0 | ig. Eftersom 6-OHDA.Br är lätt och värmekänslig undvika exponering för ljus, och placera på is före vägning.
Korrigera för vikten av HBr-saltet i 6-OHDA.HBr:
MW 6-OHDA.HBr: 250,09 MW HBr: 79,9 MW fri bas: 170,19
Korrektionsfaktor: 250,09 / 170,19 = 1,47
För 0,5 ml Väg ut:
= 15,0 mg / ml 6-OHDA-x 0,5 ml X Korrigeringsfaktor
= 15,0 mg / ml 6-OHDA-x 0,5 ml x 1,47
= 11,03 mg 6-OHDA.HBr - För skenopererade djur, utgör en lika stor volym av fordon (steril koksaltlösning (0,9%), askorbinsyra 0,02% pH 7,4) till den som 6-OHDA-skadade djur kommer att få, och placera i en 1,0 ml förpackade sterila rör i tenn folie, etikett och omedelbart på is fram till användning.
3. Ställa in kirurgiska apparater
Kirurgiska instrument måste steriliseras med en autoklav före to kirurgi. Mellan de olika operationerna måste kirurgiska verktyg steriliseras i 95% etanol följt av upphettning till 250 ° C under 2 minuter. Alla experiment måste utföras i enlighet med riktlinjerna i lämpliga kommittéer Animal Care i anslutna institutionen och land.
- Rengör alla ytor och utrustning med isopropylalkohol före att sätta upp utrustningen. Använd sterila handskar vid hantering av rena kirurgisk utrustning.
- Set-up en mus återhämtning bur med pappershanddukar på basen. Placera under en värmelampa eller ovanpå en uppvärmd dyna.
- Ställ in bedövningen vagnen och se till att syret inflödet är ansluten och öppna, och isofluran behållaren är helt full. Ställa in flödet av syre till 1 liter / minut, och isofluran till 2-4%. Idealt kommer det att finnas två utloppsöppningar från anestesiapparaten att leverera syre isofluran blandningen till en induktionskammare, såväl som för underhåll, medan djuret är i den stereotaktiska ramen.
- Correct montering av infusionsanordningen är kritisk för att säkerställa lyckade lesioner som instängd luft eller blockerade nålar minskar volymen av 6-OHDA infunderas på lesionsstället. Montera infusionsanordningen som visas i figur 1. Tråden en RN metall mutter på en sida av PEEK-rör (RN kompression kit (montering 1/16: e tum)), följt av PEEK koppen hylsa, sedan den kanoniska PFA hylsan. Orient de hylsor så att kon på kanoniska PFA beslaget kommer att glida in i den passande delen av PEEK koppen hylsan. Plats till det dubbla lilla navet RN kopplare (# 1), se till att anslutningen är tät. På den andra änden av dubbla lilla navet RN koppling in 33 nålen gauge injektion. Trä nålen genom en av RN metall muttrarna och dra åt. Se till att 33 gauge är en 180 ° vinkel mot den dubbla lilla navet RN kopplare (# 1). På den andra änden av slangen PEEK, gänga en av RN metall muttrarna följt av en PEEK hylsa, varefter PFA ferrulen. Sätt metall mutternnd hylsaggregatet i en andra två mindre navet RN kopplare och dra åt anslutningen. På den andra änden av en andra liten dubbel RN navet kopplare (# 2) in luer till liten hub RN adapter (Luer adapter) och dra åt anslutningen.
- Därefter infusionsanordningen måste primas (se figur 1). Fyll 250 fil och 1,0 pl Hamilton sprutor med sterilt vatten, vilket garanterar det inte finns några luftbubblor. Fäst 250 | il spruta till luer-adaptern och trycka in kolven i 250 | il sprutan så att vatten släpps ut genom den 33 gauge injektionsnål vid den andra änden av röret. Fortsätta att trycka vatten genom systemet, medan man drar den 250 | il spruta ut i lueradaptern, lämnande en liten vatten vulst på änden av luer-adaptern. Trycka in kolven i 1,0 | il sprutan tills en liten vatten vulst matas ut. Försiktigt in 1,0 pl sprutan i luer-adapter, se till att vattnet pärlan på 1,0 pl sprutan ansluter med vattnet pärlan aktuella on luer-adapter och helt in 1,0 pl sprutan i luer adaptern. Se till att inga bubblor i den lilla dubbla RN navet koppel.
- Nu att systemet primade kan perfusionsapparat fästas vid stereotaktisk ram och infusionspump. Kläm den lilla dubbla RN navet koppel med 33 gauge injektionsnål fäst på roboten arm stereotaktisk ram, så klämmer 1,0 pl sprutan till perfusionen pumpen, så att när perfusionen pumpen börjar sprutan pressas mot klämman och kan inte röra sig. Programmera infusionspumpen att tillåta en infusionshastighet av 0,1 pl / min.
4. Unilaterala 6-OHDA-lesionen kirurgi
- Trettio minuter före operationer, väger varje djur och notera vikten. Systemiskt administrera desipramin-hydroklorid (2,5 mg / ml, Sigma Aldrich) och pargylin hydroklorid (0,5 mg / ml, Sigma Aldrich) (0,9% steril saltlösning, pH 7,4) vid 10 ml / kg genom intraperitoneal injektion (ip) till en musanvändning av en 27g nål fäst till en 1 ml spruta. Till exempel skulle en 30,0 g mus erhålla 300 pl premedicinering. Värm upp värme skivan och placera detta under örat och framtand bar. Uppvärmningen Skivan kommer att bidra till att hålla temperaturen på djuret under operationen och hålla djuret vid ett perfekt höjd för att passa öron och framtand stänger av stereotaktisk ram.
- Femton minuter efter administrering av desipramin HCl och pargylin HCl-lösning, placera musen i en sluten anestesi kammare och anesthetise djuret med isofluran inandning (2-3% i O 2). Djuret är tillräckligt anestesi när det visar inget svar på bakben nypa och ingen blinkar reflex.
- Raka toppen av musens huvud och tillämpa aktuella smärtstillande lidokain direkt på huden med hjälp bomull. Fem minuter efter lidokain ansökan sterilisera huvud djuret med betadinlösning.
- Placera djuret i en stereotaxisk ram anpassad för möss. För det första placera djuret i framtand stängerna (incisionsskalan inställning: -3,0 till 2,0 mm) med anestesi masken placeras över ytan av djuret. Justera flödet av syre till 1 liter / minut, och isofluran till 1,5-2%. Den framtand bar ska ligga på en nivå i förhållande till kåporna så att den övre delen av skallen är plan. Sätt kåporna (diameter 5,0 mm). Lurarna har satts in korrekt när huvudet är helt platt och kan inte flyttas i endera riktningen.
- Klipp längs mittlinjen av huden på toppen av huvudet av musen med hjälp av en skalpell blad, och dra tillbaka huden. Torka ytan av skallen med gasbinda.
- Tryck ner kolven på 1,0 pl sprutan och placera 33 kanylstorlek injektion i 1 ml tub omfattas aluminiumfolie innehållande 6-OHDA-lösning (15 mg / ml). Dra sig tillbaka långsamt på kolven av 1,0 pl sprutan samtidigt som 33 kanylstorlek injektion nedsänkt i 6-OHDA-lösning (15 mg / ml).
- Skapa en 1 cm snitt längs mittenraden i skallen. Föra spetsen av kanylen mot Bregma, dispensera en liten mängd av 6-OHDA-lösningen från 33 gauge injektionsnål för att bilda en liten vulst. Långsamt sänka spetsen injektionsnål till Bregma, när vulsten vidrör Bregma stoppa frammatning av nålspetsen och registrera dessa koordinater. Dra tillbaka injektionsnål 2 mm i den dorsala riktning och rör sig längs den sagittala suturen i en rostral kaudala riktning mot lambda. Avancera en liten mängd av 6-OHDA-lösningen från 33 gauge injektionsnål för att bilda en liten vulst. Långsamt sänka spetsen injektionsnål till Lambda, när vulsten kontakter Lambda stoppa frammatning av nålspetsen och registrera dessa koordinater. Den mediala laterala (ML), och dorsala ventrala (DV) koordinater bör vara identiska för Bregma och lambda, om de inte, justera framtand baren detta för AP koordinaterna och barerna öra för ML koordinater. Flytta nålen samordnar AP: -1,2 mm, ML: -1,1 mm i förhållande till Bregma enligt Mouse Brain Atlas i stereotaxismenyn Koordinater 25. Dra in nålen, och Burr ett hål i skallen med användning av en 25 gauge nål.
- Återgå injektionsnålen till ovanstående koordinater, och stick in nålen till DV:-5mm. Infundera 0,2 pl av 6-OHDA-eller vehikel ensidigt i median-forebrain bundle med en hastighet av 0,1 pl / min (3 pg totalt). Vid fullbordande av administrering av 6-OHDA-eller vehikel, lämnar nålen på plats under ytterligare fem minuter för att tillåta diffusion bort från injektionsstället.
- Sakta dra in nålen.
- Stänga snittet till skalpen med användning av tre suturer, och leverera 1 ml Ringer-laktat-lösning subkutant (se).
- Ta bort djuret från stereotaktisk ram och plats i återhämtningen buren tills medvetandet återfås.
5. Postoperativ vård av 6-OHDA-skadade djur
- Placera djur i bur (3 möss / bur) och låt fri tillgång till mat och sugared vatten (10 mM). Ge Nutra-gel och KMR (kattunge mjölk byte) i livsmedel behållare på golvet av buren för att stimulera aptiten och gastrointestinal motilitet.
- Inspektera möss dagliga efter kirurgi för 2 veckor 24. Vid varje inspektion bör särskild uppmärksamhet ägnas åt vakenhet av djuret genom att bedöma förmågan hos djuret att röra sig runt i buren. Mat och vattenintag från den sista observationsperioden samt närvaro och konsekvent avföring bör också observeras. En vanlig postoperativ komplikation är uttorkning detta är uppenbart genom långsam indragning av huden efter huden nypa. Om detta observeras ge 1 ml Ringer-laktat lösning fm under 1 vecka eller tills symtomen förbättras. När det gäller handjur bör könsorganen noga observeras för penis framfall identifieras med rodnad i penis. Om detta inträffar gäller mucol gel på penis för det sjuka djuret, och leverera 1 ml Ringer-laktat lösning fm under 1 veckaeller tills symtomen förbättras.
- Väg djuren dagligen för att övervaka förändringar i kroppsvikt.
- I det fall då ip-injektion har orsakat en liten reva i mag-tarmkanalen, kan buken infektioner uppstå. Därför bedöma för prsence av infektion i buken, framgår av svullna utspänd buk. Behandla genom att administrera Baytril i drining vattnet i 3-4 dagar eller tills symtomen förbättras.
6. Parkinsonistisk bedömning
För att uppskatta omfattningen av skadan, var beteende bedömning som gjorts 14-21 dagar efter 6-OHDA-lesion kirurgi, när mängden dopamin utarmning är maximal och stabil 26.
- Efter ip injektion av 0,01 ml / g 0,9% steril koksaltlösning, placera möss i glascylindrar (11 cm x 9,5 cm) och registrera sin verksamhet med hjälp av en videokamera (CG9, Sanyo).
- Titta på video, räkna antalet kompletta 360 ° rotationer i både ipsiversive och contraversive riktning i förhållande till lesionen.
- Ju större förspänning mot ipsiversive rotationer, desto mer parkinsonistisk djuret, vilket beräkna andelen ipsiversive rotationer som en procentandel av nät (contraversive och ipsiversive) rotationsbeteende.
7. Bestämning av striatal dopamin genom HPLC
- Minst 21 dagar efter 6-OHDA lesionen kirurgi och efter slutförandet av de beteendestudier, offra mössen med över-dos bedövning och försiktigt bort hjärnan. Behåll en skiva striatum (230 m) från varje halvklotet i varje mus, och knäpp frysa omedelbart efter snittning och förvara vid -80 ° C tills beredning av striatala prover.
- HPLC-prov-buffert (0,1 M PCA med 2 mM glutation) förhindrar dopamin extraheras från striatala prover från nedbrytning.
För 100 ml av provbuffert:
= 100 ml HPLC-klassat H 2 O
= 0,862 ml PCA (70%) (sIgMa)
= 61,5 mg glutation (reducerat)
Mät upp HPLC-kvalitet H2O, tillsätt PCA, upplös glutation i lösningen, blandas väl och filtrera. Provbufferten kan lagras vid 4 ° C under upp till 1 månad. - Tina striatala skivor på is, därefter homogenisera i 200 pl provbuffert med användning av en ultraljuds-cell disrupter (Fisher Sonic, USA). Håll prover på is vid alla tidpunkter och likrikta varje prov tre gånger under 10 sekunder vardera att säkerställa att proven svalna mellan homogenisering perioder.
- Avsätta 20 | il av varje homogeniserade provet (förvara vid -80 ° C) under en proteinanalys.
- Centrifugera proverna (20.800 xg, 20 min 4 ° C, Eppendorf 58 (- 04R, USA)), avlägsna supernatanten och filtrera genom ett 0,2 | im PVDF-membran (Pall, Cat #: 1935-28143-310) och frys vid -80 ° C tills HPLC-analys. Behåll proteinet pellets som back-up för proteinet analysen.
- Framställning av den mobila fasen för HPLC för att köra thrgrundlig HPLC-kolonnen.
För 1 L av mobil fas:
60 mM NaH 2 PO 4. H2O (monobasisk) = 8,27 g
30 mM citronsyra = 5,7 g
0,13 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-dinatrium-salt dehydratisera = 48 mg
0,16 mM natrium-dodecylsulfat (SDS) = 45 mg
850 ml HPLC-klassat vatten (Caledon, Cat #: 8801-7)
15% vol / vol acetonitril-190 (pH 3,35) = 150 ml HPLC-kvalitet (Caledon, Cat #: 1401-7)
~ 2 | il av 10 M NaOH (i HPLC-kvalitet H2O)
Alla reagenser skall vara ≥ 99,0% ren och HPLC-kvalitet så är möjligt. Den vatten och acetonitril måste vara av HPLC-kvalitet. Mobila fasen skall användas inom en vecka av förberedelser. Har ägnat, ren glas och rör om barer enbart för beredningen av mobila fasen (en 1 L glas mätglas och minst 2 1 L flaskor glas). Före framställning av den mobila fasen har två rena 1 liters kolvar framställdes, till en för att göra lösningen in och en överför den till under filtrering och degassing. Tillåta den mobila fasen för att cirkulera genom HPLC över natten och kontrollera att baslinjen är platt före användning. - Mät upp 700 ml HPLC-klassat vatten i ett glas mätcylinder och lös NaH 2 PO 4. H2O, citronsyra, EDTA och SDS i den. Fyll upp vatten till 850 ml.
- Justera pH till 3,35 med användning av 10 M NaOH, sedan tillsätta acetonitril och blanda lösningen med användning av en Teflon-belagd omrörarstav.
- Sätta en omrörarstav i den andra rena, tomma 1 liters kolv och vakuum filtrera den mobila fasen in i den genom en 0,22 fim HVLP Millipore-filter (Cat #: SLGP033RS). Blöt filtret i 85:15 H 2 O / ACN före filtrering. När väl den mobila helt filtreras, den mobila fasen avgasa genom omröring därav under vakuum under minst 10 minuter.
- Framställa de standarder mot vilken dopamin koncentrationen av de striatala prover kommer att mätas. Standarder gå igenom HPLC i början och slutet av varje sats av striatala prover. En 1mg / ml stamlösning av dopamin kan göras i förväg och lagras i 20 | il alikvoter vid -80 ° C. För att bereda stamlösningen lös 5 mg dopamin i 5 ml provbuffert (se ovan) och blanda den ordentligt. Börjar förbereda de standarder genom att 5 pl av 1 mg / ml stamlösning, tillsätta den till 2,5 ml provbuffert och mixning av den grundligt för att erhålla en 2 | ig / ml dopamin-lösning.
- Fyra standarder som körs genom HPLC för att ge en koncentration-kurva. För dopamin koncentrationerna är: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, och 12,5 ng / ml. För att generera dessa fyra koncentrationer av dopamin ta 10 pl av 2 | ig / ml dopamin lösning framställd i 7,10). och lägga till 190 pl provbuffert för att ge dig en 100 ng / ml dopamin lösning. Efter denna utför en 01:01 serieutspädning av 100 ng / ml dopamin lösning med provbuffert. Helt enkelt ta 100 ^ 100 ng / ml dopamin och tillsätt 100 pl provbuffert och blanda för att producera 50 ng / ml dopamin, ta sedan 100il 50 ng / ml dopamin och tillsätt 100 pl provbuffert och blanda för att producera 25 ng / ml dopamin och så vidare.
- För framställning av HPLC-system, (Waters 1525μ binär pump, 717plus autosampler, Symmetry C-18 omvänd fas-kolonn (15 cm x 4,6 mm id, 5 | im partikelstorlek) (30 ° C), elektrokemisk detektor (ESA Coulochem III) utrustad med dubbla elektrod analytisk cell (ESA 5011A) och kontrolleras av Breeze programvara (Waters)) 1:e rena systemet med mobil fas genom att välja purge protokollet i datorn programvara eller genom att följa tillverkarens instruktioner. Denna utbyte alla tidigare lösning i HPLC-systemet med färsk mobil fas.
- Ställa den elektrokemiska potentialer vid 400 mV och -300 mV för de första och andra elektroderna respektive. Efter detta utjämning av systemet genom att köra den i minst 2 timmar och helst över natten med den mobila fasen vid en flödeshastighet av 1 ml / min. Under jämvikt cellerna ska slås på och baslinjen Reading övervakas, när avläsningen har stabiliserats systemet är redo att användas. Under den första timmen av jämviktning låta den mobila fasen, som lämnar systemet går in i en odåga behållare, efter detta kan tillåta den mobila fasen för att återcirkulera genom HPLC-system genom att sätta utloppsslangen i den mobila fasen kolv.
- Tina striatala prover på is, därefter injicera 20 | il av varje standard dopamin följt av 2 x 20 ^ il av varje prov och en ytterligare 20 fil av varje standard dopamin in i jämviktad HPLC-system med den mobila fasen flödeshastighet på 1 ml / min.
- Använd HPLC-systemet för att analysera området för dopamin topparna produceras av standarder och prov. Jämföra arean av de dopamin-toppar närvarande i de striatala prov till standarden dopaminkoncentrationen kurvan kommer att identifiera mängden dopamin närvarande i 20 | il av varje prov striatala. Skala denna siffra för att söka efter totala dopamin som finns i hela striatala skiva.
- Perform en standard proteinanalys den 20 pl striatal homogenat som du skall upphävas 7,4). Detta kommer att mäta mängden protein närvarande i de striatala proverna i mg / ml. Av detta beräknas mängden dopamin i striatala prover som ett värde i ng / mg så att du kan jämföra dopaminkoncentrationer mellan halvklot och mellan möss.
8. Representativa resultat
Femton till tjugo tre veckor efter 6-OHDA-lesionen operation, när mängden av celldöd orsakad av neurotoxinet har nått completion26, mätning av spontana 360 ° rotationer efter administrering av saltlösning (ip) 28 kan användas för att bedöma framgången av 6 -OHDA-lesion (figur 2). Denna metod för beteende bedömning är enkel och snabb, och undviker potentiella grundning som orsakas av dopaminerga medel såsom amfetamin eller utmaningar apomorfin. Dessutom är spontan vridning bedömning en bättre predictor av djur med <95% dopamin utarmning jämfört med forelimb tass inplaceringstest 27. Genom att korrelera striatala dopaminnivåer från striatala prover (beredd efter slutförandet av beteendestudier med HPLC) med andel av spontana ipsiversive rotationer i varje djur, har vi funnit att djur som uppvisar 70% eller mer ipsiversive rotationer mot 6-OHDA lesionen har förlorat> 95% striatal dopamin (figur 3) 27. Efter partiell 6-OHDA-lesioner inducerade (59,44 ± 17,20) (Figur 3) av den mediala forebrain bundle fanns ingen rotationskraft förspänning mellan ipsiversive kontra contraversive sidor vid mätning spontana rotationer (40,91 ± 8,01) (Figur 2). Sålunda, som har befunnits efter 6-OHDA administrering till MFB i råttor, är det möjligt att bringa en svår förlust av dopaminerga nigro-striatala neuroner, och saltlösning administrering (ip) är en noggrann metod för screening av omfattningen av 6-OHDA skada hos dessa djur.
Figur 1. Schematiskt diagram för att visa monteringen av injektionsnålen anordning för 6-OHDA-lesion operationer.
Figur 2. Bedömning av roterande beteende i skenopererade och 6-OHDA skadade möss. Spontana rotationer i skenopererade och 6-OHDA-skadade möss. Data presenteras som genomsnittlig procent ipsiversive rotationer ± SEM, där nätet contraversive och ipsiversive rotationer är 100%. Öppna barer: skenopererade djur, Grey barer: 6-OHDA-skadade djur med> 95% dopamin förlust, svart barer: djur som genomgick 6-OHDA-lesion operation som delvis var lesion. *** P <0,001 jämfört med skenopererade djur. Envägs ANOVA följt av Dunns multipla jämförelsetest (s skinka manövrerad: n = 17, 6-OHDA-skadade (> 95%): n = 23; partiell 6-OHDA-lesionen: n = 3).
Figur 3. Bedömning av striatala dopaminnivåer i skenopererade och 6-OHDA skadade möss med HPLC. Striatal dopamin-innehåll bestämdes i den opererade och oanvänd hemisfär av falskt och 6-OHDA-skadade djur. Data presenteras som genomsnittlig procent ± SEM av striatala dopaminnivåer i striatum oanvänd. Öppna barer: skenopererade djur, Grey barer: 6-OHDA-skadade djur med> 95% dopamin förlust, svart barer: djur som genomgick 6-OHDA-lesion operation som delvis var lesion. *** P <0,001, ** P <0,01 jämfört med skenopererade djur. Envägs ANOVA följt av Dunns multipla jämförelsetest (skenopererade: n = 17, 6-OHDA-skadade (> 95%): n = 23, partiell 6-OHDA-lesionen: n = 3).
EAK ">
Figur 4. Bedömning av tyrosin hydroxylas immunreaktivitet i SNC i skenopererade och 6-OHDA skadade möss. Som en markör för dopamin cellförlust i substantia nigra pars compacta (SNC), förlust av tyrosinhydroxylas (TH) positiv immunohistochemisty i den opererade och oanvänd hemisfär av falskt och 6-OHDA-skadade djur bestämdes såsom beskrivits i Thiele et al. In Press. Data presenteras som genomsnittlig procent ± SEM av TH-positiva celler i den oanvänd striatum. Öppna barer: skenopererade djur, Grey barer: 6-OHDA-skadade djur med> 95% dopamin förlust, svart barer: djur som genomgick 6-OHDA-lesion operation som delvis var lesion. *** P <0,001, ** P <0,01 jämfört med skenopererade djur. Envägs ANOVA följt av Dunns multipel företagRison testet (skenopererade: n = 17, 6-OHDA-skadade (> 95%): n = 23, partiell 6-OHDA-lesionen: n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för generering av en stabil unilaterala 6-OHDA-skadade musmodell av Parkinsons sjukdom, som är extremt reproducerbar, med en hög lesion framgång, och en låg dödlighet. Framgången av 6-OHDA-lesionen kirurgi kan lätt uppskattas genom mätning av spontan rotationsbeteende med> 70% ipsiversive rotationer som indikerar> 95% dopaminbrist i den skadade striatum 27. Kvantifiering av striatala dopaminnivåer är de mest exakta mätningen av graden av striatal dopamin reduktion jämfört med quantificiation av antalet TH-positiva celler i substantia nigra pars compacta, eftersom det ger en direkt mätning av striatala dopaminnivåer 28. Med tanke på att detta protokoll återger injektionsstället (MFB) och längd lesion utveckling (21 dagar) av väl karakteriserade ensidiga 6-OHDA-skadade råttor modell av Parkinsons sjukdom 1,4, kan det antas thvid denna musmodell, som med råttmodell, sammanfattas förändringarna i farmakologi och hjärna kretsar observerats hos patienter med Parkinsons sjukdom. Således tillhandahåller denna metod en metod för att generera en symptomatisk modell av Parkinsons sjukdom i transgena möss. Med tanke på att transgena möss är extremt kraftfulla verktyg för att låta oss att förstå vilken roll av molekyler och proteiner in vivo vid molekylär, genom att den cellulära och hela vävnadsnivå, kombinera dessa två tekniker kommer att vara mycket användbar i ytterligare avgränsar de molekylära och cellulära mekanismer underliggande generation av symptom på Parkinsons sjukdom.
Cenci tidigare har beskrivit en liknande metod för att generera en unilaterala 6-OHDA-skadade mus av Parkinsons sjukdom, men detta är förbundet med hög dödlighet, med endast 14% av djuren överlever mer än 21 dagar efter kirurgi efter injektion av 6 - OHDA i MFB 11. Det finns flera POSS ible förklaringar till den bristande mortalitet i det protokoll som beskrivs här. För det första är de stereotaktiska koordinaterna har valts i detta protokoll kan injektionsnålen att helt undvika hypotalamus. Eftersom musen hypothalamus är så liten kan skada denna struktur påverka äta och dricka centra i musen, vilket gör att djuret att gå ner i vikt och bli uttorkad, och slutligen dö. Dels i det protokoll som beskrivs här, var samma koncentration av 6-OHDA (3mg) som användes som i studien av Lundblad och kollegor 11, men var det administrerades i en mindre volym (0,2 ml jämfört med 1 ml) med en långsammare infusion hastighet (0.1ml/min jämfört med 0.5ml/min). Ju mindre volym och långsammare infusionshastighet se minimal skada på strukturer som omger MFB. Slutligen diameter injektionsnålen är betydligt mindre (0,33 vs 50mm), vilket kommer att minimera skador på hjärnans struktur när nålen färdas ventralt genom hjärnan.
INNEHÅLL "> Cenci har också beskrivits en annan metod för generering av unilaterala 6-OHDA-lesioner, med 6-OHDA att sprutas in i striatum 11. Såsom har beskrivits efter striatala injektion av 6-OHDA i råttor, resulterar detta i en lägre nivå av dopamin förlust, vilket är mer varierande mellan möss.Ett sista övervägande som måste beaktas är den potentiella effekten av stam av möss. Det har väl dokumenterat stammen har en dramatisk effekt på framgång dopaminbrist efter systemisk administrering av MPTP, vilket också orsakar selektiv celldöd av dopaminerga Nigro-striatala vägen 29. Denna skillnad mellan arter inte verkar förekomma i råttor efter 6-OHDA-administrering, är det möjligt att det kan vara en faktor vid bestämning av framgången av 6-OHDA-lesionen i möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av utrikesdepartementet och internationell handel (Kanadas regering), University of Toronto Connaught fonden, den kanadensiska stiftelsen för innovation, NSERC den Krembil Foundation och Cure Parkinsons Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desipramine HCl | Sigma-Aldrich | D125 | 25mg/kg |
| pargyline HCl | Sigma-Aldrich | P8013 | 5mg/kg |
| 6-OHDA HBr | Sigma-Aldrich | H116 | 3mg / mouse |
| stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| mouse ear cups | Kopf Instruments | Model 921 Zygoma Ear Cups | |
| mouse incisor bar | Kopf Instruments | Model 923B | |
| mouse anaesthesia mask | Kopf Instruments | Model 923B | |
| priming kit (containing 250ml syringe) | Hamilton Co | PRMKIT 81120 | |
| RN compression fitting kit (1 mm) | Hamilton Co | 55750-01 | |
| PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) | Hamilton Co | 55751-01 | |
| dual small hub RN Coupler | Hamilton Co | 55752-01 | |
| luer to small hub RN adaptor | Hamilton Co | 55753-01 | |
| 1ml 25S syringe model 7001KH | Hamilton Co | 80100 | |
| *33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10035-20 | |
| Forcep | Fine Science Tools | 11608-15 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 02241315 | 2-3% |
| Suters (Vicryl 4.0) | Syneture | SS-683 | |
| Steriliser | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | PhD 22/2000 | |
| Needles (27G) | BD Biosciences | 305109 | |
| Needles (25G) | BD Biosciences | 305127 | |
| Syringes (1ml) | BD Biosciences | 309692 | |
| Anaesthesia trolley | LEI medical | M2000 | |
| Baytril | CDMV, St. hyacinthe, QC | 102207 | |
| Lidocaine | CDMV, St. hyacinthe, QC | 3914 | |
| Betadine solution | CDMV, St. hyacinthe, QC | 19955 |
References
- Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
- Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
- Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
- Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
- Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
- Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
- Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
- Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
- Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
- Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
- Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
- Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
- Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
- Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
- Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
- Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
- Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
- Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
- Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
- Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
- Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
- Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
- Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).
