Summary
Während der Infektion Prozess ist ein wichtiger Schritt der Adhäsion der Erreger mit Wirtszellen. In den meisten Fällen diese Haftung Schritt erfolgt in Gegenwart von mechanischer Beanspruchung durch fließende Flüssigkeit erzeugt. Wir beschreiben eine Technik, die Schubspannung führt als ein wichtiger Parameter bei der Untersuchung der bakteriellen Adhäsion.
Abstract
Während bakterielle Infektionen eine Folge von Wechselwirkungen zwischen Erreger und seinem Wirt. Bakterielle Adhäsion an der Zelloberfläche ist oft der erste und entscheidende Schritt der Pathogenese. Obwohl experimentell Haftung ist vor allem in statischen Bedingungen untersucht Haftung tatsächlich erfolgt in Anwesenheit von Flüssigkeit. Erste Begegnungen zwischen Bakterien und ihren Wirt oft an der Schleimhaut auf, Mund, Lunge, Darm, Auge, etc., wo Schleim fließt entlang der Oberfläche von Epithelzellen auftreten. Später in Infektion Erreger gelegentlich auf die Durchblutung verursacht lebensbedrohliche Krankheiten wie Blutvergiftung, Sepsis und Meningitis. Ein bestimmendes Merkmal dieser Infektionen ist die Fähigkeit dieser Erreger mit Endothelzellen in Anwesenheit von zirkulierenden Blut interagieren. Die Anwesenheit von strömenden Flüssigkeit, Schleim oder Blut zum Beispiel fest, Haftung, weil es eine mechanische Kraft auf den Erreger erzeugt. Zur Charakterisierung der Wirkung von strömenden Flüssigkeit man in der Regel bezieht sich auf den Begriff der Schubspannung, die Tangentialkraft pro Flächeneinheit durch eine Flüssigkeit bewegt in der Nähe einer stationären Wand, in dyn / cm 2 ausgedrückt ausgeübt wird. Die Intensitäten der Schubspannung variieren stark je nach den verschiedenen Schiffen Art, Größe, Orgel, Standort etc. (0-100 dyn / cm 2). Circulation in Kapillaren können sehr geringe Scherbeanspruchung Werte und auch nur vorübergehend während der Perioden zwischen wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten 1 zu stoppen. Am anderen Ende des Spektrums Schubspannung in Arteriolen können bis zu 100 dyn / cm 2 2. Die Auswirkungen der Schubspannung auf verschiedene biologische Prozesse wurde deutlich, wie zum Beispiel während der Interaktion von Leukozyten mit dem Endothel 3 gezeigt. Zur Berücksichtigung dieser mechanischen Parameter in den Prozess der bakteriellen Adhäsion nutzten wir ein experimentelles Verfahren auf die Verwendung einer Einweg-flow Kammer 4 auf. Wirtszellen werden in der Strömungskammer gewachsen und fluoreszierende Bakterien sind in der Strömung durch eine Spritzenpumpe kontrolliert eingeführt. Wir haben uns zunächst konzentrieren unsere Untersuchungen auf die bakterielle Erreger Neisseria meningitidis, ein Gram-negative Bakterium verantwortlich für Sepsis und Meningitis. Das hier beschriebene Verfahren erlaubt es uns, die Auswirkungen der Schubspannung auf die Fähigkeit der Bakterien zur Studie: haften die Zellen 1, um die Zelle Oberfläche 5 vermehren und zu lösen, um neue Standorte 6 (Abb. 1) zu besiedeln. Ergänzende technische Informationen finden Sie in Hinweis 7 zu entnehmen. Schubspannung Werte hier vorgestellten wurden auf der Grundlage unserer bisherigen Erfahrungen 1 und die Werte in der Literatur gefunden repräsentieren gewählt. Das Protokoll sollte für eine breite Palette von Erregern mit speziellen Anpassungen je nach Zielsetzung der Studie.
Protocol
1. Menschlichen Wirtszelle und Bakterienkultur
- Kultur HUVECs zwischen Passage 1 und 9 bei 37 ° in einem befeuchteten Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. Passage der Zellen, wenn sie 80% Konfluenz Ansatz mit Trypsin / EDTA bis zur Wartung Kulturen auf 75 cm 2 Kulturflaschen und experimentellen Kulturen in Einweg-Flow Kammern (μ-Slides VI) liefern.
- Ziehen Medium aus den Flaschen zu passagiert werden, waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS, zurückzutreten und ersetzen Sie sie mit 1,5 ml Trypsin / EDTA. Lassen Sie die Zellen in einer Zellkultur-Inkubator für 5 Minuten lösen bei 37 ° C.
- Sammeln Sie die Zellen mit 10 ml Zellkulturmedium in eine 15 ml-Collection-Tube. Pellet die Zellen mit einem 5 Minuten Zentrifugation (bei 200 g), bei Raumtemperatur. Die Zellen in 4 ml Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und zählen sie auf einem Malassez Kammer nach den Anweisungen des Herstellers.
- Einführung 30 ul einer 1x10 6 HUVEC Zellen pro ml Suspension in den Kanal (3x10 4 insgesamt) und damit die Zellen für 3 Stunden bei 37 haften ° in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% (v / v) CO 2. Fügen Sie ein zusätzliches Volumen von 120 ul Endo-SFM in die Vertiefungen füllen. Die Zellen sollten bilden eine subkonfluenten Monoschicht (Abbildung 2).
- Wachsen Sie N. meningitidis, die GFP (in diesem Fall Stammes 8013, die GFP unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotor), auf GCB-Agarplatten mit Kellogg Ergänzungen und 5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2 für 16 Stunden.
2. Initial Haftung der einzelnen Bakterien an Wirtszellen
- Die Konzentration der Bakterien auf GCB Agarplatten zu einer OD600 von 0,05 gewachsen mit vorgewärmten Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und inkubieren für 120 Minuten bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2, unter leichtem Schütteln (130 rpm). Induce GFP-Expression durch Zugabe von 1 mM IPTG in das Kulturmedium für die ganze Inkubationszeit.
- Legen Sie die Einweg-μ-Slide auf der Bühne eines inversen Mikroskops mit einem beheizten Plattform, um die Temperatur der Probe bei 37 ° C zu halten ausgestattet
- Gießen vorgewärmten Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS in ein steriles Becherglas und füllen eine sterile 50 ml Spritze mit diesem Medium. Bringen Sie die "Eingabe"-Schlauch auf die Spritze und füllen Sie durch die Einführung Medium.
- Verbinden Sie den "Eintrag" Schlauch an den μ-Slide, mit Sorgfalt, um zu vermeiden, Einleiten von Luft in die Kammer. Dann füllen Sie das Anbringen der "exit" Rohr an das andere Ende und vorsichtig den Kanal mit mittleren bis ca. 1 cm Abstand von der Kammer "exit".
- Messen Sie die bakterielle OD600 und passen auf 0,15 in Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS. Um an den einzelnen Bakterien aussehen, müssen alle Aggregate durch kräftiges Vortexen der bakteriellen Probe gestört werden.
- Platz 100 ul der Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS-Medium in das Reservoir ergänzt und 100 ul der bakteriellen Lösung von der Oberseite des gevortext Lösung zu vermeiden, Probenahme alle verbleibenden bakteriellen Aggregaten genommen.
- Sorgfältig stellen die 200 ul Volumen in den μ-Slide, indem Sie den Hahn, um die Bakterien in die Kammer zu injizieren.
- Einführung Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit einer Schubspannung mit Adhäsion von 0,044 dyn / cm 2 für 15 Minuten.
Siehe zum Beispiel Video-1 oder Abbildung 3 dargestellt. Nach diesem Schritt, entweder den § § 3, 4 oder 6 zu bewegen.
3. Die Quantifizierung der Anfangshaftung von einzelnen Bakterien an Wirtszellen
- Nach anfänglichen Haftung für die 15 Minuten, zu erwerben Bildern von zehn Feldern zufällig während Flüssigkeit immer noch im Umlauf ist.
- Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit dem ImageJ-Software 8, um die mittlere Anzahl der adherant Bakterien pro Feld zuzugreifen. Dies geschieht wie folgt: Zunächst einmal, jedes Bild wird Schwellenwert mit dem "Threshold"-Fenster in der "Bild"-Menü auf einzelne haftende fluoreszierende Bakterien zu markieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrund aus den Zellen. Dann wird jedes einzelne Bakterium gezählt, mit dem Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Die Daten für jedes Bild in einer Excel-Tabelle angegeben und sind gemittelt, um die mittlere Anzahl der adhärenten Bakterien pro Feld zu quantifizieren.
4. Die Messung der Strömungswiderstand einzelner Bakterien Anhänger Wirtszellen
- Programm der Spritzenpumpe Set-up zu Schubspannung zwischen 3 bis 100 dyn / cm 2 für 5 Minuten zu generieren.
- Am Ende der 5 Minuten zu erwerben zehn Felder zufällig gewählt, wie in Schritt 3.1 beschrieben, aber mit der Strömung gestoppt prior auf den Erwerb.
- Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder wie in Schritt 3.2 beschrieben und quantifiziert die mittlere Anzahl der verbleibenden Bakterien pro Feld.
5. Die Messung des Wachstums eines isolierten Anhänger Bakterium zu einem Mikrokolonie
- Einführung Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit dem gewählten Schubspannung für mehrere Stunden. Bilder aufzeichnen für die Echtzeit-Video-Mikroskopie mit einem Bild alle 5 Minuten.
- Nach Video-Mikroskopie, stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software. Ein Beispiel der bakteriellen Vermehrung kann auf Video 2 zu sehen.
6. Die Messung der Strömungswiderstand von anhaftenden Bakterien Mikrokolonien
- Nach der Bildung der großen Mikrokolonien auf der Zelloberfläche (step5.2) erwerben 2-3 Bilder der beiden Zellen (durch Phasenkontrast) und Bakterien (durch GFP-Fluoreszenz), bevor flow Anwendung. Für den Rest des Experiments wird die Übernahme-Protokoll-Monitor nur die Fluoreszenz.
- Die Anwendung hoher Scherspannung für 5 Minuten (300 bis 100 dyn / cm 2) und Aufnehmen von Bildern in einem Frame pro 5 Sekunden.
- Stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software.
- Dann entfernen Sie den "exit"-Schlauch erste und sorgfältig zu vermeiden, das Leeren des Kanals und fügen Sie dann vorgewärmte frisches Medium in die Vertiefungen vor dem Entfernen der "entry"-Schlauch zu füllen.
- Zur quantitativen Bestimmung der Wirkung von Schubspannung auf bakterielle Resistenz kann eine Beschichtung Test wie folgt durchgeführt werden: collect die übrigen mittel-und waschen Sie die μ-Slide zweimal mit 120 ul PBS, die verbleibenden Medium entfernt vom Kanal (beide Waschungen werden auch gesammelt).
- Lösen Sie die infizierten Zellen mit der Zugabe von 50 ul von Trypsin / EDTA für 5 Minuten bei 37 ° und mischen dieses freistehende Probe mit der Suspension in den vorherigen Schritt gesammelt.
- Führen Sie serielle Verdünnungen in PBS und Platte eine 10 ul Bruchteil auf GCB Agarplatten, in dreifacher Ausfertigung, um die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) auf den nächsten Tag zu bestimmen, nach der Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2.
Videos 3 und 4 vergleichen die Wildtyp-Stamm mit der pilV Mutante.
7. Bakterielle Loslösung von Mikrokolonien
- Zellen infizieren in der Strömungskammer durch Wiederholen der Schritte 2,1 bis 2,8 und damit die Infektion für 30 Minuten gehen.
- Entfernen ungebundenen Bakterien durch zunehmenden Durchfluss bis 10 dyn / cm 2 für einen Zeitraum von 2 Minuten und lassen Infektion für 2h weiter.
- Durchfluss reduzieren auf 0,15 dyn / cm 2.
- Jede Stunde, sammeln ein Tropfen des Mediums, die aus dem Strömungsraum.
- Führen Sie serielle Verdünnungen der Proben und die Platte sie auf GCB Agarplatten.
- Bestimmen Sie die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) am nächsten Tag, nach Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2.
8. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1: Verschiedene Stufen eines zellulären Monoschicht, die beobachtet und gemessen werden kann in der Gegenwart fließen in das Verfahren.
Abbildung 2: Endothelial Zellmonolayer in der Strömungskammer am Anfang eines Experiments (ohne Scherbeanspruchung). Etwa 50 Endothelzellen sind in einem sub-Monolayer organisiert.
Abbildung 3: Grafische Darstellung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der Zelloberfläche. Die Werte für die drei Felder sind angegeben, um eine Vorstellung von der Feld-zu-Feld-Variante, die zu erwarten (0044 dyn / cm 2) ist zu geben.
Video 1. Visualisierung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der zellulären Monoschicht als eine Funktion der Zeit (0044 dyn / cm 2). GFP-exprimierenden Bakterien sind nach der Richtung des strömenden Mediums. Der Film beschleunigt wird 60-fache, ist die wirkliche Dauer des Videos 10 Minuten.
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Video 2. Nach anfänglichen Haftung Bakterien durften auf der Zelloberfläche vermehren für einen Zeitraum von 7 Stunden (beschleunigte 1000-fach).
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Video 3. Nach Proliferation auf der Zelloberfläche der Mechanikeral Widerstand von Mikrokolonien wurde durch eine Erhöhung der Schubspannung auf 10 Dyn / cm 2 für 5 Minuten, aber Wildtyp Mikrokolonien sind beständig beschleunigt 60-fach getestet.
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Video 4. Mikrokolonien durch die pilV Mutanten gebildet werden von Durchfluss zu erhöhen (10 dyn / cm 2) gestört. Diese Mutante nicht die Umgestaltung der Plasmamembran unter Mikrokolonien induzieren und ist somit sehr empfindlich auf erhöhte Schubspannung (Video ist 60-fach beschleunigt) 5.
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Discussion
Die Bedeutung der Schubspannung und in der Regel von mechanischen Aspekte in der Biologie wird zunehmend anerkannt. Zum Beispiel die stark angepasst Hafteigenschaften der Selektin-Familie von Proteinen in den Prozess der Lymphozyten Haftung und rollt auf der Gefäßwand hat durch die Einführung von Schubspannung in den Prozess erkannt worden. Das oben beschriebene Verfahren wurde auf die Gram-negative Bakterien Neisseria meningitidis aufgebracht, sondern sollte auch für ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Die Bedeutung der Schubspannung wurde auch für andere Krankheitserreger und andere Infektionen Seiten im Browser angezeigt. Bakterielle Adhäsion durch Schubspannung bedingt durch das Studium der FimH Adhäsin auf uropathogene Escherichia coli (UPEC) 9 gefunden beschrieben worden. Ähnlich wie Selektine, die Interaktion zwischen FimH und seine Host-Zell-Rezeptor wurde gezeigt, dass durch Scher-induzierte mechanische Kräfte 9 und die CFAE Adhäsin von enterotoxische E.coli gestärkt werden wurde auch die Haftung auf intestinalen Epithelzellen vermitteln über eine scherabhängige gemeldet Mechanismus 10. Wir berichteten, mit dem Laminar-Flow-Kammer-Assay-Protokoll in diesem Kapitel, dass Streptococcus agalactiae Pili essentiell für die Einhaltung dieses Erregers an Epithelzellen unter Strömungsbedingungen 11 wurden beschrieben. Solche Studien bestätigen, dass unsere Flusskammer Test ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Wirtszell-Pathogen-Interaktionen unter den Bedingungen der Schubspannung ist.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Emilie Mairey und Emmanuel Donnadieu für die Ersteinrichtung des Verfahrens zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
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