Summary
Un método simple, rápido para determinar el potencial de la sacarificación de un gran número de muestras de biomasa vegetal se describe. La plataforma automatizada para este análisis consiste en la preparación de la biomasa vegetal para su análisis en placas de 96 pozos y la realización posterior de pretratamiento, hidrólisis y la cuantificación de los azúcares liberados.
Abstract
Polisacáridos que forman la biomasa lignocelulósica planta se puede dividir para producir una amplia gama de azúcares que puedan ser utilizados posteriormente en el establecimiento de una biorrefinería. Estas materias primas que constituyen una nueva plataforma industrial, que sea sostenible y neutral de carbono, para reemplazar a la actual dependencia de combustibles fósiles. La obstinación de la deconstrucción observado en los materiales lignocelulósicos es producido por varias propiedades intrínsecas de las paredes celulares vegetales. Celulosa cristalina está integrada en los polisacáridos de la matriz como xilanos y arabinoxilanos, y toda la estructura está recubierta por el fenólicos polímero de la lignina, que es también difícil de digerir 1. Con el fin de mejorar la digestibilidad de las materias vegetales que tenemos que descubrir los principales obstáculos para la sacarificación de las paredes celulares y mutante de la pantalla y las poblaciones de mejoramiento para evaluar la variabilidad en la sacarificación 2. Estas tareas requieren un enfoque de alto rendimiento y aquí se presenta una plataforma de análisis que puede realizar un análisis de sacarificación en un formato de placa de 96 pocillos. Esta plataforma ha sido desarrollada para permitir la detección de la digestibilidad de la materia leñosa de las grandes poblaciones de especies de plantas variadas. Hemos reducido los volúmenes de reacción para el pretratamiento suave, la hidrólisis enzimática parcial y la determinación de azúcar, para permitir que un gran número para ser evaluados rápidamente en un sistema automatizado.
Esta plataforma automatizada trabaja con cantidades de miligramos de biomasa, rendimiento de molienda por bolas en condiciones controladas para reducir el material vegetal a un tamaño de partícula estándar de una manera reproducible. Una vez que las muestras son de tierra, el robot automatizado formato dispensa cantidades específicas y del material registrado en los pocillos correspondientes de la placa de 96 pozos profundos (Figura 1). Normalmente, dispensar el mismo material en 4 pozos de tener 4 repeticiones para el análisis. Una vez que las placas se llena con el material vegetal en el diseño deseado, que se mueven manualmente a una estación de manejo de líquidos (Figura 2). En esta estación las muestras son sometidas a un tratamiento previo leve, ya sea con ácido diluido o alcalino y se incubaron a temperaturas de hasta 90 ° C. La solución de pre-tratamiento se retira posteriormente y las muestras se lavan con tampón para volver a un pH adecuado para la hidrólisis. Las muestras se incubaron con una mezcla de enzimas durante un período variable de tiempo a 50 ° C. Una alícuota se toma a partir del hidrolizado y los azúcares reductores se determina automáticamente por el método colorimétrico MBTH.
Protocol
1. Preparación de las muestras
Normalmente trabajo con tallos herbáceos o de cualquiera de las plantas leñosas. En el caso de las materias herbáceas que crecen las plantas a la madurez, y después de desarrollo de la semilla que obtenemos los tallos secos, una vez se haya completado la senescencia. Los tallos se cortan en segmentos de 4 mm y se colocan en viales de 2 ml con tres bolas de molienda. En el caso de materiales leñosos, las muestras se muelen a grueso aserrín de madera con un archivo de curso y se coloca en un molino de bolas para su posterior procesamiento.
Las muestras se colocan en un estante en la molienda / formato de la estación (Figura 1). Esta estación forma secuencial muele, se mezcla, y un peso de cada muestra. El número de repeticiones necesarias para cada muestra se estableció mediante pruebas de los materiales del suelo en una serie de experimentos preliminares en donde se determina la variabilidad intrínseca de un tamaño de partícula determinado. Los viales de 2 ml se perforan en la parte inferior y los materiales son distribuidos por la vibración de la ampolla en el pozo seleccionado. El brazo de vibración es controlada por una retroalimentación del equilibrio que permite la dosificación precisa de la pólvora. El robot dispensa 4 mg / pocillo en un análisis estándar y 4 repeticiones son necesarias en la mayoría de los casos. Esto permite que 20 muestras de plantas / placa para ser analizados.
2. Pretratamiento
Una vez que las muestras tienen el formato, las placas de 96 pozos son procesadas por un sistema automatizado de manejo de líquidos (Figura 2). Aquí un pretratamiento suave se realiza en los materiales vegetales mediante la adición de 350 l de soluciones ácidas o alcalinas y el calentamiento de la placa en un edificio adaptado. Para evitar la evaporación durante el análisis, el 96 y placas se sellan con un mate de silicona. La temperatura y el tiempo de la pre-tratamiento se puede modificar de acuerdo a los materiales objeto de estudio. La temperatura máxima, sin embargo, es de 100 ° C. Un procedimiento alternativo para la prueba más dura pretratamientos es dar tratamiento previo a los materiales fuera de línea y eliminar la pretreatmet del proceso.
3. Hidrólisis
- Después de que los materiales son tratados previamente, el robot elimina automáticamente la solución pre-tratamiento, y se lava, todos los pozos, 5 veces con 850 l de tampón acetato 25 mM. Los enjuagues se llevan a cabo mediante la adición de tampón de la solución pre-tratamiento, y posteriormente retirar el 50% del volumen total después de permitir que los sólidos en la muestra a un acuerdo. La altura de la aspiración es igual a la mitad de la masa líquida para evitar la aspiración de sólidos desde el fondo del pozo, hay una pérdida insignificante de los sólidos utilizando este enfoque. Después de estas soluciones el pH en el pozo es de 4,5 y el material está listo para la hidrólisis enzimática.
- Una mezcla de enzimas que contienen una solución de celulasas y hemicelulasas se añade por el robot. En cada pozo, 850 l de mezcla de enzimas se dispensa y la placa se mueve en un 50 ° C incubadora de agitación. La hidrólisis se lleva a cabo estándar de 8 horas, pero esta vez se puede adaptar a la finalidad del experimento. La carga de la enzima estándar utilizado para los pastos es de 7 FPU / g de material.
4. La detección de azúcares reductores
Determinación de azúcares reductores liberados después de la hidrólisis se realizó mediante una modificación de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrozona (MTBH) el método 3. MBTH fue seleccionado como el método más adecuado, porque era el más fácil de automatizar y el menos susceptible a la interferencia de estos compuestos como las proteínas. Hemos modificado este método altamente sensible para su uso en la plataforma robótica para que pueda cuantificar con precisión los azúcares en las concentraciones presentes en los hidrolizados de biomasa, con un volumen final de 250 l, que es adecuado para un nivel óptico de 96 pocillos. Todos los pasos se realizan automáticamente y tres determinaciones independientes de los azúcares reductores se llevaron a cabo para cada reacción de sacarificación.
- 30 l de hidrolizado fue tomada de la placa de pozo profundo y se mezcla con 45 l de 25 mM de tampón acetato de sodio en una falda PCR 96 pocillos.
- 25 l de NaOH 1N y 50 l de una solución que contiene 0,43 mg / ml y 0,14 MBTH TDT mg / mL.
- Después de mezclar, la placa de PCR se calentó a 60 ° C durante 20 minutos en un termociclador o un dispositivo similar que ofrece exactamente la misma cantidad de calor para los 96 pozos.
- La reacción resultante se transfirió a una placa óptica.
- Añadir 100 ml de reactivo oxidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% de ácido sulfámico y el 0,1% HCl). Mezclar bien y dejar a desarrollar por lo menos durante 1 h.
- Cada plato debe contener también las reacciones estándar de 50 nmol, 100 y 150 nmol glucosa nmol. Las placas se leen óptica a 620 nm.
5. Los resultados representativos:
Ejemplos de diferentes tipos de análisis se presentan en la figura 3 y 4. Todos los resultados se obtuvieron mediante el uso de la plataforma automatizada. Figura 3 representa el aumento de los azúcares reductores liberados por 8 h incubaciones de álamo suelo con cantidades crecientes de enzimas celulolíticas. La Figura 4 muestra los efectos del ácido alcalino y pretratamiento de las muestras de álamo. El pretratamiento con NaOH es más eficiente que el pretratamiento con H2SO4 diluido para facilitar la liberación de los azúcares en la hidrólisis. La cantidad de azúcares medidos después de la hidrólisis disminuye cuando el tratamiento previo se realiza con concentraciones superiores a 1M NaOH.
Figura 1. Robótico de la Estación para la molienda y el 96 y el formato de la biomasa
Figura 2. Estación de manejo de líquidos para el análisis de rendimiento de sacarificación de alta
Figura 3. Efecto de las cargas de enzimas diferentes en el lanzamiento de la reducción equivalente de azúcar a partir de muestras de álamo
Figura 4. Efecto de pretratamientos diferentes en la sacarificación de las muestras de álamo. Azúcares A. en libertad después de pretreament con diferentes porcentajes de H2SO4 a 90 ° C durante 30 minutos. B. Azúcares en libertad después de pretratamientos de NaOH a la misma temperatura y el tiempo que el pretratamiento con ácido .
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a un Viksø-Nielsen (Novozymes) por el don de las enzimas celulolíticas. Este trabajo fue financiado por el 7PM RENOVACIÓN y por los proyectos de BBSRC BB/G016178 y BB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
