Summary
Bitki biyokütle örnekleri çok sayıda saccharification potansiyeli belirlemek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu analiz için otomatik bir platform 96 kuyucuğu ve yayımlanan şekerler hazırlama, hidroliz ve miktar daha sonraki performans analizi için bitki biyokütle hazırlık içerir.
Abstract
Bitki lignocellulosic biyokütle makyaj polisakkaritler daha sonra bir biorefinery kurulmasında kullanılabilir şekerlerin bir dizi üretmek için ayrılabilir. Bu hammaddeler, mevcut fosil yakıt bağımlılığını yerine, sürdürülebilir ve karbon nötr bir yeni sanayi platformu, oluşturacaktır. Lignocellulosic malzemeleri gözlenen yapı sökümüne dinlemezlik bitki hücre duvarları çeşitli içsel özelliklerine göre üretilir. Kristal selüloz xylans ve arabinoxylans olarak matris polisakkaritler gömülü ve 1 sindirmek için de zor olan fenolik polimer lignin, tüm yapı kaplı. Saccharification 2 değişkenliği değerlendirmek için saccharification için hücre duvarlarının önemli darboğazlar ve aynı zamanda ekran mutant ve üreme nüfusu keşfetmek gerekir sindirilme bitki materyali geliştirmek için. Bu görevler, yüksek kapasiteli bir yaklaşım gerektirir ve burada 96-plaka formatında saccharification analizi gerçekleştirebilir analitik bir platform sunuyoruz. Bu platform, çeşitli bitki türlerinin büyük popülasyonlarının lignoselüloz sindirilme tarama izin vermek için geliştirilmiştir. Biz çok sayıda otomatik bir sistem hızla değerlendirilmelidir izin vermek için nazik hazırlama, kısmi enzimatik hidroliz ve şeker tayini için reaksiyon hacmi küçülttüm.
Bu otomatik bir platform, tekrarlanabilir bir şekilde standartlaştırılmış bir parçacık boyutu bitki materyali azaltmak için kontrollü şartlar altında topu freze gerçekleştirirken miligram miktarda biyokütle ile çalışır. Zemin numuneleri sonra, otomatik biçimlendirme robot, 96 derin kuyu plaka (Şekil 1) karşılık gelen kuyu içine malzeme belirtilen ve kaydedilen miktarda dağıtır. Normalde 4 analiz için çoğaltır 4 kuyu içine aynı malzeme dağıtım. Plakalar istenilen düzende bitki materyali ile doldurulur sonra, bir sıvı taşıma istasyonu (Şekil 2) elle taşınır. Bu istasyondan numune seyreltik asit veya alkali ya da hafif bir tedavi öncesi tabi tutulur ve 90 ° C'ye kadar sıcaklıklarda inkübe Tedavi öncesi çözüm daha sonra kaldırılır ve örnekleri için uygun pH hidroliz dönmek için tamponu ile durulanır. Örnekler daha sonra 50 değişken uzunlukta bir zaman için bir enzim karışımı ° C ile inkübe Bir kısım hidrolizat alınan ve indirgen şekerler MBTH kolorimetrik yöntemi ile otomatik olarak belirlenir.
Protocol
1. Örneklerinin hazırlanması:
Biz normalde otsu ve odunsu bitkilerin ya sapları ile çalışır. Otsu malzemelerin durumda biz olgunluk bitkiler büyümeye ve tohum oluşumu yaşlanması tamamlandıktan sonra sonra biz kuru sapları toplamak. Sapları 4 mm parça halinde doğranmış ve üç öğütme topları ile 2 ml flakon yerleştirilir. Odunsu bir malzeme söz konusu olduğunda, örneklerin bir ders ahşap dosya ile kaba talaş zemin ve daha sonra daha fazla işlem için bir bilyalı değirmen yerleştirilir.
Örnekleri taşlama / istasyonu (Şekil 1) biçimlendirme içinde bir rafa yerleştirilir. Bu istasyon sırayla biler karışımları ve her bir örnek ağırlığındadır. Örnek başına gerekli tekrarlar, belirli bir parçacık boyutu için içsel değişkenlik belirlenir ön deneyler bir dizi zemin malzemesi test ederek kurulmuştur. 2 ml flakon altta deldi ve malzemeler seçilmiş iyi flakonun titreşim dağıtılmıştır. Titreşimli kol, toz doğru dağıtım için izin dengesi bir geri besleme tarafından kontrol edilir. Robot standart bir analiz / 4 mg yayar ve 4 tekrarlar durumlarda şartlarda ihtiyaç vardır. Bu 20 bitki örneklerinin / plaka analiz edilmesini sağlıyor.
2. Tedavi öncesi
Numunelerin biçimlendirilmiş sonra, 96-iyi plakalar, otomatik bir sıvı taşıma sistemi (Şekil 2) tarafından işlenir. Burada hafif bir tedavi öncesi asit veya alkali çözeltiler 350 mcL ekleyerek ve uyarlanmış bir blok üzerine tabak ısıtma bitki materyali yapılır. Analizi sırasında buharlaşmasını önlemek için, 96 kuyucuğu bir silikon mat ile mühürlenir. Sıcaklığı ve süresi, tedavi öncesi çalışılan malzemeye göre değişiklik yapılabilir. Maksimum sıcaklık, ancak 100 ° C Sert ön işlemleri test etmek için alternatif bir prosedür, çizgi dışı malzemeler ön işlemden ve pretreatmet süreci ortadan kaldırmak için.
3. Hidroliz
- Malzemelerin ön tedavi edildikten sonra, robot, tedavi öncesi çözüm ve yıkar, tüm kuyuları, 5 kez 850 mcL 25 mM Asetat Tamponu otomatik olarak kaldırır. Çalkalama, tedavi öncesi bir çözüm tampon ekleyerek ve daha sonra örnek katıların yerleşmelerine izin verme sonra toplam hacminin% 50 kaldırarak tarafından yürütülmektedir. Aspirasyon yüksekliği iyi alt katıların aspire önlemek için sıvı kütlesinin yarısı; bu yaklaşımı kullanarak katıların ihmal kaybı. Bu yıkar sonra iyi pH 4.5 ve malzeme enzimatik hidroliz için hazırdır.
- Sellülazlar ve hemicellulases bir çözüm içeren bir enzim karışımı robot tarafından eklenir. Her kuyuya, 850 mcL enzim karışımı sürülür ve 50 ° C sallayarak inkübatör plaka taşınır. Standart hidroliz 8 saat için yapılır, ama bu sefer Deneyin amacı adapte edilebilir. Otlar için kullanılan standart bir enzim yükleme malzeme 7 FPU / g.
4. Indirgen şeker tespiti
Hidroliz sonra yayımlanan indirgen şeker tayini, modifiye edilmiş bir 3-metil-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) yöntemi 3 kullanılarak gerçekleştirildi . Otomatikleştirmek için en kolay ve protein gibi bileşikler girişime en az hassas olması nedeniyle MBTH en uygun yöntem olarak seçilmiştir. , Doğru, biyokütle hidrolizatların konsantrasyonlarında şekerler ölçmek öyle ki, Biz standart bir optik 96 plaka için uygundur 250 mcL nihai hacmi ile robot platformu kullanmak için bu son derece duyarlı bir yöntem değiştirdi. Altındaki tüm adımları otomatik olarak yapılır ve her saccharification reaksiyon için indirgen şekerler üç bağımsız tespitler yapılmıştır.
- Hidrolizat 30 mcL derin kuyu plaka alınan ve 25 mM Sodyum Asetat tampon etekli PCR 96 plaka 45 mcL ile karıştırılır.
- (25) 1N NaOH mcL ve 0.43 mg / ml MBTH ve 0.14 mg / ml DTT içeren bir çözüm 50 ul eklendi.
- Karıştırıldıktan sonra, PCR plaka 60 ısıtılmış ° C 20 dakika 96 kuyulara tam olarak aynı miktarda ısı sağlayan bir PCR veya benzeri bir cihaz.
- Ortaya çıkan reaksiyon optik plaka transfer edildi.
- Oksitleyici reaktif (% 0.2 FeNH4 (SO4) 2,% 0.2 SÜLFAMİK asit ve% 0.1 HCI) 100 ul ekleyin. En az 1 saat süreyle iyice karıştırınız ve geliştirmek için bırakın
- Her plakası da 50 nmol, 100 nmol ve 150 nmol glukoz standart reaksiyonlar içermelidir. Optik plakaları 620 nm'de okunur.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 3 ve 4 farklı türde analiz örnekleri sunulmaktadır. Otomatik platformu kullanarak tüm sonuçlar elde edildi. Şekil 3 tekrarselülolitik enzimlerin artan miktarlarda toprak kavak 8 saat inkubasyon tarafından yayımlanan indirgen şeker artış sunar. Şekil 4, asit ve alkali tedavi öncesi kavak numuneler üzerinde etkileri sunar. NaOH ön arıtma daha verimli olduğunu hidrolizi sırasında serbest bırakılması şekerler kolaylaştırmada seyreltilmiş H2SO4 tedavi öncesi. Hidroliz sonra ölçülen şekerlerin miktarı, tedavi öncesi 1M daha yüksek NaOH konsantrasyonları kullanılarak yapıldığında azalır.
Şekil 1 öğütme ve biyokütle 96 iyi biçimlendirme Robotik istasyonu
Şekil 2: Yüksek Verim saccharification analizi için sıvı taşıma istasyonu
Şekil 3 kavak örnekleri şeker benzerleri azaltarak serbest bırakılması farklı bir enzim yükleri Etkisi
NaOH ön işlemleri aynı sıcaklıkta ve saatte asit ön arıtma daha sonra serbest H2SO4 farklı yüzdeler ile Pretreament 90 ° C de 30 dakika sonra serbest Şekil 4 saccharification kavak örneklerinin farklı ön işlemleri Etkisi A. Şeker B. Şeker .
Disclosures
Biz ifşa etmek için bir şey var.
Acknowledgments
Yazarların Viksø-Nielsen (Novozymes) selülolitik enzimlerin hediye için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, 7.ÇP YENİLEME ve BBSRC projeleri BB/G016178 ve BB/G016194 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
