Summary
本协议描述了如何量化的镁（二）依赖RNA的三级结构的形成由两个羟基自由基足迹方法。
Abstract
RNA分子在生物学中发挥的重要作用。除了传递遗传信息，RNA折叠成独特的三级结构，实现特定的生物学作用，作为调节剂，粘结剂或催化剂。有关大专院校的联系形成的信息是必须了解的RNA分子的功能。羟基自由基（•OH）是独特的结构由于其反应活性高，体积小的核酸探针。，作为一个足迹探头使用时，羟基自由基地图的溶剂可及表面的DNA和RNA的磷酸骨干如单核苷酸分辨率罚款。羟基自由基足可以用来识别内分子间的接触面，例如在DNA -蛋白质和RNA -蛋白质复合物的核苷酸。 3平衡和动力学4转换可以由羟基自由基足迹作为一个soluti功能进行变量或时间，分别。的足迹的一个主要特点是有限的接触探头（例如，“单次击中动力学”）中的每个核苷酸的聚合物均匀采样的结果。5
在这个视频文章中，我们使用的四膜虫核酶的小四至小六的域名，说明RNA样品制备和一个镁（II）介导的折叠等温线的决心。我们描述了使用众所周知的羟基自由基足迹协议，要求H 2 O 2（我们称之为“过氧化”协议）和一个有价值的，但并不广为人知，替代使用自然溶解O 2的（我们称之为“氧化“协议）。提交的数据压缩，转换和分析程序概述。
Protocol
1。足迹试剂的制备
- 准备了10倍的反应缓冲液含有钠cacodylate 100毫米，1毫米EDTA和1个M氯化钾。调整pH值至7.4。使用0.2μm的醋酸纤维过滤设备（NALGENE）过滤器的缓冲区。注：不吸管的RNA直接到10倍缓冲区。
- 准备如表1所示，每个反应的滴定反应混合。滴定混合量（1X缓冲和镁（二）所需的浓度）应为90μL，然后加入1X缓冲的RNA加入10μl。
- 准备一个核糖核酸酶T1消化缓冲液6.63M尿素，柠檬酸钠20MM，为1mM EDTA，0.25微克/μL的tRNA，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝。这个缓冲区可以存储在4℃至6个月。
- Fenton反应需要250毫米的铁（NH 4）2（SO 4）2，250毫米EDTA，和500毫米L -抗坏血酸钠新鲜配制的水溶液。浓度在第1章指出.5是平衡的实验，如钠cacodylate缓冲区，不清除自由基和不同的二价离子浓度的最佳选择。
- 过氧化（1.5.1）和氧化（1.5.2）的足迹反应试剂。
- 过氧化Fenton反应需要100毫米的铁EDTA的解决方案，和50毫米钠L -抗坏血酸和1.5％H 2 O 2，新鲜配制的水溶液。准备用EDTA铁EDTA溶液混合铁（NH 4）2（SO 4）2，有超逾铁EDTA的1.1倍。
- 前发起的氧化裂解反应（3.4.2），创建相结合，2μL的Fe（NH 4）2（SO 4）2（250毫米），EDTA的2.2μL（250毫米），62.5μLFenton反应组合L -抗坏血酸钠（500毫米），22.5μL10X反应缓冲液和135.5μLH 2 O的终浓度达到0（3.4.2）的足迹反应混合物。，分别为10毫米，0.11毫米和6.61毫米。
2。足迹实验RNA的制备
- RNA可以在体外转录DNA模板6标准生产，如果少于50个核苷酸，购买（例如，在集成DNA技术，www.idtdna.com ）。实验室按照建议的清洁程序，以保持在足迹实验样品RNA的完整性。
- 8脱磷，在体外转录RNA是必要的前 32 P标签的RNA的5'端。 10 pmol kinasing末端标记的RNA 9解决方案应该是成功的磷酸灭活后的阴天。
- 净化放射性标记的RNA变性凝胶电泳。随后的两个凝胶0.3 M醋酸钠（pH 5.5）中提取的RNA恢复。 RNA沉淀混合水溶液0.5毫升，1毫升乙醇和随后孵育1分钟干冰。在4 ° C，12500 RPM 0.5小时旋转样品。弃上清，用70％乙醇洗涤RNA沉淀。额外的离心去除上清液后，在真空干燥颗粒。
- P标记的 32 RNA样品溶解在330 UL 1X Buffer.Pipet 30μL的反应管中的RNA溶液，沉淀用乙醇和真空干燥RNA生成参考阶梯（步骤3.5），保持此管。变性加热的缓冲的RNA溶液在95 ° C为2分钟。样品冷却到室温为15分钟，快速旋转，使管放回解决方案的盖子上的冷凝液。
3。足迹实验
- 电泳梳，确定每分析凝胶的数据点的最大数量。我们使用30梳。参考阶梯占地2井和uncleaved控制之一。准备27个反应管。最后MG（二）concentrati项应均匀分布的对数遍及各地的滴定中点量级的规模。
- 另外，在50 RNA和镁（二）解决方案° C孵育5分钟。 90（二）镁相应数额在1x缓冲液10μLRNA溶液混合，达到100微升的最终体积。孵育30分钟的解决方案，在50 ° C。
- 让我们的解决方案，在25 ° C为1小时的平衡而发生折叠。
- 过氧化（3.4.1）（3.4.2）或氧化羟基自由基足迹反应。
- 开始放置铁EDTA（100毫米）2μL液滴的过氧化反应，反应的顶部内彼此分开2μLL -抗坏血酸钠（50毫米）和2μlH 2 O 2（1.5％ ）管内含有RNA的解决方案，并开始严厉混合的足迹反应。停止15秒后加入300μL冷无水乙醇的反应。转动管的3-5倍。沉淀，洗涤和在步骤2.4干燥沉淀。
- 加入5μL新鲜配制的Fenton反应混合物（1.6）开始氧化羟自由基footprintingreaction。孵育30分钟，在25 ° C。添加300μL冷无水乙醇淬火反应和组合转向管的3-5倍。沉淀，清洗和干燥的颗粒为在步骤2.4中表示。
- 根据标准程序10使用在步骤1.3编写的解决方案生成一个核糖核酸酶T1消化参考样本。
- 溶解于8μL凝胶上样染料II（Ambion公司），并确认RNA的RNA颗粒悬浮使用盖革计数器。
- 11。负载样本，包括两个引用和控制的标准协议，准备变性，8％聚丙烯酰胺测序胶。独立的RNA片段在60瓦 - 75 W为2.5小时。干凝胶置于存储荧光粉屏幕一夜之间。扫描成像系统胶片放射自显影，如荧光屏。风暴865（GE Healthcare公司）或台风（GE Healthcare公司）。凝胶图像文件传输到您的计算机。
4。数据分析
- 每个核苷酸的羟基自由基反应，是由每个频带的量化分析凝胶强度。下载，安装和开放SAFA，一个易于使用的开源软件为单波段的装修和量化12，13按照用户手册的说明。简而言之，负载的RNA序列。txt文件的后面。凝胶文件的凝胶图片。调整波段的强度，定义车道，选择一个锚车道，并执行凝胶对齐。频段分配到核苷酸发生在核糖核酸酶T1消化阶梯参考。乐队量化积分和使用的正常化/ colorplot功能正常化和分配潜在不变的残留物。另存为。txt文件的输出。
- SAFA输出电子表格，其中包含代表胶道和行代表在列tegrated波段相应的RNA片段的单个波段的密度。首先，确定保护的网站显示在溶剂可显着的变化，通过比较没有镁（II）与终点毫克（二）浓度在我们的例子（50毫米）的配置文件样本所得的个人资料的保护。该值越低，受保护的碱基对羟基自由基的攻击，反之亦然。
- 创建折叠等温线从个人或群组的核苷酸与镁（Ⅱ）浓度的归波段积分。等温线是单独缩放FI = L +（U - L）的分数饱和度•
其中，f表示乐队的集成密度（S）分析，L和U代表的上限和下限过渡
14的数据都适合使用非线性升是小数饱和。东广场分析程序（我们使用或者原产地（OriginLab）或GraphPad（GraphPad软件公司）。）向山式（1） 
其中K，D是平衡解离常数，[M]，对应的变量，可调节的折叠反应，镁（二）在这个例子中的浓度，N H Hill系数。此过程尺度过渡到小数饱和，决定了它的中点，并提供了一个过渡是否是S形的现象学测试。来自测序凝胶（图3A）SAFA（图3B）进行了分析和适合如上所述的等温线如图3C所示。如图3所示的分数饱和等温线所产生的电子表格中的缩放SAFA产生对最适合使用的方程分数的上限和下限（U和 L）值=值 /（U - L） - L /（ U - L）。
14的数据都适合使用非线性升是小数饱和。东广场分析程序（我们使用或者原产地（OriginLab）或GraphPad（GraphPad软件公司）。）向山式（1） 
5。代表性的成果：
图3显示了代表小四至小六的RNA•OH足迹实验的结果。凝胶图像（左）表示，一）背景乳沟是最小的（右线），B）单核苷酸分配是可能的，因为在T1巷（核糖核酸酶T1劈开每个G）定义的乐队，和c）的羟基自由基诱导的RNA碎片以及上述背景。从低到高镁（二）的过渡是隶属于下降表明RNA三级结构形成的乐队的个人和组的集成条带密度。单次或连续核苷酸的裂解变化随之而来被称为一个“保护”的群体。 •OH保护镁（二）特点的小四至小六RNA介导的折叠密切对应溶剂人迹罕至的地区，其晶体结构中观察到的分子。
折叠的RNA分子的彗星一个有非常明显的结构性或动态的现象，但没有与相关的大专接触保护的不同程度（即，如何接近背景带密度下降）。因此，一些RNA分子将显示定义良好的结构转换，如在图3所示，而有些则不会。乐队强度SAFA 12分析（图3B）量化和规范化。输出是一个“热”的，可视情节对•OH的相对程度的保护。颜色过渡介绍后，镁（二）除无障碍变化。白色红色或蓝色显示更容易或多个受保护的核苷酸，分别。每个阴影的程度，是隶属于一个数值，可以被绘制成一个保护曲线（图3C），如山式（1）通过一项具有约束力的模型分析。解离常数与保护153-155附属的平衡是两倍左右，相应的价值，保护163-164。
ontent“>
图1。羟自由基的生产和P4 - P6 RNA折叠。 A）铁（II）催化羟自由基的过氧化氢的生成。抗坏血酸亚铁降低铁（Ⅲ）回。 B）在镁（二）的情况下，没有小四至小六的三级结构形成，使羟基自由基渗透和切割所有可访问的骨干岗位。增加镁（二）启动折叠小四至小六，只允许溶剂可及骨干羟基自由基裂解。
图2。大纲为羟基自由基足迹实验。一）Dephophorylation和32个P 5' -端的RNA标记。二）净化32 P标记在变性聚丙烯酰胺凝胶中的RNA。三）RNA的频段切除，随后的RNA提取，乙醇沉淀。 ð）Prefolding和折叠的RNA。五）新鲜准备的Fenton反应混合物除了生成羟基自由基。 F）的RNA片段，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。 G）的定量RNA片段SAFA软件。
图3过氧化芬顿足迹反应后的RNA片段分析。 （一）的RNA被暴露的羟基自由基和卵裂产品使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得到解决。图片显示，增加镁的浓度（二）过氧化裂解产物。参考和控制车道标记。此图像文件的SAFA的方案，其中定量每个频段的音量输入。 （二）“热”的情节所产生的SAFA。 （三）有关集成条带密度SAFA核苷酸的数量输出值的电子表格是如山equati绑定模型分析（1）。保护区被选为乐队Mg（II）浓度的功能不可或缺的密度增加。在K D是在被监控的网站，其中一半的RNA折叠的Mg（II）的浓度。 Hill系数，N H，是衡量斜坡曲线上具有约束力的协同信息，并提供了一个在这个特定的站点折叠的镁离子的数量的较低的估计。
表1卷生成的RNA样品含有不同的Mg（II）浓度的代表。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
羟基自由基足迹是一个有价值的工具，以评估核酸的溶剂可及表面面积。定性和定量的形成三级结构14，可以遵循作为一个功能参数，如离子种类和浓度，pH值，温度，结合蛋白或折叠的共同因素。引人注目的一条直线前进和廉价的协议，以及由此产生的溶剂可及单核苷酸水平上的折叠信息的结合，使得这种方法非常有吸引力的。传统的•OH足迹反应是增加H 2 O 2，我们称为“过氧化”（图1A）的协议。替代（“氧化”）协议17，我们强调利用自然溶解O 2的产生通过少量过氧化氢 的反应
这两种方法GEnerate•OH通过的铁氧化（二）由H 2 O 2（图1A），铁（Ⅲ）。个人喜好似乎确定这是由我们实验室的成员结构映射和平衡滴定实验中使用的协议。氧化的过氧化足迹反应，约30和1分，分别。这种劣势所抵消氧化稍微简单协议（试剂用量更少，添加）和“脆”氧化电泳带型材。观察表明，•OH分解产品的异质性，这一假说尚未经过测试。我们建议使用氧化协议分析大量的足迹样本（> 15）或含有H 2 O 2敏感元件的样品。
使用带负电荷的EDTA络合物铁（II）（图1A）防止与带负电荷的核酸的磷酸骨架铁协会（二）酸。自由铁（II）可以绑定到DNA和RNA和行为作为一个沉淀和/或可催化水解的RNA骨干。
芬顿试剂的浓度是理想的切割P4 - P6 RNA单次击中动力学表示缓冲区的足迹的必要条件下。单一冲击动力学确保RNA分子裂解平均只有一次18如果过量使用Fenton试剂，RNA的产品可以产生一个以上的裂解事件。这是偏见对较短的裂解产物片段分布。自由基裂解的程度，必须调整，使〜20％的最终标记的RNA切割和结束标记的RNA〜80％保持不变。剂量反应实验，必须使用适当的Fe（Ⅱ）/ H 2 O 2浓度，以确定研究者的研究解决方案的条件下实现单次击中动力学19。
该relatIVE溶剂可•OH足迹分析得到的地图可以单独使用的特点RNA的结构，平衡折叠实验期间形成的折叠和中间结构。这些数据可以从技术，解决在全球的构象变化，20和/或酶和化学足迹研究 21，在相同条件下产生的结果结合。可开发利用羟基自由基和互补的化学和酶的足迹作为约束型材粗粒度模型的RNA结构22。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的国家卫生RO1 - GM085130研究所和国家科学基金会MCB0929394的资助。我们感谢她的盛情款待，让我们在她的实验室电影马里昂施密特博士。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name | Company | Cat# | |
| Sodium Cacodylate(Caution! Toxic) | Sigma-Aldrich | C4945-25g | |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G | |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 | |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G | |
| Urea | Ambion | AM9902 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R-7876 | |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631-25g | |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma-Aldrich | F1543-500g | |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma-Aldrich | 349887 |
References
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule. Science. 251, 401-407 (1991).
- Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting. Science. 279, 1940-1943 (1998).
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts. Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).
- Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting. Methods. 49, 142-147 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).
- Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes. Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).
- Knapp, G. Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure. Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).
- Slatko, B. E., Albright, L. M. Denaturing gel electrophoresis for sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).
- Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 11, 344-354 (2005).
- Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA. Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).
- Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme. Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).
- Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science. 273, 1678-1685 (1996).
- Petri, V., Brenowitz, M. Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).
- Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations. J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).
- Shcherbakova, I., Mitra, S. Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure. Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly. Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).
- Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters. RNA. 15, 189-199 (2009).
