Summary
एक साधारण, बायोमास संयंत्र के नमूनों की बड़ी संख्या के saccharification क्षमता का निर्धारण करने के लिए तेजी से विधि में वर्णित है. इस विश्लेषण के लिए स्वचालित मंच 96 अच्छी तरह प्लेटें और pretreatment, जारी शर्करा की hydrolysis और मात्रा का ठहराव के बाद प्रदर्शन में विश्लेषण के लिए संयंत्र बायोमास की तैयारी शामिल है.
Protocol
1. नमूनों की तैयारी
हम आम तौर पर या तो घास या वुडी पौधों की वजह से उपजी के साथ काम करते हैं. फूलों की सामग्री के मामले में हम परिपक्वता के लिए संयंत्रों के विकास, और बीज के विकास के बाद हम सूखी उपजी इकट्ठा एक बार senescence पूरा हो गया है. उपजी 4 मिमी खंडों में कटा रहे हैं और तीन मिलिंग गेंदों के साथ 2 मिलीलीटर की शीशियों में रखा जाता है. वुडी सामग्री के मामले में, नमूने एक कोर्स लकड़ी फ़ाइल के साथ मोटे बुरादा करने के लिए भूमि कर रहे हैं और फिर आगे के प्रसंस्करण के लिए एक गेंद मिल में रखा.
नमूने पीसने / स्वरूपण स्टेशन (चित्रा 1) के भीतर एक रैक में रखा जाता है. इस स्टेशन sequentially grinds, घोला जा सकता है, और प्रत्येक नमूना वजन. नमूना प्रति आवश्यक repetitions की संख्या प्रारंभिक प्रयोगों जहां एक निश्चित कण आकार के लिए आंतरिक परिवर्तनशीलता निर्धारित किया जाता है की एक श्रृंखला में जमीन सामग्री के परीक्षण के द्वारा स्थापित है. 2 एमएल शीशियों तल पर छेदा कर रहे हैं और सामग्री चयनित अच्छी तरह से अधिक शीशी के कंपन द्वारा वितरित कर रहे हैं. हिल हाथ पाउडर का सही वितरण के लिए अनुमति देता है शेष में से एक प्रतिक्रिया द्वारा नियंत्रित किया जाता है. रोबोट 4 मिलीग्राम / अच्छी तरह से एक मानक विश्लेषण में dispenses 4 repetitions के ज्यादातर मामलों में जरूरत है. यह 20 संयंत्र नमूने / प्लेट का विश्लेषण करने की अनुमति देता है.
2. Pretreatment
एक बार नमूने स्वरूपित हैं, 96 अच्छी तरह प्लेटें एक स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली (चित्रा 2) द्वारा संसाधित कर रहे हैं. यहाँ एक हल्के pretreatment संयंत्र सामग्री पर एसिड या alkaline समाधान के 350 μL जोड़ने और एक अनुकूलित खंड पर थाली हीटिंग के द्वारा किया जाता है. विश्लेषण के दौरान वाष्पीकरण से बचने के लिए, 96 अच्छी तरह प्लेटें एक सिलिकॉन मैट के साथ सील कर रहे हैं. और pretreatment के तापमान और समय अध्ययन किया जा रहा है सामग्री के अनुसार संशोधित किया जा सकता है. , तथापि, अधिकतम तापमान 100 डिग्री सेल्सियस है कठोर pretreatments के परीक्षण के लिए एक वैकल्पिक प्रक्रिया लाइन बंद सामग्री pretreat और प्रक्रिया से pretreatmet खत्म है.
3. Hydrolysis
- बाद सामग्री pretreated हैं, रोबोट स्वतः pretreatment, समाधान, और washes, सभी कुओं, 850 μL 25 मिमी एसीटेट बफर के साथ 5 बार हटा. rinses pretreatment समाधान बफर जोड़ने, और बाद में नमूना में ठोस व्यवस्थित करने के लिए अनुमति के बाद कुल मात्रा का 50% को दूर किया जाता है. आकांक्षा की ऊंचाई तरल करने के लिए अच्छी तरह से नीचे से ठोस aspirating से बचने के द्रव्यमान का आधे में सेट कर दिया जाता है, वहाँ इस दृष्टिकोण का उपयोग कर ठोस नगण्य नुकसान है. के बाद इन washes में अच्छी तरह से पीएच 4.5 और सामग्री एंजाइमी hydrolysis के लिए तैयार है.
- एक एंजाइम cellulases और hemicellulases के समाधान युक्त मिश्रण रोबोट द्वारा जोड़ा जाता है. प्रत्येक कुएं में एंजाइम मिश्रण के 850 μL तिरस्कृत और थाली एक 50 ° मिलाते सी इनक्यूबेटर में ले जाया जाता है. मानक hydrolysis 8 घंटे के लिए किया जाता है, लेकिन इस बार प्रयोग के प्रयोजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. मानक एंजाइम घास के लिए इस्तेमाल किया लोड हो रहा है FPU 7 / छ सामग्री की है.
4. शर्करा को कम करने की जांच
Hydrolysis के बाद जारी शर्करा को कम करने के निर्धारण एक संशोधित 3 - मिथाइल-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) 3 विधि का उपयोग किया था. MBTH सबसे उपयुक्त विधि के रूप में चुना गया था क्योंकि यह करने के लिए स्वचालित रूप से सबसे आसान और कम से कम प्रोटीन जैसे यौगिकों से हस्तक्षेप करने के लिए अतिसंवेदनशील था. हम रोबोट मंच पर इस्तेमाल के लिए इस बेहद संवेदनशील विधि संशोधित 250 μL है जो एक मानक ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से थाली के लिए उपयुक्त है के अंतिम मात्रा के साथ इतना है कि यह सही बायोमास hydrolysates में सांद्रता में मौजूद शर्करा यों सकता है. सभी नीचे दिए गए चरणों को स्वतः ही प्रदर्शन कर रहे हैं और शर्करा को कम करने के तीन स्वतंत्र determinations प्रत्येक saccharification प्रतिक्रिया के लिए बाहर किए गए.
- Hydrolyzate के 30 μL गहरी अच्छी तरह से थाली से लिया गया था और एक skirted पीसीआर 96 अच्छी तरह से थाली में 25 मिमी सोडियम एसीटेट बफर के 45 μL के साथ मिश्रित.
- 1N NaOH के 25 μL और 0.43 मिलीग्राम / एमएल MBTH और 0.14 मिलीग्राम / मिलीलीटर डीटीटी युक्त समाधान के 50 μl जोड़ा गया था.
- मिश्रण के बाद, पीसीआर प्लेट 60 में गर्म था ° सी एक thermocycler या इसी तरह की युक्ति है कि सभी 96 कुओं के लिए गर्मी के बिल्कुल एक ही राशि के उद्धार में 20 मिनट के लिए.
- परिणामी प्रतिक्रिया एक ऑप्टिकल प्लेट को हस्तांतरित किया गया.
- Oxidising अभिकर्मक (0.2 FeNH4% (SO4) 2, 0.2% sulfamic एसिड और 0.1% एचसीएल) के 100 μl जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और एच. कम से कम 1 के लिए विकसित करने के लिए छोड़
- प्रत्येक थाली भी 50 nmol है, 100 nmol और 150 nmol ग्लूकोज के मानक प्रतिक्रियाओं को शामिल करना चाहिए . ऑप्टिकल प्लेटें 620 एनएम पर पढ़ रहे हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
विश्लेषण के विभिन्न प्रकार के के उदाहरण आंकड़ा 3 और 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं. सभी परिणाम स्वचालित मंच का उपयोग करके प्राप्त किया गया. 3 फिर से चित्राcellulolytic एंजाइमों की बढ़ती मात्रा के साथ जमीन चिनार से 8 घंटे incubations द्वारा जारी शर्करा को कम करने में वृद्धि प्रस्तुत करता है. चित्रा 4 एसिड और चिनार के नमूने पर क्षारीय pretreatment के प्रभाव को प्रस्तुत करता है. NaOH pretreatment अधिक कुशल है कि hydrolysis के दौरान शर्करा की रिहाई की सुविधा में जलमिश्रित H2SO4 pretreatment. hydrolysis के बाद मापा शर्करा की मात्रा घट जाती है जब pretreatment NaOH 1M की तुलना में उच्च सांद्रता का उपयोग किया जाता है.
चित्रा 1 पीस और 96 बायोमास की अच्छी तरह से स्वरूपण के लिए रोबोट स्टेशन .
चित्रा 2 उच्च Throughput saccharification विश्लेषण के लिए तरल से निपटने स्टेशन.
चित्रा 3 अलग एंजाइम loadings के चिनार के नमूने से चीनी समकक्ष को कम करने की रिहाई पर प्रभाव.
चित्रा 4 अलग pretreatments चिनार नमूनों की saccharification पर प्रभाव. H2SO4 के विभिन्न प्रतिशत के साथ 90 Pretreament ° सी 30 मिनट के लिए के बाद जारी शुगर्स. बी एसिड pretreatment से ही तापमान और समय पर NaOH pretreatments के बाद जारी शुगर्स .
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों cellulolytic एंजाइमों के उपहार के लिए एक Viksø नीलसन (Novozymes) को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम FP7 नवीनीकरण और बीबीएसआरसी BB/G016178 और BB/G016194 परियोजनाओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
