Summary
संक्रमण की प्रक्रिया के दौरान, एक महत्वपूर्ण कदम मेजबान कोशिकाओं के साथ रोगजनकों के आसंजन है. ज्यादातर मामलों में इस आसंजन कदम यांत्रिक तरल बह द्वारा उत्पन्न तनाव की उपस्थिति में होता है. हम एक तकनीक है कि बैक्टीरियल आसंजन के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में कतरनी तनाव परिचय का वर्णन.
Protocol
1. मानव मेजबान सेल और बैक्टीरिया संस्कृति
- 1 बीतने के और एक humidified इनक्यूबेटर में 5% (v / v) सीओ 2 के साथ 37 ° पर 9 के बीच संस्कृति HUVECs . पारित होने कोशिकाओं, जब वे trypsin / EDTA के साथ 80% संगम दृष्टिकोण के 75 सेमी 2 संस्कृति और प्रयोज्य प्रवाह कक्षों (छठी μ-स्लाइड्स) में बोतल प्रयोगात्मक संस्कृतियों पर रखरखाव संस्कृतियों प्रदान.
- Passaged जा बोतल से मध्यम वापस लेने, पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं धो, वापस लेने और यह trypsin / EDTA के 1.5 मिलीलीटर के साथ बदलें. कोशिकाओं एक सेल इनक्यूबेटर संस्कृति में 5 मिनट के लिए अलग डिग्री सेल्सियस के लिए 37 पर दें
- एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में सेल संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ले लीजिए. गोली एक 5 मिनट centrifugation के साथ कोशिकाओं (200 छ पर) कमरे के तापमान पर. इंडो - SFM के 4 मिलीलीटर 10% के साथ पूरक कोशिकाओं निलंबित FBS (v / v) और उन्हें एक Malassez कक्ष पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार, गिनती.
- चैनल (3x10 4 कुल) में प्रति मिलीलीटर निलंबन एक 1x10 6 HUVEC कोशिकाओं के 30 μl का परिचय और कोशिकाओं 37 पर 3 घंटे के लिए पालन करने के लिए ° 5% (v / v) सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में अनुमति देते हैं. इंडो - SFM के 120 μl की एक अतिरिक्त मात्रा जोड़ें करने के कुओं को भरने के लिए. कक्ष एक subconfluent monolayer (चित्रा 2) के रूप में करना चाहिए.
- एन आगे बढ़ें GCB अगर केलॉग की खुराक और 37 पर μg / chloramphenicol के मिलीलीटर 5 ° C एक नम वातावरण में 5% से युक्त (v / युक्त प्लेटों पर (इस मामले में तनाव 8013 IPTG-inducible प्रमोटर के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP) GFP व्यक्त meningitidis v) 16 घंटे के लिए सीओ 2.
2. व्यक्तिगत बैक्टीरिया के प्रारंभिक आसंजन कोशिकाओं को होस्ट करने के लिए
- 0.05 की एक OD600 GCB अगर प्लेटों पर पूर्व गर्म इंडो - SFM 120 मिनट के लिए 37 पर 10% (v / v) FBS और सेते ° युक्त एक नम वातावरण में 5% (v / युक्त सी के साथ हो जीवाणुओं की एकाग्रता समायोजित v), सीओ 2 कोमल मिलाते (130 आरपीएम) के तहत . पूरे ऊष्मायन अवधि के लिए संस्कृति के माध्यम में 1 मिमी IPTG जोड़कर GFP अभिव्यक्ति प्रेरित.
- 37 में नमूना का तापमान बनाए रखने के लिए एक गर्म मंच ° सी. के साथ एक औंधा सुसज्जित खुर्दबीन के मंच पर μ स्लाइड डिस्पोजेबल प्लेस
- एक बाँझ कांच बीकर में 2% के साथ पूर्व गर्म पूरक Endo SFM FBS (v / v) डालो और इस माध्यम के साथ एक बाँझ 50 मिलीलीटर सिरिंज को भरने. सिरिंज के लिए "प्रविष्टि" टयूबिंग संलग्न और मध्यम शुरू करने से भरें.
- "प्रविष्टि" μ-स्लाइड करने के लिए टयूबिंग कनेक्ट करते हैं, देखभाल के साथ, आदेश में चेंबर में हवा शुरू से बचने के लिए. फिर, "बाहर निकलें" ट्यूब प्रत्यय दूसरे छोर पर और ध्यान कक्ष "बाहर निकलें" से लगभग 1 सेमी की दूरी के माध्यम से चैनल को भरने.
- बैक्टीरियल OD600 उपाय और इंडो - SFM 2% (v / v) FBS युक्त में 0.15 समायोजित. आदेश में व्यक्तिगत बैक्टीरिया पर देखने के लिए, किसी भी समुच्चय बैक्टीरियल नमूना की जोरदार vortexing से बाधित होना चाहिए.
- प्लेस इंडो - SFM के 100 μl जलाशय में 2% (v / v) FBS मध्यम के साथ पूरक और बैक्टीरियल vortexed के लिए किसी भी शेष बैक्टीरिया समुच्चय नमूने से बचने के समाधान के ऊपर से लिया समाधान के 100 μl जोड़ें.
- पानी निकलने की टोंटी मोड़ के चेंबर में बैक्टीरिया इंजेक्षन द्वारा ध्यान से 200 μ-स्लाइड में μl मात्रा परिचय.
- 2% से युक्त इंडो - SFM (v / v) FBS, 37 पर बनाए रखा ° सी, गर्म मंच के साथ एक कतरनी तनाव 0.044 dynes / 15 मिनट के लिए 2 सेमी के आसंजन के साथ संगत के साथ एक सिरिंज पंप का उपयोग कर के चेंबर में है. परिचय
1 वीडियो या 3 आंकड़ा उदाहरण के लिए देखें . इस कदम के बाद, या तो 3 वर्गों, 4 या 6 करने के लिए कदम .
3. व्यक्तिगत बैक्टीरिया के प्रारंभिक आसंजन के मेजबान कोशिकाओं मात्रा का ठहराव
- 15 मिनट के लिए प्रारंभिक आसंजन के बाद, दस क्षेत्रों की छवियों को बेतरतीब ढंग से अधिग्रहण जबकि तरल अभी भी घूम रहा है.
- अधिग्रहीत ImageJ 8 सॉफ्टवेयर, क्रम में करने के लिए क्षेत्र के प्रति adherant बैक्टीरिया का मतलब संख्या तक पहुँच का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण. यह रूप में इस प्रकार किया जाता है: सब से पहले, प्रत्येक छवि "थ्रेसहोल्ड" "छवि" मेनू में पाया व्यक्ति पालन फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया पर प्रकाश डाला, जबकि कोशिकाओं से कम से कम पृष्ठभूमि विंडो का उपयोग thresholded है. फिर, हर एक जीवाणु, "सेल काउंटर" (में प्लग का उपयोग करके गिना जाता है http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html) . प्रत्येक छवि के लिए डेटा एक एक्सेल स्प्रेडशीट में रिपोर्ट कर रहे हैं और कर रहे हैं करने के लिए क्षेत्र के प्रति पक्षपाती बैक्टीरिया का मतलब संख्या यों औसत.
4. व्यक्तिगत बैक्टीरिया के मेजबान कोशिकाओं के अनुयायी प्रवाह करने के लिए प्रतिरोध माप
- कार्यक्रम सिरिंज पंप सेट अप कतरनी 3 से 5 मिनट के लिए 100 dynes / 2 सेमी लेकर तनाव उत्पन्न.
- 5 मिनट के अंत में, दस बेतरतीब ढंग से चुना 3.1 चरण में वर्णित के रूप में क्षेत्रों के अधिग्रहण, लेकिन प्रवाह के साथ जनसंपर्क रोकाअधिग्रहण के लिए आईओआर.
- अधिग्रहीत छवियों के रूप में 3.2 चरण में वर्णित विश्लेषण और क्षेत्र के अनुसार शेष बैक्टीरिया का मतलब संख्या यों.
5. एक microcolony के लिए एक पृथक पक्षपाती जीवाणु के विकास को मापने
- इंडो - SFM 10% (v / v) FBS, 37 पर बनाए रखा ° सी गर्म मंच के साथ, कई घंटे के लिए चुना कतरनी तनाव के साथ एक सिरिंज पंप का उपयोग चेंबर में. युक्त परिचय वास्तविक समय वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए एक फ्रेम हर 5 मिनट पर रिकॉर्ड छवियों.
- वीडियो माइक्रोस्कोपी के बाद, सिरिंज पंप को बंद करके कतरनी तनाव को रोकने, 2-3 अतिरिक्त छवियों के अधिग्रहण और फिर सॉफ्टवेयर पर छवि अधिग्रहण अनुक्रम बंद है. जीवाणु प्रसार का एक उदाहरण 2 वीडियो पर देखा जा सकता है.
6. पक्षपाती बैक्टीरियल microcolonies के प्रवाह के लिए प्रतिरोध माप
- सेलुलर सतह पर बड़े microcolonies के गठन के बाद (step5.2) प्रवाह आवेदन से पहले दोनों कोशिकाओं के 2-3 छवियाँ (चरण विपरीत द्वारा) और बैक्टीरिया (GFP-प्रतिदीप्ति द्वारा) के अधिग्रहण. प्रयोग के बाकी के लिए, अधिग्रहण प्रोटोकॉल केवल प्रतिदीप्ति की निगरानी करेंगे.
- 5 (300-100 dynes / 2 सेमी) मिनट और रिकॉर्ड छवियों के लिए एक फ्रेम हर 5 सेकंड में उच्च कतरनी तनाव लागू .
- सिरिंज पंप को बंद करके बंद करो कतरनी तनाव, 2-3 अतिरिक्त छवियों के अधिग्रहण और फिर सॉफ्टवेयर पर छवि अधिग्रहण अनुक्रम बंद है.
- अगला, "बाहर निकलें" टयूबिंग पहले हटाने और ध्यान से, चैनल खाली से बचने और फिर पूर्व गर्म ताजा मध्यम जोड़ने के लिए "प्रविष्टि" टयूबिंग हटाने से पहले कुओं को भरने.
- मात्रात्मक बैक्टीरियल प्रतिरोध पर कतरनी तनाव के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, एक चढ़ाना परख निम्नानुसार प्रदर्शन किया जा सकता है: शेष मध्यम इकट्ठा करने और μ-स्लाइड पीबीएस के 120 μl है, जो चैनल (दोनों washes से शेष मध्यम को हटा के साथ दो बार धोने भी एकत्र).
- 37 ° पर 5 मिनट के लिए trypsin / EDTA के 50 μl के अलावा के साथ संक्रमित कोशिकाओं को अलग और पिछले चरण में एकत्र निलंबन के साथ यह अलग नमूना मिश्रण.
- पीबीएस और एक 10 GCB अगर प्लेटों पर μl तीन प्रतियों में, अंश प्लेट में धारावाहिक dilutions, क्रम में करने के लिए अगले दिन पर कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या (CFU) निर्धारित, 37 प्लेटों के ऊष्मायन के बाद प्रदर्शन ° इनक्यूबेटर में सी के साथ 5% (v / v) सीओ 2.
वीडियो 3 और 4 pilV उत्परिवर्ती के साथ जंगली प्रकार तनाव की तुलना.
7. Microcolonies से बैक्टीरियल टुकड़ी
- 2,8 करने के लिए 2,1 कदम दोहरा प्रवाह चैम्बर में कोशिकाओं द्वारा और संक्रमित संक्रमण के 30 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं.
- 10 dynes / 2 सेमी करने के लिए 2 मिनट की अवधि के लिए प्रवाह बढ़ाने के द्वारा अनबाउंड बैक्टीरिया निकालें और संक्रमण 2 के लिए जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं.
- 0.15 dynes / 2 सेमी के प्रवाह में कमी .
- हर घंटे, प्रवाह चैम्बर से बाहर आने के माध्यम से एक बूंद एकत्रित.
- GCB अगर प्लेटों पर नमूनों की और उन्हें थाली धारावाहिक dilutions प्रदर्शन.
- कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या (CFU) अगले दिन पर, प्लेटों के ऊष्मायन के बाद 37 ° सी एक इनक्यूबेटर में 5% (v / v) सीओ 2 के साथ निर्धारित करें.
8. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1: एक सेलुलर monolayer है कि और देखा जा सकता है प्रक्रिया में प्रवाह की उपस्थिति में मापा विभिन्न चरणों.
चित्रा 2: एक प्रयोग (कतरनी तनाव के अभाव) की शुरुआत में प्रवाह चैम्बर में Endothelial सेल monolayer. के बारे में 50 endothelial कोशिकाओं में उप मिला हुआ एक monolayer का आयोजन कर रहे हैं.
चित्रा 3: सेलुलर सतह पर जीवाणुओं की प्रारंभिक आसंजन के ग्राफिक प्रतिनिधित्व. तीन क्षेत्रों के लिए मान परिवर्तन क्षेत्र के लिए क्षेत्र (0044 dynes / 2 सेमी) की उम्मीद है की एक विचार दे करने के लिए संकेत कर रहे हैं.
1 वीडियो समय के एक समारोह (0,044 dynes / 2 सेमी) के रूप में सेलुलर monolayer पर बैक्टीरिया की प्रारंभिक आसंजन के दृश्य. GFP-व्यक्त बैक्टीरिया बह मध्यम की दिशा का अनुसरण कर रहे हैं. फिल्म 60 गुना तेजी से है, वीडियो की वास्तविक अवधि 10 मिनट है.
यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के लिए.
2 प्रारंभिक आसंजन बैक्टीरिया के बाद वीडियो 7 घंटे की अवधि (त्वरित 1000 गुना) के लिए सेलुलर सतह पर पैदा की अनुमति दी गई .
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3 प्रसार के बाद सेलुलर सतह पर वीडियो. मैकेनिकmicrocolonies के अल प्रतिरोध 10 dynes / 2 सेमी करने के लिए कतरनी तनाव का स्तर बढ़ रही है लेकिन जंगली प्रकार microcolonies प्रतिरोधी त्वरित 60 गुना कर रहे हैं 5 मिनट के लिए परीक्षण किया गया था.
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4 वीडियो pilV उत्परिवर्ती द्वारा गठित Microcolonies प्रवाह वृद्धि (10 dynes / 2 सेमी) द्वारा बाधित कर रहे हैं. इस उत्परिवर्ती microcolonies तहत प्लाज्मा झिल्ली की remodeling प्रेरित करने में विफल रहता है और इस प्रकार अधिक अत्यधिक वृद्धि हुई कतरनी तनाव (वीडियो 60 गुना तेजी से है) 5 के प्रति संवेदनशील है.
यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के लिए.
Discussion
कतरनी तनाव का महत्व और आम तौर पर जीव विज्ञान में यांत्रिक पहलुओं की तेजी से मान्यता प्राप्त किया जा रहा है है. उदाहरण के लिए अत्यधिक अनुकूलित लिम्फोसाइटों आसंजन और संवहनी दीवार पर रोलिंग की प्रक्रिया में प्रोटीन की selectin परिवार के चिपकने वाला गुण प्रक्रिया में कतरनी तनाव शुरू करने से मान्यता प्राप्त किया गया. ऊपर वर्णित की प्रक्रिया ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं नेइसेरिया meningitidis लिए आवेदन किया था लेकिन रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जाना चाहिए . कतरनी तनाव के महत्व को अन्य रोगज़नक़ों और अन्य संक्रमण साइटों के लिए किया गया है भी दिखाया गया है. बैक्टीरियल आसंजन कतरनी तनाव से वातानुकूलित uropathogenic Escherichia कोलाई (UPEC) 9 पर पाया FimH adhesin के अध्ययन के द्वारा वर्णित किया गया है . Selectins करने के लिए इसी प्रकार, FimH और अपने मेजबान सेल रिसेप्टर के बीच बातचीत कतरनी प्रेरित यांत्रिक 9 बलों और enterotoxigenic ई. कोलाई के CfaE adhesin से मजबूत होना दिखाया गया था भी सूचित किया गया है एक कतरनी पर निर्भर के माध्यम से आंतों उपकला कोशिकाओं के आसंजन मध्यस्थता 10 तंत्र. हम सूचना दी, चैम्बर लामिना का प्रवाह परख है कि स्ट्रैपटोकोकस agalactiae pili इस रोगज़नक़ के प्रवाह शर्तों के तहत 11 उपकला कोशिकाओं का पालन करने के लिए आवश्यक थे इस अध्याय में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग. इस तरह के अध्ययन की पुष्टि करते हैं कि हमारे प्रवाह चैम्बर परख कतरनी तनाव की शर्तों के तहत मेजबान कोशिका रोगज़नक़ बातचीत की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों एमिली Mairey और Emmanuel Donnadieu प्रक्रिया के प्रारंभिक स्थापित करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
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