Summary
Tijdens het infectieproces, een belangrijke stap is de hechting van pathogenen met gastheercellen. In de meeste gevallen deze hechting stap gebeurt in de aanwezigheid van mechanische spanning opgewekt door stromende vloeistof. Beschrijven we een techniek die schuifspanning introduceert als een belangrijke parameter in de studie van bacteriële hechting.
Abstract
Tijdens bacteriële infecties een reeks van interacties optreden tussen de ziekteverwekker en zijn gastheer. Bacteriële hechting aan de gastheercel oppervlak is vaak de eerste stap en het bepalen van de pathogenese. Hoewel experimenteel hechting wordt meestal bestudeerd in statische omstandigheden hechting vindt eigenlijk plaats in aanwezigheid van de stromende vloeistof. Eerste ontmoetingen tussen bacteriën en hun gastheer vaak voorkomen bij het mucosale niveau, mond, longen, darmen, ogen, enz. waar slijm stroomt langs het oppervlak van epitheelcellen. Later in infectie, ziekteverwekkers zo nu en dan toegang tot de bloedcirculatie waardoor levensbedreigende ziekten zoals bloedvergiftiging, sepsis en meningitis. Een kenmerkende eigenschap van deze infecties is het vermogen van deze pathogenen met endotheliale cellen interageren in aanwezigheid van circulerende bloed. De aanwezigheid van stromende vloeistof, slijm of bloed bijvoorbeeld, bepaalt hechting want het genereert een mechanische kracht op de ziekteverwekker. Te bepalen wat de werking van een stromende vloeistof meestal verwijst naar het begrip van shear stress, dat is de tangentiële kracht die wordt uitgeoefend per oppervlakte-eenheid door een vloeistof in beweging de buurt van een stilstaande muur, uitgedrukt in dynes / cm 2. Intensiteiten van shear stress verschillen sterk naar gelang de verschillende schepen type, de grootte, orgel, locatie etc. (0-100 dynes / cm 2). Circulatie in de haarvaten kunnen bereiken zeer lage shear stress waarden en zelfs tijdelijk te stoppen gedurende periodes variërend van enkele seconden tot enkele minuten een. Aan de andere kant van het spectrum schuifspanning in arteriolen kan oplopen tot 100 dynes / cm 2 2. De impact van shear stress op verschillende biologische processen is duidelijk aangetoond, zoals bijvoorbeeld tijdens de interactie van leukocyten met het endotheel 3. Om rekening te houden met deze mechanische parameter in het proces van bacteriële hechting hebben we geprofiteerd van een experimentele procedure gebaseerd op het gebruik van een wegwerp stroom kamer 4. Gastheer cellen worden gekweekt in de stroming kamer en fluorescerende bacteriën worden geïntroduceerd in de stroming gecontroleerd door een injectiepomp. We in eerste instantie ons onderzoek gericht op de bacteriële pathogenen Neisseria meningitidis, een Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor bloedvergiftiging en hersenvliesontsteking. De procedure die hier beschreven liet ons toe om de impact van de shear stress studie over het vermogen van de bacteriën om: zich te houden aan cellen 1, te prolifereren op het celoppervlak 5 en los naar nieuwe locaties 6 (figuur 1) te koloniseren. Aanvullende technische informatie is te vinden in referentie 7. Schuifspanning waarden hier gepresenteerde werden gekozen op basis van onze eerdere ervaringen 1 en de waarden gevonden in de literatuur te vertegenwoordigen. Het protocol moet worden toegepast op een breed scala van ziekteverwekkers met specifieke aanpassingen afhankelijk van de doelstellingen van de studie.
Protocol
1. Menselijke gastheer cel en bacteriecultuur
- Cultuur HUVEC tussen passage 1 en 9 bij 37 ° in een bevochtigde incubator met 5% (v / v) CO 2. Passage van de cellen als ze 80% confluentie aanpak met trypsine / EDTA onderhoud culturen leveren op 75 cm 2 cultuur flessen en experimentele culturen in wegwerp stromingskamers (μ-Slides VI).
- Terug te trekken medium van de kolven te worden gepasseerd, was de cellen met 10 ml PBS, te trekken en te vervangen door 1,5 ml trypsine / EDTA. Laat de cellen in een celkweek incubator los gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Het verzamelen van de cellen met 10 ml celkweekmedium in een 15 ml collectie buis. Pellet de cellen met een 5 minuten centrifugeren (bij 200 g), bij kamertemperatuur. Hang de cellen in 4 ml van de Endo-SFM aangevuld met 10% (v / v) FBS en ze op een Malassez kamer tellen, volgens de instructies van de fabrikant.
- Introduceer 30 pi van een 1x10 6 HUVEC cellen per ml suspensie in het kanaal (3x10 4 in totaal) en laat de cellen gedurende 3 uur bij 37 ° zich in een vochtige incubator met een atmosfeer van 5% (v / v) CO 2. Voeg een extra volume van 120 ul van de Endo-SFM om de putten te vullen. De cellen moeten vormen een subconfluent monolaag (figuur 2).
- Grow N. meningitidis uiten van GFP (in dit geval stam 8013 tot uitdrukking GFP onder de controle van een IPTG-induceerbare promotor), op GCB agarplaten die Kellogg's supplementen en 5 ug / ml chlooramfenicol bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% (v / v) CO 2 voor 16 uur.
2. De eerste hechting van individuele bacteriën aan gastheercellen
- Stel de concentratie van bacteriën gekweekt op GCB agar platen om een OD600 van 0,05 met voorverwarmd Endo-SFM met 10% (v / v) FBS en incubeer gedurende 120 minuten bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% (v / v) CO 2, onder zacht schudden (130 rpm). Induceren GFP expressie door toevoeging van 1 mM IPTG in het kweekmedium voor de hele incubatietijd.
- Plaats de wegwerp μ-Slide op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust met een verwarmd platform om het monster temperatuur op 37 ° C.
- Giet voorverwarmde Endo-SFM aangevuld met 2% (v / v) FBS in een steriele glazen beker en vul een steriele 50 ml spuit met dit medium. Bevestig de "intrede" slang aan de spuit en vul door de invoering van medium.
- Sluit de "intrede" slang aan op de μ-Slide, met zorg, om te voorkomen dat er lucht in de kamer. Vervolgens brengt de "exit" tube naar de andere kant en zorgvuldig vullen het kanaal met medium tot ongeveer 1 cm afstand van de kamer "exit".
- Meet de bacteriële OD600 en aan te passen aan 0,15 in de Endo-SFM met 2% (v / v) FBS. Om te kijken naar de individuele bacteriën, moet elke aggregaten worden verstoord door krachtige vortexen van de bacteriële monster.
- Plaats 100 pi van Endo-SFM aangevuld met 2% (v / v) FBS medium in het reservoir en voeg 100 ul van de bacteriële oplossing genomen vanaf de top van de gevortexed oplossing om te voorkomen dat sampling de resterende bacteriële aggregaten.
- Voorzichtig introduceren van de 200 ul volume in de μ-Slide door te draaien aan de kraan om de bacteriën te injecteren in de kamer.
- Introduceer Endo-SFM met 2% (v / v) FBS, gehandhaafd op 37 ° C met de verwarmde platform, in de kamer met een injectiespuit pomp met een schuifspanning compatibel is met de hechting van 0.044 dyne / cm 2 gedurende 15 minuten.
Zie bijvoorbeeld video 1 of figuur 3. Na deze stap, ofwel te verplaatsen naar secties 3, 4 of 6.
3. Kwantificering van de initiële hechting van individuele bacteriën aan gastheercellen
- Na de eerste hechting gedurende 15 minuten, willekeurig te verwerven beelden van tien velden, terwijl vloeistof is nog steeds in omloop.
- Analyseren van de verkregen beelden met behulp van de software ImageJ 8, om het gemiddelde aantal adherant bacteriën per veld te gaan. Dit gebeurt als volgt: in de eerste plaats, elk beeld is thresholded met de "Threshold" venster te vinden in de "Image" menu aan de individuele naleven fluorescerende bacteriën te markeren, terwijl het minimaliseren van de achtergrond van de cellen. Vervolgens wordt elke bacterie geteld, met behulp van de Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). De gegevens voor elk beeld worden gerapporteerd in een Excel-spreadsheet en zijn gemiddeld bij het gemiddelde aantal van het aanklevende bacteriën per veld te kwantificeren.
4. Het meten van de weerstand tegen stroom van individuele bacteriën aanhanger van gastheercellen
- Programmeer de injectiepomp set-up op shear stress, variërend 3-100 dynes / cm 2 gedurende 5 minuten te genereren.
- Aan het eind van de 5 minuten, te verwerven tien velden willekeurig gekozen zoals beschreven in stap 3.1, maar met de stroom mee gestopt prIOR aan de overname.
- Analyseren van de verkregen beelden zoals beschreven in stap 3.2 en kwantificeren van het gemiddelde aantal van de resterende bacteriën per veld.
5. Het meten van de groei van een geïsoleerde bacterie aanhanger naar een microcolony
- Introduceer Endo-SFM met 10% (v / v) FBS, gehandhaafd op 37 ° C met de verwarmde platform, in de kamer met behulp van een spuitpomp met de gekozen schuifspanning voor meerdere uren. Beelden opnemen voor real-time video microscopie op een frame om de 5 minuten.
- Volgende video microscopie, de shear stress te stoppen door het uitschakelen van de injectiepomp, verwerven max. 2-3 beelden en stop vervolgens de afbeelding overname volgorde op de software. Een voorbeeld van bacteriële proliferatie is te zien op video 2.
6. Het meten van de weerstand tegen doorstroming van het aanklevende bacteriële microkolonies
- Na de vorming van grote microkolonies op het celoppervlak (step5.2) te verwerven 2-3 beelden van beide cellen (door de fase-contrast) en bacteriën (door GFP-fluorescentie) voordat stroom applicatie. Voor de rest van het experiment, zal de overname protocol te controleren alleen de fluorescentie.
- Het toepassen van een hoge schuifspanning gedurende 5 minuten (300-100 dynes / cm 2) en de opnamen op een frame om de 5 seconden.
- Stop de schuifspanning door het uitschakelen van de injectiepomp, verwerven max. 2-3 beelden en stop vervolgens de afbeelding overname volgorde op de software.
- Vervolgens verwijdert u eerst de "exit" slangen en zorgvuldig om te voorkomen dat het legen van het kanaal en voeg vervolgens voorverwarmde vers medium om de putten te vullen voordat u de "entry" slang.
- Kwantitatief te bepalen van het effect van shear stress op de bacteriële resistentie, kan een plating test worden uitgevoerd als volgt: het verzamelen van de resterende medium en twee keer was de μ-Slide met 120 pi PBS, die de resterende medium verwijderd is van het kanaal (beide wast zijn ook verzameld).
- Maak de geïnfecteerde cellen met de toevoeging van 50 ul van trypsine / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° en meng deze vrijstaande monster met de ophanging verzameld in de vorige stap.
- Voer seriële verdunningen in PBS en de plaat een 10 ul fractie op GCB agar platen, in drievoud, in om het aantal kolonievormende eenheden (CFU) vast te stellen op de volgende dag, na incubatie van de platen bij 37 ° C in een incubator met 5% (v / v) CO 2.
Video's 3 en 4 vergelijken met de wild-type stam met de pilV mutant.
7. Bacteriële onthechting van microkolonies
- Cellen infecteren in de stroom kamer door het herhalen van de stappen 2,1 tot 2,8 en laat de infectie door te gaan gedurende 30 minuten.
- Verwijder de niet-gebonden bacteriën door toenemende stroom tot 10 dynes / cm 2 gedurende een periode van 2 minuten en laat infectie te blijven voor 2u.
- Verminder stroom naar 0,15 dynes / cm 2.
- Elk uur, verzamelen een druppel medium coming out van de flow kamer.
- Voer seriële verdunningen van de monsters en de plaat ze op GCB agar platen.
- Bepaal het aantal kolonievormende eenheden (CFU) op de volgende dag, na incubatie van de platen bij 37 ° C in een incubator met 5% (v / v) CO 2.
8. Representatieve resultaten
Figuur 1: Verschillende stappen van een cellulaire monolaag die kan worden waargenomen en gemeten in de aanwezigheid van stroming in de procedure.
Figuur 2: endotheelcellen monolayer in de stroom kamer aan het begin van een experiment (afwezigheid van shear stress). Ongeveer 50 endotheelcellen zijn georganiseerd in een sub-samenvloeiend monolaag.
Figuur 3: Grafische weergave van de initiële hechting van bacteriën op het celoppervlak. De waarden voor drie velden zijn aangeduid om een idee van het veld-to-veld variatie die wordt verwacht (0044 dynes / cm 2) te geven.
Video 1. Visualisatie van de initiële hechting van bacteriën op de cellulaire monolaag als een functie van de tijd (0044 dynes / cm 2). GFP expressie bacteriën zijn in de richting van het stromende medium. De film wordt versneld 60-voudig, de werkelijke duur van de video is 10 minuten.
Klik hier om de video te bekijken.
Video 2. Na de initiële hechting bacteriën mochten prolifereren op het celoppervlak voor een periode van 7 uur (versnelde 1000-voudig).
Klik hier om de video te bekijken.
Video 3. Na proliferatie op het celoppervlak van de monteural weerstand van microkolonies werd getest door het verhogen van de shear stress niveau om 10 dynes / cm 2 gedurende 5 minuten, maar wild-type microkolonies zijn resistent versneld 60-voudig.
Klik hier om de video te bekijken.
Video 4. Microkolonies gevormd door de pilV mutant worden verstoord door flow te verhogen (10 dynes / cm 2). Deze mutant niet aanzet tot de verbouwing van het plasmamembraan onder microkolonies en is dus meer zeer gevoelig voor hogere shear stress (video is 60-voudig versnelde) 5.
Klik hier om de video te bekijken.
Discussion
Het belang van shear stress en in het algemeen van de mechanische aspecten in de biologie wordt steeds meer onderkend. Bijvoorbeeld de zeer aangepast klevende eigenschappen van de selectine familie van eiwitten in het proces van lymfocyten hechting en rollen op de vaatwand is erkend door de invoering van shear stress in het proces. De hierboven beschreven procedure werd toegepast om de Gram-negatieve bacteriën Neisseria meningitidis, maar moet ook gelden voor een breed scala van ziekteverwekkers. Het belang van shear stress werd ook aangetoond voor andere ziekteverwekkers en andere infectie sites. Bacteriële hechting geconditioneerd door shear stress is beschreven door de studie van de FimH adhesine gevonden op uropathogene Escherichia coli (UPEC) 9. Net als bij selectines, de interactie tussen FimH en zijn gastheercel receptor bleek te worden versterkt door shear-geïnduceerde mechanische krachten 9 en de CFAE adhesine van enterotoxigene E.coli werd ook gemeld om de hechting te bemiddelen darmepitheelcellen via een afschuif-afhankelijke mechanisme 10. We gemeld, met behulp van de laminaire flow kamer assay protocol beschreven in dit hoofdstuk dat Streptococcus agalactiae pili essentieel waren voor de naleving van deze ziekteverwekker aan epitheliale cellen onder stromingscondities 11. Dergelijke studies bevestigen dat onze stroom kamer assay is een nuttig instrument voor het onderzoeken van de gastheercel-pathogeen interacties onder omstandigheden van shear stress.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Emilie Mairey en Emmanuel Donnadieu bedanken voor de eerste instelling van de procedure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
- Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
- Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
- Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
- Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
- Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
- Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).
