Summary
בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.
Abstract
במהלך זיהומים חיידקיים רצף של אינטראקציות מתרחשות בין פתוגן לבין המארח שלו. הידבקות חיידקים על פני השטח התא המארח היא לעתים קרובות הצעד הראשוני של קביעת בפתוגנזה. למרות ניסויי הדבקה נלמדת בעיקר בתנאים סטטיים הידבקות למעשה מתקיים בנוכחות זורם נוזל. המפגשים הראשונים בין חיידקים המארח שלהם לעתים קרובות להתרחש ברמת הרירית, הפה, הריאות, המעיים, עיניים, וכו 'שבו הריר זורם על פני השטח של תאים אפיתל. מאוחר יותר זיהום, פתוגנים מדי פעם הגישה את זרימת הדם ולגרום למחלות מסכנות חיים כגון אלח דם, דלקת קרום המוח septicemia ו. המאפיין של זיהומים אלה הוא היכולת של פתוגנים אלה לתקשר עם לתאי אנדותל בנוכחות של מחזורי הדם. הנוכחות של הזורם, הריר נוזל או דם, למשל, קובע הדבקה כי זה יוצר כוח מכני על הפתוגן. כדי לאפיין את ההשפעה של זורמים זה נוזל בדרך כלל מתייחס המושג גזירה של מתח, שהוא הכוח המופעל משיק ליחידת שטח על ידי נוזל מרגש ליד קיר נייח, שבאה לידי ביטוי dynes / 2 ס"מ. עוצמות הלחץ גזירה להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג כלי שונה, גודל, איבר, מיקום וכו '(000-100 dynes / ס"מ 2). השאלה של נימי דם יכול להגיע נמוכה מאוד להדגיש ערכים גזירה ואף להפסיק באופן זמני במשך תקופות שנעו בין כמה שניות עד מספר דקות 1. בצד השני של הספקטרום הלחץ גזירה arterioles יכול להגיע 100 dynes / 2 2 ס"מ. ההשפעה של הלחץ גזירה על תהליכים ביולוגיים שונים הודגמה בבירור במהלך האינטראקציה של לויקוציטים עם 3 האנדותל כמו למשל. כדי לקחת בחשבון פרמטר זה מכני בתהליך של הידבקות חיידקים לקחנו את היתרון של הליך ניסיונית המבוססת על שימוש של זרימה חד פעמיות קאמרית 4. התאים גדלים מארח בחדר זרימה וחיידקים פלורסנט מוצגים בזרימת נשלט על ידי משאבת מזרק. אנחנו בתחילה התמקדה החקירה שלנו על פתוגן חיידקי Neisseria meningitidis, חיידק גראם שליליים אחראי על זיהום ודלקת קרום המוח. ההליך המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את ההשפעה של הלחץ גזירה על היכולת של החיידקים: לדבוק 1 תאים, להתרבות על פני התא 5 ו לנתק ליישב אתרים חדשים 6 (איור 1). מידע טכני משלימה ניתן למצוא התייחסות 7. ערכי הלחץ שאר המוצגים כאן נבחרו בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו 1 ו לייצג ערכים בספרות. הפרוטוקול אמור לחול על מגוון רחב של פתוגנים עם התאמות מסוימות בהתאם למטרות המחקר.
Protocol
1. התא המארח האדם תרבית החיידקים
- תרבות HUVECs מעבר בין 1 ו - 9 ב 37 מעלות בתוך חממה humidified עם 5% (v / v) CO 2. מעבר התאים כאשר הם גישה מפגש 80% עם טריפסין / EDTA לספק תרבויות תחזוקה על 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבות ותרבויות ניסיוני בתאי זרימה חד פעמיות (μ-שקופיות VI).
- משיכה בינוני מן צלוחיות להיות passaged, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS, לשלוף ולהחליף אותו עם 1.5 מ"ל של טריפסין / EDTA. אפשר לנתק את התאים בתרבית תאים החממה למשך 5 דקות בשעה 37 ° C.
- איסוף התאים עם 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים לתוך צינור איסוף 15 מ"ל. גלולה התאים עם צנטריפוגה 5 דקות (ב g 200), בטמפרטורת החדר. להשעות את התאים מ"ל 4 של אנדו-SFM בתוספת 10% (v / v) FBS לספור אותם על חדר Malassez, על פי הוראות היצרן.
- הציגו 30 μl של 6 תאים 1x10 HUVEC לכל ההשעיה מ"ל לתוך התעלה (3x10 4 סה"כ) ולאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות ב 37 מעלות ב חממה humidified עם אווירה של 5% (v / v) CO 2. הוספת נפח נוסף של 120 μl של אנדו-SFM למלא את הבארות. תאים צריכים להקים monolayer subconfluent (איור 2).
- לגדול נ meningitidis להביע GFP (במקרה הזה 8013 זן GFP להביע בשליטת היזם IPTG-ועין מתנהלת), על צלחות אגר GCB המכיל תוספים קלוג'ס 5 מיקרוגרם / מ"ל של chloramphenicol ב 37 ° C באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2 למשך 16 שעות.
2. הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לארח תאים
- התאם את הריכוז של חיידקים גדל על צלחות אגר GCB כדי OD600 של 0.05 עם טרום חימם Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS ו דגירה של 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2, תחת רועד עדין (130 סל"ד). להשרות ביטוי של GFP על ידי הוספת 1 IPTG mM לתוך המדיום תרבות לתקופת הדגירה כולו.
- מניחים את הפנויה μ-Slide על הבמה של מיקרוסקופ הפוך מצויד פלטפורמה מחומם כדי לשמור על הטמפרטורה מדגם ב 37 ° C.
- יוצקים מראש חימם Endo-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS לתוך כוס זכוכית סטרילית למלא מזרק 50 מ"ל סטרילי עם המדיום הזה. חבר את צינורות "כניסה" אל המזרק ומלא על ידי החדרת בינוני.
- חבר את "הכניסה" צינור אל Slide-μ, עם טיפול, כדי למנוע החדרת אוויר לתוך החדר. לאחר מכן, לצרף את "יציאה" הצינור לקצה השני בזהירות למלא את הערוץ עם בינוני עד מרחק של כ 1 ס"מ "יציאה" את החדר.
- מדוד את OD600 חיידקים להסתגל 0.15 ב Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS. כדי להסתכל על חיידקים בודדים, אגרגטים כל חייב להיות מופרת על ידי vortexing נמרץ של המדגם חיידקי.
- מקום 100 μl של אנדו-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS בינוני לתוך המאגר ולהוסיף 100 μl של הפתרון חיידקי נלקח מהחלק העליון של הפתרון vortexed להימנע הדגימה כל אגרגטים חיידקי הנותרים.
- בזהירות להציג את נפח 200 μl אל Slide-μ ידי סיבוב שסתום להזריק את החיידקים אל תוך החדר.
- הציגו Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גוזז תואם הידבקות של 0.044 dynes / 2 ס"מ במשך 15 דקות.
ראו למשל וידאו או 1 דמות 3. לאחר שלב זה, או לעבור סעיפים 3, 4 או 6.
3. כימות של הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לתאי המארח
- לאחר הידבקות ראשונית במשך 15 דקות, לרכוש תמונות של עשרה שדות באקראי תוך הנוזל עדיין במחזור.
- ניתוח תמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ImageJ 8, על מנת לקבל גישה המספר הממוצע של חיידקים adherant לכל שדה. הדבר נעשה באופן הבא: קודם כל, כל תמונה היא thresholded באמצעות "סף" חלון נמצא בתפריט "תמונה" כדי להדגיש את הפרט חיידקים פלורסנט דבקות, תוך מזעור רקע מהתאים. ואז, כל חיידק בודד נספרת, באמצעות Plug-In "מונה Cell" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). הנתונים עבור כל תמונה מדווחים גיליון אלקטרוני של Excel הם ממוצעים לכמת את מספר ממוצע של חיידקים חסיד לכל שדה.
4. מדידת התנגדות לזרימה של חיידקים בודדים חסיד לתאי המארח
- תוכנית מזרק משאבה הגדרת ליצור מתח גזירה החל 3-100 dynes / 2 ס"מ במשך 5 דקות.
- בתום 5 דקות, לרכוש ten שדות שנבחרו באקראי כמתואר בשלב 3.1, אבל עם הזרם נעצר יחסי ציבורIOR הרכישה.
- לנתח את התמונות רכשה כמתואר בשלב 3.2 ולכמת את המספר הממוצע של החיידקים הנותרים לכל שדה.
5. מדידת הצמיחה של חיידק חסיד מבודד microcolony
- הציגו Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גזירה נבחר למשך כמה שעות. הקלטת תמונות מיקרוסקופיה וידאו בזמן אמת על מסגרת אחת כל 5 דקות.
- בעקבות מיקרוסקופיה וידאו, להפסיק את הלחץ גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה. דוגמה של שגשוג חיידקים ניתן לראות וידאו 2.
6. מדידת התנגדות לזרימה של microcolonies חיידקי חסיד
- לאחר היווצרות של microcolonies גדול על פני הסלולר (step5.2) לרכוש 2-3 תמונות של תאים הן (לעומת שלב) חיידקים (על ידי ה-GFP-פלואורסצנטי) לפני יישום תזרים. במשך שארית של הניסוי, פרוטוקול הרכישה תפקח רק את הקרינה.
- החלת מתח גזירה גבוהה במשך 5 דקות (300-100 dynes / ס"מ 2) ותמונות שיא בכל מסגרת אחת כל 5 שניות.
- עצור את המתח גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה.
- בשלב הבא, להסיר את צינור "היציאה" הראשונה ובזהירות, כדי למנוע ריקון ערוץ ולאחר מכן להוסיף מראש חימם בינוני טרי למלא את בארות לפני הסרת צינורות "כניסה".
- כדי לקבוע כמותית את השפעת הלחץ גזירה על עמידות חיידקים, assay ציפוי יכול להתבצע כדלקמן: לאסוף את הנותרים בינוני לשטוף את μ-Slide פעמיים עם 120 μl של PBS, אשר מסיר את המדיום הנותרים מערוץ (שוטף הן ) נאסף גם.
- לנתק את התאים הנגועים עם תוספת של 50 μl של טריפסין / EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות ו לערבב את זה עם מדגם מנותקת ההשעיה שנאסף בשלב הקודם.
- ביצוע דילולים סדרתי PBS ואת הצלחת שבריר 10 μl לצלחות GCB אגר, בשלושה עותקים, על מנת לקבוע את מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2.
וידאו 3 ו -4 להשוות את המתח סוג בר עם מוטציה pilV.
7. ניתוק מן חיידקית microcolonies
- להדביק תאים בתא זרימה על ידי חזרה על שלבים 2.1-2.8 ולאפשר הזיהום להמשיך במשך 30 דקות.
- הסר חיידקים מאוגד על ידי הגדלת זרימת dynes 10 / 2 ס"מ לתקופה של 2 דקות ולאפשר זיהום להימשך 2h.
- צמצום זרימת 0.15 dynes / 2 ס"מ.
- כל שעה, לאסוף ירידה של מדיום יוצא של החדר לזרום.
- ביצוע דילולים סדרתי של דגימות צלחת אותם על צלחות אגר GCB.
- קביעת מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2.
8. נציג תוצאות
איור 1: שלבים שונים של monolayer סלולרי שניתן לצפות ומדד בנוכחות זרימה בהליך.
איור 2: monolayer תא האנדותל בחדר זרימה בתחילת הניסוי (היעדר לחץ גזירה). כ -50 לתאי אנדותל מאורגנים monolayer משנה ומחוברות.
איור 3: ייצוג גרפי של הידבקות ראשונית של חיידקים על פני השטח הסלולר. ערכים עבור שלושת השדות מסומנים כדי לתת מושג על וריאציה בשדה אל השדה צפוי (0044 dynes / ס"מ 2).
וידאו 1. ויזואליזציה של הידבקות ראשונית של חיידקים על monolayer הסלולר כפונקציה של זמן (0044 dynes / ס"מ 2). GFP-להביע את החיידקים הבאים את הכיוון של המדיום זורם. הסרט מואץ פי 60, את משך הזמן האמיתי של הסרט הוא 10 דקות.
לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.
וידאו 2. החיידקים לאחר הדבקה ראשונית הורשו להתרבות על פני הסלולר לתקופה של 7 שעות (1000 מואץ פי).
לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.
וידאו 3. לאחר הפצת נשק על פני השטח הסלולר המכונאיהתנגדות של אל microcolonies נבדק על ידי הגדלת רמת הלחץ גזירה dynes עד 10 / 2 ס"מ 5 דקות אבל microcolonies סוג בר עמידים מואץ פי 60.
לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.
וידאו 4. Microcolonies שיצרו מוטנט pilV הם שיבשו להגביר את זרימת (10 dynes / ס"מ 2). מוטציה זו אינה מצליחה להשפיע על שיפוץ של קרום פלזמה תחת microcolonies ולכן היא יותר רגישה ללחץ מוגבר גזירה (וידאו מואץ פי 60) 5.
לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.
Discussion
חשיבותה של מתח גזירה ובדרך כלל היבטים מכניים בביולוגיה הוא יותר ויותר מוכר. למשל המאפיינים דבק המותאמים ביותר של משפחת selectin של חלבונים בתהליך של הידבקות לימפוציטים, מתגלגלים על הקיר וסקולרית הוכר על ידי החדרת מתח גזירה בתהליך. ההליך המתואר לעיל היה להחיל את meningitidis גראם שליליים Neisseria חיידקים אבל צריך לחול על מגוון רחב של פתוגנים. חשיבותה של מתח גזירה הוכח גם ומזיקים ואתרי זיהום אחרים. הדבקה חיידקית מותנה מתח גזירה תוארה על ידי מחקר של adhesin FimH למצוא Escherichia coli uropathogenic (UPEC) 9. בדומה Selectins, את האינטראקציה בין FimH ואת התא המארח שלה קולטן הוצגה להיות מחוזקת על ידי גזירה-Induced כוחות מכניים 9 ו adhesin CfaE של enterotoxigenic E.coli דווחה גם לתווך הידבקות לתאי האפיתל במעי באמצעות גזירה תלויי מנגנון 10. דיווחנו, באמצעות זרימה למינרית assay קאמרית פרוטוקול המתוארת בפרק זה כי סטרפטוקוקוס agalactiae פילי היו חיוניים הדבקות של הפתוגן הזה לתאי האפיתל בתנאים תזרים 11. מחקרים אלה מאשרים כי קאמרית תזרים assay שלנו הוא כלי שימושי לחקר התא הפתוגן אינטראקציות מארח תחת תנאים של לחץ גזירה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות אמילי Mairey ועמנואל Donnadieu לקביעת הראשונית מעלה של ההליך.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
- Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
- Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
- Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
- Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
- Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
- Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).
