Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

Published: September 2, 2011 doi: 10.3791/3241

Summary

Under infektionen processen är ett viktigt steg vidhäftning av patogener med värdceller. I de flesta fall denna anslutning steget sker i närvaro av mekanisk påverkan som genereras av flytande vätska. Vi beskriver en teknik som introducerar skjuvspänningen som en viktig parameter i studien av bakteriell vidhäftning.

Abstract

Under bakteriella infektioner en sekvens av interaktioner sker mellan patogen och värd. Bakteriell vidhäftning till värdcellen ytan är ofta det första och avgörande steg i patogenes. Trots att experimentellt vidhäftning oftast studeras i statiska förhållanden vidhäftning faktiskt äger rum i närvaro av flytande vätska. Första mötet mellan bakterier och deras värd förekommer ofta på slemhinnor nivå, mun, lungor, tarm, ögon, etc. där slem flyter längs ytan av epitelceller. Senare på infektion, patogener tillgång ibland blodcirkulationen orsakar livshotande sjukdomar som blodförgiftning, sepsis och hjärnhinneinflammation. Ett utmärkande drag för dessa infektioner är möjligheten för dessa patogener att samverka med endotelcellerna i närvaro av cirkulerande blod. Förekomsten av flytande vätska, slem eller blod till exempel bestämmer anslutning eftersom det genererar en mekanisk kraft patogenen. Att karaktärisera effekten av flytande vätska brukar man refererar till begreppet skjuvspänningen, som är den tangentiella kraft som verkar per ytenhet av en vätska som rör sig nära en stationär vägg, uttryckt i dynes / cm 2. Intensitet skjuvspänningen varierar mycket beroende på de olika fartygen typ, storlek, orgel, plats mm (0-100 dynes / cm 2). Cirkulationen i kapillärerna kan nå mycket låga värden skjuvspänningen och även tillfälligt stopp under perioder på mellan några sekunder till flera minuter 1. På andra änden av skalan skjuvspänningen i arterioler kan nå 100 dynes / cm 2 2. Effekten av skjuvspänningen på olika biologiska processer har tydligt visat som till exempel under interaktionen av leukocyter med endotelet 3. Att ta hänsyn till detta mekaniska parameter i den process av bakteriell vidhäftning vi utnyttjat en experimentell som bygger på användning av en disponibel flöde kammare 4. Host celler odlas i flödet kammaren och fluorescerande bakterier införs i flödet styrs av en sprutpump. Vi fokuserade initialt våra undersökningar på bakteriell patogen Neisseria meningitidis, en Gram-negativ bakterie som ansvarar för blodförgiftning och hjärnhinneinflammation. Det förfarande som beskrivs här tillät oss att undersöka effekterna av skjuvspänningen på förmågan hos bakterierna att: ansluta sig till celler 1, att föröka sig på cellytan 5 och lösgöra att kolonisera nya platser 6 (figur 1). Kompletterande teknisk information finns i referens 7. Skjuvspänningen värden som redovisas här valdes utifrån våra tidigare erfarenheter 1 och för att representera värden som finns i litteraturen. Protokollet bör tillämpas på ett brett spektrum av patogener med vissa justeringar beroende på målen för studien.

Protocol

1. Mänskliga värdcellen och bakteriekultur

  1. Kultur HUVECs mellan passage 1 och 9 vid 37 ° i en fuktig kuvös med 5% (v / v) CO 2. Passage cellerna när de närmar sig 80% sammanflödet med trypsin / EDTA att tillhandahålla underhåll kulturer på 75 cm 2 kulturen kolvar och experimentella kulturer i disponibel flöde kammare (μ-Bilder VI).
  2. Dra medium från kolvarna ska passerats, tvätta cellerna med 10 ml PBS, ta ut och ersätta den med 1,5 ml trypsin / EDTA. Låt cellerna att lösgöra i en cellkultur inkubator i 5 minuter vid 37 ° C.
  3. Samla cellerna med 10 ml cellkulturmedium i en 15 ml provrör. Pellets cellerna med en 5 minuters centrifugering (200 g), vid rumstemperatur. Häng upp cellerna i 4 ml av Endo-SFM kompletterad med 10% (v / v) FBS och räkna dem på en Malassez kammare, enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Inför 30 ìl av en 1x10 6 HUVEC celler per ml suspension i kanalen (3x10 4 totalt) och låt celler att hålla sig i 3 timmar vid 37 ° i en fuktig kuvös med en atmosfär av 5% (v / v) CO 2. Lägg till en extra volym av 120 l av endo-hållbart skogsbruk för att fylla brunnarna. Celler bör bilda en subconfluent monolager (figur 2).
  5. Väx N. meningitidis uttrycka GFP (i detta fall stam 8013 uttrycker GFP under kontroll av en IPTG-inducible promotor), på GCB agarplattor som innehåller Kelloggs kosttillskott och 5 mikrogram / ​​ml av kloramfenikol vid 37 ° C i en fuktig atmosfär som innehåller 5% (v / v) CO 2 i 16 timmar.

2. Inledande vidhäftning av enskilda bakterier till värdceller

  1. Justera koncentrationen av bakterier som odlas på GCB agarplattor till en OD600 på 0,05 med förvärmda Endo-SFM med 10% (v / v) FBS och inkubera i 120 minuter vid 37 ° C i en fuktig atmosfär som innehåller 5% (v / v) CO 2, under försiktig skakning (130 rpm). Framkalla GFP uttryck genom att tillsätta 1 mM IPTG i odlingsmediet för hela inkubationstiden.
  2. Placera den disponibla μ-Skjut på scenen av ett inverterat mikroskop utrustat med en uppvärmd plattform för att hålla provet temperaturen vid 37 ° C.
  3. Häll förvärmda Endo-SFM kompletterad med 2% (v / v) FBS i en steril glasbägare och fyll en steril 50 ml spruta med detta medium. Fäst "entry" slang på sprutan och fylla genom att införa medium.
  4. Anslut den "posten" slangen till μ-Slide, med omsorg, för att undvika att införa luft in i kammaren. Sedan anbringa "exit" röret till andra änden och försiktigt fylla kanalen med medium till ca 1 cm avstånd från kammare "exit".
  5. Mät den bakteriella OD600 och anpassa sig till 0,15 i Endo-SFM innehållande 2% (v / v) FBS. För att se på enskilda bakterier måste varje aggregat störas av kraftig vortexa av bakterier provet.
  6. Häll 100 ìl av Endo-SFM kompletterad med 2% (v / v) FBS mediet i behållaren och tillsätt 100 ìl av bakteriella lösning som tagits ur toppen av vortexed lösningen för att undvika provtagning eventuella kvarvarande bakterier aggregat.
  7. Försiktigt introducera 200 l volym i μ-Skjut genom att vrida på kranen för att injicera bakterier i kammaren.
  8. Introducera Endo-SFM innehållande 2% (v / v) FBS, hålls vid 37 ° C med den uppvärmda plattformen, in i kammaren med hjälp av en spruta pump med en skjuvspänning kompatibel med vidhäftningen av 0,044 dynes / cm 2 i 15 minuter.

Se till exempel video-1 eller figur 3. Efter detta steg, antingen flytta till avsnitt 3, 4 eller 6.

3. Kvantifiering av initial vidhäftning av enskilda bakterier till värdceller

  1. Efter inledande vidhäftning i 15 minuter, få bilder av tio fält slumpmässigt medan vätskan fortfarande är i omlopp.
  2. Analysera förvärvade bilderna med hjälp av ImageJ programvaran 8, för att få tillgång medelantalet adherant bakterier per fält. Detta görs på följande sätt: först och främst är varje bild thresholded med "Threshold" fönster som finns i "Bild"-menyn för att markera enskilda följa fluorescerande bakterier, och samtidigt minimera bakgrund från cellerna. Då är varenda bakterie räknas, med hjälp av Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Uppgifterna för varje bild redovisas i ett Excel-ark och är i genomsnitt att kvantifiera det genomsnittliga antalet anhängare bakterier per fält.

4. Mätning av motstånd mot flödet av enskilda bakterier anhängare till värdceller

  1. Program sprutpumpen set-up för att generera skjuvspänningen varierar från 3 till 100 dynes / cm 2 i 5 minuter.
  2. I slutet av 5 minuter, få tio fält slumpmässigt vald som beskrivs i steg 3,1, men med flödet stoppas prIOR till förvärvet.
  3. Analysera förvärvade bilderna som beskrivs i steg 3,2 och kvantifiera det genomsnittliga antalet kvarvarande bakterier per fält.

5. Mätning av tillväxten av en isolerad anhängare bakterie till en microcolony

  1. Introducera Endo-SFM med 10% (v / v) FBS, hålls vid 37 ° C med den uppvärmda plattformen, in i kammaren med hjälp av en spruta pump med den valda skjuvspänningen i flera timmar. Spela in bilder för video i realtid mikroskopi på en bild varje 5 minuter.
  2. Efter video-mikroskopi, stoppa skjuvspänningen genom att stänga sprutpumpen, förvärva 2-3 ytterligare bilder och sedan stoppa sekvens bildtagning med programvaran. Ett exempel på bakteriell spridning kan ses på video 2.

6. Mätning av motstånd mot flödet av anhängare bakteriell microcolonies

  1. Efter bildandet av stora microcolonies på cellulär yta (step5.2) förvärva 2-3 bilder av både celler (med faskontrast) och bakterier (av GFP-fluorescens) innan flödet ansökan. För resten av försöket, kommer förvärvet protokollet övervaka endast fluorescens.
  2. Tillämpa hög skjuvspänning i 5 minuter (300-100 dynes / cm 2) och bilder spela in på en bild varje 5 sekunder.
  3. Stoppa skjuvspänningen genom att stänga sprutpumpen, förvärva 2-3 ytterligare bilder och sedan stoppa sekvens bildtagning med programvaran.
  4. Därefter tar du bort "exit" slang först och försiktigt, för att undvika att tömma kanal och sedan lägga förvärmda frisk mediet för att fylla brunnarna innan du tar bort "entry" slang.
  5. För att kvantitativt bestämma effekten av skjuvspänningen på bakterieresistens, kan en plätering analys utföras enligt följande: samla in återstående medel och tvätta μ-Slide två gånger med 120 l PBS, som tar bort de kvarvarande medel från kanalen (både tvättar är också samlas in).
  6. Lossa de infekterade cellerna med tillägg av 50 ìl av trypsin / EDTA i 5 minuter vid 37 ° och blanda detta fristående prov med fjädringen samlats i föregående steg.
  7. Utför seriespädningar i PBS och platta en 10 l bråkdel på GCB agarplattor, i tre exemplar, för att avgöra antalet kolonibildande enheter (CFU) på nästa dag, efter inkubering av plattorna vid 37 ° C i en inkubator med 5% (v / v) CO 2.

Videor 3 och 4 jämför den vilda stammen med pilV mutant.

7. Bakteriell avskildhet från microcolonies

  1. Infektera celler i flödet kammaren genom att upprepa steg från 2,1 till 2,8 och låta infektionen fortsätta i 30 minuter.
  2. Ta bort obundna bakterier genom att öka flödet till 10 dynes / cm 2 för en tid av 2 minuter och låt infektion fortsätta i 2h.
  3. Minska flödet till 0,15 dynes / cm 2.
  4. Varje timme, samla en droppe medel som kommer ut ur flödet kammaren.
  5. Utför seriella spädningar av proven och platta dem på GCB agarplattor.
  6. Bestäm antalet kolonibildande enheter (CFU) på nästa dag, efter inkubering av plattorna vid 37 ° C i en inkubator med 5% (v / v) CO 2.

8. Representativa resultat

Figur 1
Figur 1: Olika steg i en cellulär monolager som kan observeras och mätas i närvaro av flödet i förfarandet.

Figur 2
Figur 2: endotelceller monolager i flödet kammaren i början av ett experiment (frånvaro av skjuvspänning). Omkring 50 endotelceller är organiserade i en sub-konfluenta monolager.

Figur 3
Figur 3: Grafisk representation av första vidhäftning av bakterier på cellulär ytan. Värden för tre områden anges att ge en bild av fältet till fältet variation som förväntas (0044 dynes / cm 2).

Video 1. Visualisering av initial vidhäftning av bakterier på cellulär cellslager som funktion av tiden (0044 dynes / cm 2). GFP-uttryckande bakterier följer riktningen för strömmande medium. Filmen är snabbare 60-faldig, är den verkliga längden av video 10 minuter.
Klicka här för att se videon.

Video 2. Efter initial vidhäftning bakterier fick föröka sig på cellulär yta för en period på 7 timmar (accelererad 1000-faldig).
Klicka här för att se videon.

Video 3. Efter spridning på cellulär ytan mekanikernal motstånd microcolonies testades genom att öka skjuvspänningen nivå till 10 dynes / cm 2 i 5 minuter men vildtyp microcolonies är resistenta snabbare 60-faldigt.
Klicka här för att se videon.

Video 4. Microcolonies bildas av pilV muterade störs av flödet ökar (10 dynes / cm 2). Detta mutant inte förmå ombyggnaden av plasmamembranet i microcolonies och är därför mer känsliga till ökad skjuvspänning (video accelereras 60-faldig) 5.
Klicka här för att se videon.

Discussion

Vikten av skjuvspänningen och i allmänhet av mekaniska aspekter i biologi i allt större utsträckning erkänt. Till exempel den mycket anpassat självhäftande egenskaper selektin familj av proteiner i processen av lymfocyter vidhäftning och rullar på kärlväggen har erkänts genom att införa skjuvspänning i processen. Det förfarande som beskrivs ovan tillämpades på gramnegativa bakterier Neisseria meningitidis, men bör vara tillämplig på ett brett spektrum av patogener. Vikten av skjuvspänningen har visats även för andra patogener och andra webbplatser infektion. Bakteriell vidhäftning beroende av skjuvspänningen har beskrivits i studien av FimH adhesin finns på uropathogenic Escherichia coli (UPEC) 9. Liknande Selectins var samspelet mellan FimH och dess värdcell receptor visat sig vara stärkas genom skjuvning-inducerad mekaniska krafter 9 och CfaE adhesin av enterotoxinbildande E. coli har rapporterats även att medla vidhäftning till tarmens epitelceller via en sax-beroende mekanism 10. Vi rapporterade, med hjälp av laminärt flöde protokoll kammare analys beskrivs i detta kapitel att Streptococcus agalactiae pili var viktiga för efterlevnad av denna patogen till epitelceller i flöde 11. Sådana studier bekräftar att vårt flöde kammare analysen är ett användbart verktyg för att undersöka värdcellen-patogen interaktioner under förhållanden med skjuvspänning.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Emilie Mairey och Emmanuel Donnadieu för den inledande inrättandet av förfarandet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
μ-Slide VI0.4 flow kit IBIDI 80606
Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock BD Biosciences 300865
Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm Fisher Scientific R3603
3-way stopcock, 2 female luer to male luer Bio-Rad 7328103
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Inverted microscope, Nikon Nikon Instruments Eclipse Ti
CCD camera Hamamatsu Corp. ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD
ImageJ software National Institutes of Health Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
  2. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
  4. Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
  5. Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
  6. Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
  7. Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
  8. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  9. Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
  10. Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
  11. Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).

Tags

Immunologi 55 mikrobiologi blodkärl skjuvspänning blodflöde vidhäftning infektionssjukdomar hjärnhinneinflammation hjärna blodförgiftning sepsis
Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soyer, M., Duménil, G.More

Soyer, M., Duménil, G. Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion. J. Vis. Exp. (55), e3241, doi:10.3791/3241 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter