Summary
خلال عملية العدوى ، وخطوة رئيسية هي التصاق العوامل الممرضة مع الخلايا المضيفة. في معظم الحالات يحدث التصاق هذه الخطوة في وجود إجهاد المتولدة عن تدفق السائل. نحن تصف الاسلوب الذي يقدم إجهاد القص كمعلمة مهمة في دراسة التصاق البكتيريا.
Abstract
الالتهابات البكتيرية خلال سلسلة من التفاعلات التي تحدث بين العناصر الممرضة والمضيفة لها. التصاق البكتيريا إلى المضيف سطح الخلية غالبا ما يكون خطوة أولية وتحديد للالمرضية. على الرغم من أن معظمهم درس التصاق تجريبيا في ظروف ثابتة التصاق يحدث فعلا في وجود تدفق السائل. يصادف الأول بين البكتيريا والتي تستضيفهم وغالبا ما تحدث على مستوى الغشاء المخاطي والفم والرئة والأمعاء ، والعين... الخ ، حيث تدفق المخاط على سطح الخلايا الظهارية. في وقت لاحق العدوى ، ومسببات الأمراض في بعض الأحيان وصول الدورة الدموية مما تسبب أمراض تهدد الحياة مثل تعفن الدم ، وتسمم الدم والتهاب السحايا. والسمة المميزة لهذه الالتهابات هي قدرة هذه الجراثيم على التفاعل مع الخلايا البطانية في وجود تداول الدم. وجود تدفق السائل ، المخاط أو الدم على سبيل المثال ، تحدد التصاق لأنه يولد قوة ميكانيكية على الممرض. لتوصيف تأثير تدفق السائل one عادة ما يشير إلى مفهوم إجهاد القص ، الذي هو القوة المبذولة عرضية في وحدة المساحة التي يتحرك السائل بالقرب من الجدار ثابتة ، وأعرب في dynes / سم 2. شدة إجهاد القص تختلف على نطاق واسع وفقا لنوع السفن المختلفة ، وحجم والجهاز ، والموقع الخ (0-100 dynes / سم 2). ويمكن تداولها في الشعيرات الدموية منخفضة جدا تصل إلى قيم إجهاد القص والتوقف ولو مؤقتا خلال فترات تتراوح بين بضع ثوان إلى عدة دقائق 1. يمكن على الطرف الآخر من الطيف إجهاد القص في الشرايين dynes تصل إلى 100 / سم 2 2. وقد كان تأثير إجهاد القص على العمليات البيولوجية المختلفة بوضوح كما على سبيل المثال خلال التفاعل بين الكريات البيض مع 3 البطانة. على أن تأخذ في الاعتبار هذه المعلمة الميكانيكية في عملية التصاق البكتيريا اتخذنا الاستفادة من إجراء التجارب على أساس استخدام المتاح من تدفق غرفة 4. تزرع الخلايا المضيفة في غرفة التدفق ويتم إدخال البكتيريا الفلورسنت في تدفق تسيطر عليها مضخة الحقنة. ركزنا في البداية على تحقيقاتنا النيسرية السحائية الممرض الجرثومي ، وهي بكتيريا سالبة الجرام المسؤولة عن تسمم الدم والتهاب السحايا. ووصف الإجراء سمح لنا هنا لدراسة تأثير إجهاد القص على قدرة البكتيريا على : التمسك الخلايا 1 ، لتنتشر على سطح الخلية (5) وفصل لاستعمار المواقع الجديدة 6 (الشكل 1). ويمكن الاطلاع على معلومات فنية تكميلية في اشارة 7. وقد تم اختيار قيم إجهاد القص المقدمة هنا على أساس تجربتنا السابقة (1) وتمثل القيم الموجودة في الأدب. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق بروتوكول لطائفة واسعة من مسببات الأمراض مع تعديلات محددة تبعا لأهداف الدراسة.
Protocol
1. الإنسان الخلية المضيفة والثقافة البكتيرية
- HUVECs الثقافة بين مرور 1 و 9 إلى 37 درجة في حاضنة ترطيب مع 5 ٪ (V / V) CO 2. مرور الخلايا عند اقترابهم التقاء مع 80 ٪ التربسين / EDTA لتوفير الصيانة على الثقافات قوارير 75 سم 2 والثقافات ثقافة التجريبية في غرف تدفق المتاح (μ - الشرائح السادس).
- سحب متوسطة من قوارير أن passaged ، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني ، وسحب واستبدالها مع 1.5 مل من التربسين / EDTA. السماح لفصل الخلايا في خلية ثقافة حاضنة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- جمع الخلايا مع 10 مل من مستنبت الخلية في أنبوب جمع 15 مل. بيليه الخلايا مع الطرد المركزي 5 دقائق (في 200 غ) ، في درجة حرارة الغرفة. تعليق الخلايا في 4 مل من إندو - SFM تستكمل مع 10 ٪ (V / V) FBS واحصروهم على غرفة Malassez ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إدخال 30 ميكرولتر لخلايا 6 1x10 HUVEC في تعليق مل في قناة (3x10 4 الكل) وتسمح للخلايا الالتزام لمدة 3 ساعات مع 37 في جو من 5 ٪ (V / V) CO 2 في حاضنة ترطيب درجة. إضافة وحدة تخزين إضافية من 120 ميكرولتر من إندو - SFM لملء الآبار. وينبغي تشكيل خلايا المونولاير subconfluent (الشكل 2).
- نمو ن. السحائية معربا عن GFP (في هذه الحالة سلالة 8013 GFP معربا عن إطار السيطرة على المروج IPTG - محرض) ، على لوحات أجار GCB مكملات تحتوي على كيلوغ و 5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية في جو رطب تحتوي على 5 ٪ (V / ت) CO 2 لمدة 16 ساعة.
2. التصاق البكتيريا الفردية الأولية لاستضافة خلايا
- ضبط تركيز البكتيريا نما على لوحات أجار GCB إلى OD600 0.05 مسبقا مع حرارة إندو - SFM تحتوي على 10 ٪ (V / V) FBS واحتضان لمدة 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو رطب تحتوي على 5 ٪ (V / ت) CO 2 ، في ظل اهتزاز لطيف (130 دورة في الدقيقة). حمل التعبير GFP بإضافة 1 IPTG ملي في مستنبت للفترة حضانة كاملة.
- المكان المتاح μ - الشرائح على مرحلة مجهر مقلوب مجهزة منصة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة العينة في 37 درجة مئوية.
- صب قبل تحسنت إندو - SFM تستكمل مع 2 ٪ (V / V) FBS في دورق زجاجي معقم وملء محقنة معقمة 50 مل مع هذه الوسيلة. إرفاق "دخول" لأنابيب المحقنة وملء بإدخال المتوسط.
- توصيل "دخول" أنابيب إلى الشريحة - μ ، مع الرعاية ، وذلك لتجنب إدخال الهواء إلى الغرفة. ثم يلصق على "خروج" أنبوب إلى الطرف الآخر وملء بعناية مع القناة لمسافة متوسطة الطول حوالي 1 من "خروج" الغرفة.
- قياس وضبط OD600 البكتيرية إلى 0.15 في إندو - SFM تحتوي على 2 ٪ (V / V) FBS. من أجل نظرة على البكتيريا الفردية ، لا بد من تعطيل أي المجاميع التي vortexing قوية من العينة الجرثومية.
- 100 ميكرولتر من مكان إندو - SFM تستكمل مع 2 ٪ (V / V) FBS المتوسطة في المكمن وإضافة 100 ميكرولتر من الحل الجرثومية مأخوذة من أعلى vortexed حل لتجنب أي عينات الركام المتبقي البكتيرية.
- أعرض بعناية حجم 200 ميكرولتر في الشريحة ، من خلال تحويل μ محبس لحقن البكتيريا الى داخل القاعة.
- أعرض إندو - SFM تحتوي على 2 ٪ (V / V) FBS ، حافظت على 37 درجة مئوية مع منصة ساخنة ، في الغرفة باستخدام مضخة المحاقن مع إجهاد القص متوافق مع التصاق 0،044 dynes / سم 2 لمدة 15 دقيقة.
انظر على سبيل المثال الفيديو 1 أو الرقم 3. بعد هذه الخطوة ، إما نقل إلى أقسام 3 ، 4 أو 6.
3. الكمي للالتصاق البكتيريا الأولية للفرد في الخلايا المضيفة
- بعد التصاق الأولي لمدة 15 دقيقة ، والحصول على صور من عشرة حقول عشوائيا بينما السائل لا يزال ينتشر.
- تحليل الصور باستخدام برنامج المكتسبة ImageJ 8 ، من أجل الوصول إلى متوسط عدد البكتيريا adherant لكل حقل. يتم ذلك على النحو التالي : أولا وقبل كل شيء ، كل صورة thresholded باستخدام "عتبة" نافذة موجودة في قائمة "صورة" لتسليط الضوء على البكتيريا الفردية الفلورسنت الالتزام ، مع التقليل من الخلفية من الخلايا. ثم يتم عد كل جرثومة واحدة ، باستخدام المكونات في "خلية مكافحة" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). وأفادت بيانات عن كل صورة في جدول بيانات Excel ويتم حساب المتوسط لتقدير متوسط عدد البكتيريا الملتصقة في الميدان.
4. قياس مقاومة تدفق البكتيريا الفردية تمسكا الخلايا المضيفة
- برنامج ضخ حقنة انشاء لتوليد إجهاد القص تتراوح بين 3-100 dynes / سم 2 لمدة 5 دقائق.
- في نهاية الدقائق ال 5 ، والحصول على عشرة حقول تم اختيارهم عشوائيا كما هو موضح في الخطوة 3.1 ، ولكن مع توقف تدفق الأسبوعيةIOR إلى اقتناء.
- تحليل الصور المكتسبة كما هو موضح في الخطوة 3.2 و تقدير متوسط عدد البكتيريا المتبقية في الميدان.
5. قياس نمو البكتيريا المعزولة an ملتصقة إلى microcolony
- أعرض إندو - SFM تحتوي على 10 ٪ (V / V) FBS ، حافظت على 37 درجة مئوية مع منصة ساخنة ، في الغرفة باستخدام مضخة المحاقن مع التشديد على القص الذي تم اختياره لعدة ساعات. الصور سجل لالمجهري الفيديو في الوقت الحقيقي في إطار واحد كل 5 دقائق.
- التالية المجهري الفيديو ، وقف إجهاد القص عن طريق إيقاف ضخ حقنة ، والحصول على صور إضافية 2-3 ثم وقف تسلسل الحصول على الصور على البرنامج. ويمكن رؤية مثال على انتشار البكتيريا على الفيديو 2.
6. قياس مقاومة تدفق microcolonies البكتيرية ملتصقة
- بعد تشكيل microcolonies كبيرة على سطح الخلايا (step5.2) الحصول على صور 2-3 لكلا الخلايا (على النقيض من المرحلة) والبكتيريا (GFP بواسطة ومضان) قبل تطبيق التدفق. بالنسبة لبقية التجربة ، فإن اقتناء بروتوكول مراقبة فقط مضان.
- تطبيق إجهاد القص عالية لمدة 5 دقائق (300-100 dynes / سم 2) والصور السجل في إطار واحد كل 5 ثوان.
- وقف إجهاد القص عن طريق إيقاف ضخ حقنة ، والحصول على صور إضافية 2-3 ثم وقف تسلسل الحصول على الصور على البرنامج.
- المقبل ، إزالة "خروج" أنابيب أولا وبعناية ، لتجنب تفريغ القناة ومن ثم إضافة ما قبل حرارة متوسطة جديدة لملء الآبار قبل إزالة "دخول" الأنابيب.
- لتحديد كمي لتأثير إجهاد القص على مقاومة الجراثيم ، يمكن إجراء فحص الطلاء على النحو التالي : جمع المتوسطة المتبقية ، ويغسل μ - الشرائح مرتين مع 120 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ، الذي يزيل المتوسطة المتبقية من القناة (وكلاهما من يغسل ) التي جمعت أيضا.
- فصل الخلايا المصابة مع إضافة 50 ميكرولتر من التربسين / EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة ومزيج هذه العينة منفصلة مع تعليق جمعها في الخطوة السابقة.
- إجراء التخفيفات التسلسلي في برنامج تلفزيوني وطبق جزء 10 ميكرولتر على لوحات أجار GCB ، في ثلاث نسخ ، من أجل تحديد عدد الوحدات التي تشكل مستعمرة (كفو) في اليوم التالي ، وبعد حضانة لوحات عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5 ٪ (V / V) CO 2.
الفيديو 3 و 4 مقارنة نوع السلالة البرية مع pilV متحولة.
7. البكتيرية مفرزة من microcolonies
- تصيب الخلايا في غرفة تدفق بتكرار الخطوات 2،1-2،8 والسماح للعدوى والمضي قدما لمدة 30 دقيقة.
- إزالة البكتيريا عن طريق زيادة تدفق غير منضم الى 10 dynes / سم 2 لمدة 2 دقيقة ، والسماح للعدوى على مواصلة 2H.
- خفض تدفق إلى 0.15 dynes / سم 2.
- كل ساعة ، وجمع قطرة المتوسطة الخروج من الغرفة التدفق.
- إجراء التخفيفات التسلسلي للوحة العينات ومنهم على لوحات أجار GCB.
- تحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة (كفو) في اليوم التالي ، وبعد حضانة لوحات عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5 ٪ (V / V) CO 2.
8. ممثل النتائج
الشكل 1 : خطوات مختلفة لأحادي الطبقة الخلوية التي يمكن ملاحظتها وقياسها في وجود تدفق في الإجراء.
الشكل 2 : غشائي المونولاير خلية في غرفة التدفق في بداية تجربة (عدم وجود إجهاد القص). ويتم تنظيم حوالي 50 في الخلايا البطانية أحادي الطبقة الفرعية متموجة.
الشكل 3 : التمثيل البياني للالتصاق البكتيريا الأولية على سطح الخلايا. يشار إلى القيم لثلاثة حقول لإعطاء فكرة عن الاختلاف في الميدان إلى الحقل الذي يتوقع (0044 dynes / سم 2).
الفيديو 1. التصور الأولي للالتصاق البكتيريا على أحادي الطبقة الخلوية بوصفها وظيفة من الزمن (0044 dynes / سم 2). GFP - معربا عن البكتيريا هي التالية اتجاه المتوسطة المتدفقة. وتسارعت الفيلم 60 مرة ، ومدة الحقيقي من الفيديو هو 10 دقيقة.
انقر هنا لمشاهدة الفيديو.
سمح الفيديو 2. التصاق البكتيريا بعد الأولي لتتكاثر على سطح الخلايا لمدة 7 ساعات (1000 تسارعت أضعاف).
انقر هنا لمشاهدة الفيديو.
الفيديو 3 ، وبعد الانتشار على سطح الخلايا ميكانيكيتم اختبار مقاومة بن microcolonies عن طريق زيادة مستوى إجهاد القص إلى 10 dynes / سم 2 لمدة 5 دقائق ولكن microcolonies نوع البرية هي مقاومة تسارع 60 ضعفا.
انقر هنا لمشاهدة الفيديو.
تتعطل الفيديو 4. Microcolonies تشكلها متحولة pilV بواسطة زيادة تدفق (10 dynes / سم 2). هذا المسخ فشل للحث على إعادة تشكيل غشاء البلازما تحت microcolonies وبالتالي فهو أكثر حساسية عالية لزيادة إجهاد القص (تتسارع الفيديو 60 مرات) 5.
انقر هنا لمشاهدة الفيديو.
Discussion
ويتزايد الضغط على أهمية القص وعموما من الجوانب الميكانيكية في البيولوجيا يتم الاعتراف بها. على سبيل المثال تم التعرف على خصائص تكييف عالية لاصقة للأسرة Selectin من البروتينات في عملية التصاق الخلايا الليمفاوية والمتداول على جدار الأوعية الدموية عن طريق إدخال إجهاد القص في هذه العملية. تم تطبيق الإجراء المذكور أعلاه إلى السحائية سلبية الغرام النيسرية البكتيريا ولكن ينبغي أن ينطبق على طائفة واسعة من مسببات الأمراض. وقد تبين أهمية إجهاد القص أيضا لمسببات الأمراض الأخرى ومواقع عدوى أخرى. وقد وصف التصاق البكتيريا مشروطا إجهاد القص من خلال دراسة وadhesin FimH العثور على القولونية uropathogenic (UPEC) 9. وقد أبلغ مشابهة Selectins ، تبين أن التفاعل بين FimH ومستقبله الخلية المضيفة ليكون معززا القص بفعل القوى الميكانيكية (9) وadhesin CfaE من القولونية المعوي أيضا للتوسط لالتصاق الخلايا الظهارية في الأمعاء عن طريق تعتمد على القص آلية 10. وذكرت لنا ، وذلك باستخدام مقايسة غرفة التدفق الصفحي البروتوكول الموصوفة في هذا الفصل أن العقدية القاطعة للدر الشعرة كانت ضرورية لانضمام هذا الممرض إلى الخلايا الظهارية في ظل ظروف تدفق 11. مثل هذه الدراسات تؤكد أن لدينا غرفة فحص التدفق هو أداة مفيدة للتحقيق في الخلية المضيفة الممرض التفاعلات تحت ظروف إجهاد القص.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر اميلي Mairey Donnadieu وايمانويل ليصل الإعداد الأولي من هذا الإجراء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
- Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
- Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
- Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
- Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
- Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
- Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).
