Summary
Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.
Abstract
Durante infecções bacterianas uma seqüência de interações ocorrem entre o patógeno e seu hospedeiro. Adesão bacteriana à superfície da célula hospedeira é muitas vezes o passo inicial e determinante da patogênese. Embora experimentalmente a adesão é mais estudado em condições estáticas de adesão ocorre realmente na presença de fluxo líquido. Primeiros encontros entre as bactérias e seu hospedeiro, muitas vezes ocorrem no nível das mucosas, boca, pulmão, intestino, olhos, etc, onde o muco flui ao longo da superfície das células epiteliais. Depois da infecção, patógenos, ocasionalmente, o acesso a circulação sanguínea causando doenças graves, como sepse, septicemia e meningite. A característica definidora dessas infecções é a habilidade desses patógenos para interagir com as células endoteliais na presença de sangue circulante. A presença de fluxo de muco, líquido ou sangue, por exemplo, determina a adesão porque gera uma força mecânica sobre o patógeno. Para caracterizar o efeito do fluxo de um líquido geralmente se refere à noção de tensão de cisalhamento, que é a força tangencial exercida por unidade de área por um fluido em movimento perto de uma parede fixa, expressa em dinas / cm 2. Intensidades de tensão de cisalhamento variam muito de acordo com o tipo de embarcações diferentes, o tamanho do órgão, localização etc (0-100 dinas / cm 2). Circulação nos vasos capilares pode atingir valores de tensão de cisalhamento muito baixas e até mesmo parar temporariamente durante períodos que variam entre alguns segundos a vários minutos 1. Na outra extremidade do espectro de tensão de cisalhamento nas arteríolas pode chegar a 100 dinas / cm 2 2. O impacto da tensão de cisalhamento em diferentes processos biológicos tem sido claramente demonstrado como por exemplo, durante a interação de leucócitos com o endotélio 3. Para levar em conta esse parâmetro mecânico no processo de adesão bacteriana aproveitamos um procedimento experimental baseado na utilização de um fluxo descartáveis câmara 4. Células hospedeiras são cultivadas em câmara de fluxo e bactérias fluorescentes são introduzidas no fluxo controlado por uma bomba de seringa. Inicialmente focada nossas investigações sobre o patógeno Neisseria meningitidis bacteriana, uma bactéria Gram-negativa responsável por septicemia e meningite. O procedimento descrito aqui nos permitiu estudar o impacto da tensão de cisalhamento sobre a capacidade das bactérias para: aderir às células 1, a proliferar na superfície da célula 5 e destacar a colonizar novos sites 6 (Figura 1). Informações técnicas complementares podem ser encontrados na referência 7. Valores de tensão de cisalhamento aqui apresentados foram escolhidos com base em nossa experiência anterior e 1 para representar os valores encontrados na literatura. O protocolo deve ser aplicável a uma ampla gama de patógenos, com ajustes específicos dependendo dos objetivos do estudo.
Protocol
1. Célula hospedeira humana e cultura bacteriana
- HUVECs cultura entre passagem 1 e 9 a 37 ° em uma incubadora umidificada com 5% (v / v) de CO 2. Passagem das células quando se aproximam de 80% confluência com tripsina / EDTA para fornecer culturas de manutenção em 75 cm 2 frascos de cultura e culturas experimentais em câmaras de fluxo descartáveis (μ-Slides VI).
- Retirar médio dos frascos para ser várias passagens, lavar as células com 10 ml de PBS, retirar e substituí-lo com 1,5 ml de tripsina / EDTA. Permitir que as células para separar uma cultura de células em incubadora por 5 minutos a 37 ° C.
- Coletar as células com 10 ml de meio de cultura de células em um tubo de coleta de 15 ml. Agregar as células com uma centrifugação de 5 minutos (a 200 g), à temperatura ambiente. Suspender as células em 4 ml de Endo-SFM suplementado com 10% (v / v) FBS e contá-los em uma câmara de Malassez, de acordo com as instruções do fabricante.
- Introduzir 30 mL de uma 1x10 6 células por ml de suspensão HUVEC no canal (3x10 4 no total) e permitir que as células a aderir durante 3 horas a 37 ° em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% (v / v) de CO 2. Adicionar um volume adicional de 120 mL de Endo-SFM para encher os poços. Células devem formar uma monocamada confluentes (Figura 2).
- Crescer N. meningitidis expressando GFP (neste caso a tensão 8013 GFP expressar sob o controle de um promotor IPTG indutível), em placas de agar GCB contendo suplementos Kellogg e 5 mg / ml de cloranfenicol, a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) CO 2 durante 16 horas.
2. Adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras
- Ajustar a concentração de bactérias cultivadas em placas de ágar GCB a um OD600 de 0,05 com pré-aquecido Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS e incubar por 120 minutos a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) de CO 2, sob agitação suave (130 rpm). Induzir a expressão GFP adicionando 1 mM IPTG para o meio de cultura para o período de incubação todo.
- Coloque o Slide-μ descartáveis no palco de um microscópio invertido equipado com uma plataforma aquecida para manter a temperatura da amostra a 37 ° C.
- Despeje pré-aquecido Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS em um copo de vidro esterilizado e encher uma seringa estéril 50 ml com este meio. Anexar a "entrada" tubulação para a seringa e encher com a introdução médio.
- Conecte o "entrada" para o tubo μ Slide-, com cuidado, a fim de evitar a introdução de ar na câmara. Então, apor a "saída" do tubo para o outro lado e, cuidadosamente, encher o canal com média de aproximadamente 1 cm de distância da câmara "exit".
- Medir o OD600 bacteriana e ajustar para 0,15 em Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS. A fim de olhar para as bactérias individual, qualquer agregados deve ser interrompido por vórtex vigoroso da amostra bacteriana.
- ML colocar 100 de Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS médio para o reservatório e adicionar 100 ml da solução bacteriana tomadas a partir do topo da solução agitadas para evitar qualquer amostragem restantes agregados de bactérias.
- Cuidadosamente introduzir o volume de 200 mL para o μ Slide-girando a torneira para injetar a bactéria para dentro da câmara.
- Introduzir Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com uma tensão de cisalhamento compatível com adesão de 0,044 dinas / cm 2 por 15 minutos.
Ver, por exemplo video 1 ou figura 3. Após esta etapa, mova os pontos 3, 4 ou 6.
3. Quantificação da adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras
- Após a adesão inicial de 15 minutos, adquirir imagens de dez campos aleatoriamente enquanto o líquido ainda está circulando.
- Analisar as imagens obtidas utilizando o software ImageJ 8, a fim de acessar o número médio de bactérias adherant por campo. Isto é feito da seguinte forma: em primeiro lugar, cada imagem é thresholded usando o "Threshold" janela encontrados no menu "Imagem" para destacar individuais aderir bactérias fluorescentes, minimizando o fundo das células. Então, cada única bactéria é contado, usando o Plug-In "Counter Cell" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Os dados para cada imagem são relatados em uma planilha do Excel e são em média de quantificar o número médio de bactérias aderentes por campo.
4. Medir a resistência ao fluxo de bactérias individuais aderentes para células hospedeiras
- Bomba da seringa programa set-up para gerar tensão de cisalhamento variando 3-100 dinas / cm 2 por 5 minutos.
- No final dos 5 minutos, adquirir dez campos escolhidos aleatoriamente, conforme descrito no passo 3.1, mas com o fluxo interrompido prior à aquisição.
- Analisar as imagens obtidas como descrito no passo 3.2 e quantificar o número médio de bactérias remanescentes por campo.
5. Medir o crescimento de uma bactéria isolada aderente a um microcolony
- Introduzir Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com o stress de cisalhamento escolhido por várias horas. Gravar imagens em tempo real microscopia de vídeo em um quadro a cada 5 minutos.
- Após microscopia de vídeo, parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software. Um exemplo da proliferação bacteriana pode ser visto no vídeo 2.
6. Medir a resistência ao fluxo de aderentes microcolônias bacteriana
- Após a formação de microcolônias grandes na superfície celular (step5.2) 03/02 adquirir imagens de ambas as células (por contraste de fase) e bactérias (por GFP-fluorescência) antes da aplicação do fluxo. Para o resto do experimento, o protocolo de aquisição vai monitorar somente a fluorescência.
- Aplicação de tensão de cisalhamento alta por 5 minutos (300-100 dinas / cm 2) e gravar imagens em um quadro a cada 5 segundos.
- Parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software.
- Em seguida, remover o "exit" tubo de primeira e com cuidado, para evitar o esvaziamento do canal e em seguida, adicione pré-aquecido meio fresco para encher os poços antes de remover a "entrada" da tubulação.
- Para determinar quantitativamente o efeito do estresse de cisalhamento sobre a resistência bacteriana, um ensaio de revestimento pode ser realizado da seguinte forma: recolher os restantes médio e lavar a μ Slide-duas vezes com 120 mL de PBS, que remove o meio restantes do canal (ambos lavagens são ) também coletados.
- Separar as células infectadas com a adição de 50 l de tripsina / EDTA por 5 minutos a 37 ° e misturar esta amostra isolada com a suspensão coletadas na etapa anterior.
- Realizar diluições em série em PBS e placa de uma fração 10 ml em placas de agar GCB, em triplicado, a fim de determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2.
Vídeos 3 e 4 comparam a estirpe selvagem com o mutante pilV.
7. Desapego bacteriana de microcolônias
- Infectar as células na câmara de fluxo, repetindo os passos 2.1 a 2.8 e permitem que a infecção se durante 30 minutos.
- Remover as bactérias não ligado, aumentando o fluxo para 10 dinas / cm 2 por um período de 2 minutos e permitir a infecção para continuar por 2h.
- Reduzir o fluxo para 0,15 dinas / cm 2.
- A cada hora, recolher uma gota de médios saindo da câmara de fluxo.
- Realizar diluições seriadas das amostras e da placa-los em placas de ágar GCB.
- Determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2.
8. Resultados representativos
Figura 1: Diferentes etapas de uma monocamada celular que pode ser observado e medido na presença de fluxo no processo.
Figura 2: monocamada de células endoteliais na câmara de fluxo no início de um experimento (ausência de tensão de cisalhamento). Cerca de 50 células endoteliais são organizadas em uma monocamada sub-confluentes.
Figura 3: Representação gráfica de adesão inicial de bactérias na superfície celular. Valores para três campos são indicados para dar uma idéia da variação de campo para campo, que é esperado (0.044 dinas / cm 2).
Vídeo 1. Visualization de adesão inicial de bactérias na monocamada celular como uma função do tempo (0044 dinas / cm 2). Expressando GFP-bactérias estão seguindo a direção do fluído. O filme é acelerado 60 vezes, a duração real do vídeo é de 10 minutos.
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Video 2. Depois de bactérias adesão inicial foram autorizados a se proliferar na superfície celular por um período de 7 horas (acelerada mil vezes).
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Vídeo 3. Após Proliferação na superfície celular do mecânicoal resistência de microcolônias foi testada através do aumento do nível de tensão de cisalhamento a 10 dinas / cm 2 por 5 minutos, mas microcolônias tipo selvagem são resistentes acelerou 60 vezes.
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Video 4. Microcolônias formado pelo mutante pilV são interrompidos por aumentar o fluxo (10 dinas / cm 2). Este mutante não induzir a remodelação da membrana plasmática sob microcolônias e é, portanto, mais altamente sensíveis ao aumento da tensão de cisalhamento (vídeo é acelerado 60 vezes) 5.
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Discussion
A importância da tensão de cisalhamento e, em geral de aspectos mecânicos em biologia é cada vez mais reconhecido. Por exemplo, as propriedades altamente adaptados adesivo da família Selectina de proteínas no processo de adesão de linfócitos e rolando na parede vascular tem sido reconhecida através da introdução de tensão de cisalhamento no processo. O procedimento descrito acima foi aplicado aos Gram-negativos bactéria Neisseria meningitidis, mas deve ser aplicável a uma ampla gama de patógenos. A importância da tensão de cisalhamento foi mostrado também para outros patógenos e sites de outras infecções. Adesão bacteriana condicionada pela tensão de cisalhamento foi descrita pelo estudo da adesina FimH encontrado em Escherichia coli uropathogenic (UPEC) 9. Semelhante ao selectinas, a interação entre FimH e seu receptor da célula hospedeira mostrou-se reforçada por cisalhamento induzida por forças mecânicas 9 eo CFAE adesina de E. coli enterotoxigênica foi relatado também para mediar a adesão de células do epitélio intestinal através de um corte-dependente mecanismo 10. Relatamos, usando o protocolo de fluxo laminar câmara de ensaio descritos neste capítulo que o Streptococcus agalactiae pili foram essenciais para a adesão deste patógeno a células epiteliais em condições de escoamento 11. Esses estudos confirmam que o nosso ensaio de câmara de fluxo é uma ferramenta útil para a investigação de células do hospedeiro-patógeno interações sob condições de estresse de cisalhamento.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Emilie Mairey e Emmanuel Donnadieu para a instalação inicial do procedimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
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