Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Övervakning Jämvikt Förändringar i RNA-struktur med "Peroxidative" och "oxidativ" hydroxylradikaler footprints

doi: 10.3791/3244 Published: October 17, 2011
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver hur man kvantifiera Mg (II)-beroende bildning av RNA-tertiär struktur genom två metoder för hydroxylradikaler footprints.

Abstract

RNA-molekyler spelar en viktig roll i biologi. Förutom att överföra genetisk information, kan RNA lägga till unika tertiära strukturer som uppfyller en viss biologisk roll som regulator, bindemedel eller katalysator. Information om tertiära kontakt bildning är avgörande för att förstå funktionen av RNA-molekyler. Hydroxylradikaler (• OH) är unika sonder av strukturen hos nukleinsyror grund av sin höga reaktivitet och liten storlek. 1 När den används som en footprints sond, hydroxylradikaler karta lösningsmedlet åtkomlig yta phosphodiester ryggraden i DNA-1 och RNA 2 med lika bra som enda nukleotid upplösning. Hydroxylradikaler footprints kan användas för att identifiera nukleotider i en intermolekylär kontaktyta, t ex i DNA-protein-1 och RNA-protein komplex. Jämvikt 3 och kinetiska 4 övergångar kan bestämmas genom att utföra hydroxylradikaler footprints som en funktion av en solutipå rörliga eller tid, respektive. En viktig funktion i footprints är att begränsad exponering till sonden (t.ex. "single-hit kinetik") resulterar i en enhetlig provtagning av varje nukleotid av polymer. 5

I den här videon artikeln använder vi den P4-P6 domän Tetrahymena ribozyme att illustrera RNA provberedning och bestämning av ett Mg (II)-medierad fällbara isotermer. Vi beskriver användningen av den välkända hydroxylradikaler footprints protokoll som kräver H 2 O 2 (Vi kallar detta "peroxidative" protocol) och en värdefull, men inte allmänt känt, alternativ som använder naturligt löst O 2 (Vi kallar detta " oxidativ "Protocol). En översikt av datareduktion, omvandling och förfaranden analys presenteras.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Beredning av footprints reagenser

  1. Förbered en 10x reaktion buffert som innehåller 100 cacodylate mM natriumklorid, 1 mM EDTA, och 1 M KCl. Justera pH till 7,4. Filtrera bufferten med hjälp av en 0,2 mikroM enhet acetat filter (Nalgene). Anmärkning: inte Pipettera RNA direkt till 10x buffert.
  2. Förbered mixen titrering reaktion för varje reaktion som anges i tabell 1. Volymen av titreringen mix (1x buffert och Mg (II) på önskad koncentration) bör vara 90 l, innan du lägger 10μl av RNA i 1x buffert.
  3. Förbered en RNAse T1 matsmältningen buffert innehållande 6.63M Urea, 20mm natriumcitrat, 1mm EDTA, 0,25 mikrogram / l tRNA, 0,025% xylen cyanol och 0,025% bromfenolblått. Denna buffert kan förvaras vid 4 ° C i upp till 6 månader.
  4. Den Fenton reaktion kräver nyberedd vattenlösningar av 250 mm Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA, och 500 mm natrium-L-askorbat. Halterna konstaterade i kapitel 10,5 är optimala för jämvikt experiment i buffert såsom natrium cacodylate som inte rensar ut radikaler och olika divalenta koncentrationer jon.
  5. Reagenser för peroxidative (1.5.1) och oxidativ (1.5.2) footprints reaktion.
    1. Den peroxidative Fenton reaktion kräver nyberedd vattenlösningar på 100 mm Fe-EDTA-lösning, och 50 mm natrium-L-askorbat och 1,5% H 2 O 2. Den Fe-EDTA-lösning bereds genom att blanda Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 med EDTA ha 1,1 gånger högre än EDTA över järn.
    2. Strax före inleder den oxidativa klyvning reaktion (3.4.2), skapa Fenton reaktionsblandningen genom att kombinera 2 ìl av Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 mm), 2,2 l EDTA (250 mm), 62,5 l natrium-L-askorbat (500 mm), 22,5 l 10x reaktion buffert och 135,5 l H 2 O att nå den slutliga koncentrationer i footprints reaktionsblandningen (3.4.2) av 0.10 mm, 0,11 mm och 6,61 mM, respektive.

2. RNA Förberedelse för footprints Experiment

  1. RNA kan produceras av standard in vitro transkription av DNA mallar 6 eller, om den är kortare än 50 nukleotider, köpas (t.ex. vid Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). Följ rekommenderade rutiner laboratorium renlighet som håller proven åtskilda av RNA under footprints experiment. 7
  2. Defosforylationen 8 av in vitro-transkriberat RNA är nödvändig innan 32 P märkning av de 5 "slutet av RNA. 10 pmol av RNA är slut-märkta av kinasing. 9 Lösningen ska vara molnigt efter lyckad inaktivering av fosfatas.
  3. Rena radioaktivt märkt RNA med hjälp av denaturering gelelektrofores. RNA återvinns av två efterföljande gel extraktioner med 0,3 acetat M natriumhydroxid (pH 5,5). RNA fälls genom att blanda 0,5 ml vattenlösning med 1 ml etanol och efterföljandeinkubation i 1 minut på torr is. Spin prov vid 4 ° C, 12.500 rpm för 0,5 timme. Kassera supernatanten och tvätta RNA pellets med 70% etanol. Avlägsna supernatanten efter ytterligare centrifugering och torr pellets i vakuum.
  4. Lös upp 32 P-märkta RNA-prover i 330 ul 1X Buffer.Pipet 30 ìl av RNA-lösning i ett reaktionsrör, fällning med etanol och torka RNA i vakuum, hålla detta rör för att generera referensen stegen (steg 3,5). Denaturera buffrade RNA-lösning genom uppvärmning vid 95 ° C i 2 min. Kyl proverna till rumstemperatur i 15 min och ger en snabb spinn för att få ner kondenserar på locken på rören tillbaka till lösning.

3. Den footprints Experiment

  1. Den elektrofores kam avgör det maximala antalet datapunkter per analytiska gelen. Vi använder en 30 bra kam. Hänvisningen stege upptar två brunnar och uncleaved kontroll ett. Bered 27 reaktionsrör. Den slutliga Mg (II) concentrations bör vara jämnt fördelade på en logaritmisk skala som spänner storleksordningar runt titreringen mittpunkten.
  2. Separat, Inkubera RNA och Mg (II) lösning vid 50 ° C i 5 min. Blanda 10 ìl av RNA-lösning med 90 ìl av motsvarande mängd Mg (II) i 1x buffert för att nå en slutlig volym på 100 l. Inkubera lösningar för 30 minuter vid 50 ° C.
  3. Låt lösningar utjämna till 25 ° C under 1 timme medan fällbara inträffar.
  4. Peroxidative (3.4.1) eller oxidativa (3.4.2) hydroxylradikaler footprints reaktion.
    1. Starta peroxidative reaktionen genom att placera droppar av 2 l Fe-EDTA (100 mm), 2 l natrium-L-askorbat (50 mm) och 2 l H 2 O 2 (1,5%) separerade från varandra högst upp på insidan av reaktionen röret med RNA-lösningen och starta footprints reaktionen av kraftig omrörning. Stoppa reaktionen efter 15 sekunder genom att tillsätta 300 l kallt absolut etanol. Vrid rören 3-5 gånger. Fällning, skölj ochtorra pelleten som i steg 2,4.
    2. Starta oxidativa hydroxylradikaler footprintingreaction genom att lägga till 5 ìl av nyberedda Fenton reaktionsblandningen (1,6). Inkubera i 30 minuter vid 25 ° C. Tillsätt 300 l kallt absolut etanol för att släcka reaktionen och blanda genom att vända rören 3-5 gånger. Fällning, skölj och torka pellets som anges i steg 2,4.
  5. Generera en RNas T1 smälta referensprov enligt standardrutiner 10 med den lösning som beretts i steg 1,3.
  6. Lös RNA pellets i 8 l gel laddningsfärg II (Ambion) och bekräfta RNA är återsuspenderade med hjälp av geigermätare.
  7. Förbered en denaturering, 8% gel polyakrylamid sekvensering enligt standardprotokoll. 11 Ladda prov även två referenser och en kontroll. Separata RNA fragment på 60 W - 75 W för 2,5 timme. Exponera torkade gelen till ett lager fosfor skärm natten. Scan fosfor skärm med en avbildning för filmless autoradiografi, t.ex.. Storm 865 (GE Healthcare) eller Typhoon (GE Healthcare). Överför fil gel bilden till din dator.

4. Dataanalys

  1. Den hydroxylradikaler reaktivitet varje nukleotid bestäms genom att kvantifiera intensiteten i varje band på den analytiska gelen. Ladda ner, installera och öppna SAFA, en lättanvänd programvara med öppen källkod för enstaka band montering och kvantifiering. 12, 13 Följ anvisningarna bruksanvisning. Kortfattat, ladda RNA-sekvens som. Txt-fil följt av gelen bild som. Gel-fil. Justera bandets intensitet, definiera banor att välja ett ankare körfält och utföra en gel anpassning. Tilldelning av band till nukleotider förekommer i förhållande till RNas T1 matsmältningen stege. Kvantifiera bandet integraler och använda normalisering / colorplot funktionen för att normalisera och tilldela potentiellt invariant rester. Spara resultatet som en. Txt-fil.
  2. Safa utgångar ett kalkylblad som innehåller kolumner som representerar körfält på gelen och raderna representerar iintegrerades band täthet av de enskilda banden motsvarande RNA-fragment. Först identifiera de skyddsområden som visar en märkbar förändring i lösningsmedel tillgängligheten genom att jämföra det skydd profilen kommer från någon Mg (II) provet med profilen på den slutpunkt Mg (II) koncentration (50 mm i vårt exempel). Ju lägre värde, desto mer skyddade nukleotid mot angrepp från hydroxylradikaler och vice versa.
  3. Skapa vika isotermer från den normaliserade bandet integraler av enskilda eller grupper av nukleotider kontra Mg (II) koncentration. Isotermerna är individuellt skalas till fraktionerad mättnad av FI = L + (U - L) • Y där F betecknar den integrerade densitet av bandet (s) som analyseras, L och U representerar den undre och övre gränser för övergången och Y är fraktionerad mättnad. 14 Uppgifterna passa använder en icke-linjär lEast Square analys program (Vi använder antingen Ursprung (OriginLab) eller GraphPad (GraphPad Software, Inc.).) till Hill ekvation (1),
    Ekvation 1
    där K d är jämvikt dissociationskonstant, [M] motsvarar koncentrationen av den variabel som förmedlar det fällbara reaktionen Mg (II) i detta exempel, och n H är den Hill koefficient. Detta förfarande skalor övergången till fraktionerad mättnad, bestämmer dess mittpunkt och ger en fenomenologisk test av om en övergång är sigmoidal. Isotermer från sekvensering geler (Figur 3A) som analyserades av Safa (Figur 3B) och montera enligt ovan visas i figur 3C. Den fraktionerad mättnad isotermer visas i figur 3 genererades genom att skala i ett kalkylblad de värden som genereras av SAFA mot de bästa passform övre och undre gränsen (U och L) med hjälp av ekvationen fraktion = värde / (U - L) - L / (U - L).

5. Representativa resultat:

Figur 3 visar representativa resultat från P4-P6 RNA • OH footprints experiment. Gelen bilden (till vänster) visar att a) Bakgrund klyvning är minimal (höger körfält), b) enda nukleotid uppdrag är möjligt på grund av väldefinierade band i T1 Lane (RNas T1 klyver vid varje G), och c) hydroxylradikaler inducerad fragmentering av RNA är långt över bakgrunden. Övergången från låg till hög Mg (II) är anslutet med minskande integrerad band tätheten av enskilda och grupper av band som visar bildning av RNA-tertiär struktur. Enstaka eller grupper av sammanhängande nukleotid vars klyvning förändringar tillsammans kallas ett "skydd". Den • OH skydd utmärkande för Mg (II) medierad infällning av P4-P6 RNA nära motsvara lösningsmedel otillgängliga regionerna av molekylen som observerats i dess kristallstruktur. 15

Vikta RNA-molekyler C en har mycket olika omfattning (dvs hur nära bakgrunden bandet tätheter tillbakagång) av högre skyddsutrustning som inte har samband med tydliga strukturella eller dynamiska fenomen. Därmed kommer vissa RNA-molekyler visa väl definierade strukturella övergångar, som visas i figur 3, och vissa inte. Band stödnivåer kvantifieras och normaliseras genom SAFA 12 analys (Figur 3B). Utgången är en "termisk" plot visualisera den relativa graden av skydd mot • OH. Färgen övergången beskriver tillgängligheten förändras vid Mg (II) tillägg. Vit till röd eller blå visar mer tillgängligt eller flera skyddade nukleotider, respektive. Varje grad av skuggning är knuten till ett numeriskt värde som kan ritas som en skydd kurva (figur 3C) och analyseras av en bindande modell som Hill ekvation (1). Jämvikten dissociationskonstant anslutna till skydd 153-155 är ungefär dubbelt så stor som motsvarande värde av skydd 163-164.

INNEHÅLL "> Figur 1
Figur 1. Hydroxylradikaler produktion och P4-P6 RNA vikning. A) Fe (II) katalyserar generationen hydroxylradikaler från väteperoxid. Askorbat reducerar Fe (III) till järn järn. B) I avsaknad av Mg (II), finns ingen P4-P6 tertiärstruktur bildas, vilket gör att hydroxylradikaler att tränga in och klyva alla tillgängliga ryggraden positioner. Tillägg av Mg (II) inleder vikning av P4-P6, vilket gör att endast lösningsmedlet tillgänglig ryggraden som klyvs av hydroxylradikaler.

Figur 2
Figur 2. Studieplan för en hydroxylradikaler footprints experiment. A) Dephophorylation och 32 P 5'-änden märkning av RNA. B) Rening av 32 P-märkt RNA på en denaturering polyakrylamidgel. C) Excision av RNA-bandet, efterföljande RNA-extraktion och etanol nederbörd. D) Prefolding ochvikning av RNA. E) Tillägg av färska beredda Fenton reaktionsblandningen att generera hydroxylradikaler. F) RNA fragment separation genom denaturering elektrofores polyakrylamidgelelektrofores. G) Kvantifiering av RNA-fragment av Safa-program.

Figur 3
Figur 3. Analys av RNA-fragment efter peroxidative Fenton footprints reaktion. (A) RNA var utsatt för hydroxylradikaler och sönderdelningsprodukterna löstes med hjälp av denaturering elektrofores polyakrylamidgelelektrofores (sida). Bilden visar peroxidative sönderdelningsprodukterna med ökande koncentration av Mg (II). Referens och kontroll körfält är märkta. Denna bildfil är ingången för Safa-programmet som quantitates volymen på varje band. (B) Den "termiska" plot som genereras av Safa. (C) ett kalkylblad med värden avseende integrerade bandet densitet nukleotid nummer utdata från SAFA analyseras genom en bindande modell som Hill equatiom (1). Regioner skydd valdes i enlighet med ökningen av bandet integrerad densitet som funktion av Mg (II) koncentration. K d är Mg (II) koncentration vid vilken hälften av RNA-viks på plats som övervakas. The Hill koefficienten, n H, är ett mått på lutningen på kurvan som ger information om bindande kooperativitet och ger en lägre uppskattning av antalet magnesiumjoner inblandade i vikning av denna webbplats.

Tabell 1
Tabell 1. Representativ för generering av RNA-prover som innehåller olika Mg (II) koncentrationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydroxylradikaler footprints är ett värdefullt verktyg för att bedöma lösningsmedlet åtkomlig yta av nukleinsyror. Kvalitativa och kvantitativa bildandet av tertiärstruktur 14 kan följas som en funktion av parametrar som jon-typ och koncentration, pH, temperatur, bindande proteiner eller vikning co-faktorer. Den övertygande kombination av en rak och billig protokoll och den resulterande lösningsmedel tillgänglighet och vikning information på en enda nukleotid nivå gör denna metod mycket attraktiv. Traditionellt • OH footprints reaktion utförs med hjälp läggas H 2 O 2, ett protokoll som vi kallar "peroxidative" (Figur 1A). Alternativet (oxidativ) protokoll 17 som vi belysa utnyttjar givetvis löst O 2 för att producera små mängder av väteperoxid via reaktioner
Ekvation 2

Båda metoderna GEnerate • OH via oxidation av Fe (II) till Fe (III) av H 2 O 2 (Figur 1A). Personliga preferenser verkar för att avgöra vilket protokoll som används av medlemmar i vårt laboratorium för strukturella kartläggning och jämvikt experiment titrering. Den oxidativa och peroxidative footprints reaktioner tar ca 30 och 1 min. Denna nackdel uppvägs av den oxidativa-protokollet är något enklare (en mindre reagens tillsätts) och "skärpa" på oxidativ elektroforetiska bandet profiler. Även denna iakttagelse tyder på mindre anomalier i • OH sönderdelningsprodukterna, har denna hypotes inte testats. Vi rekommenderar att du använder den oxidativa protokollet för att analysera ett stort antal footprints prover (> 15) eller prover som innehåller H 2 O 2 känsliga komponenter.

Användningen av negativt laddade EDTA-komplex av Fe (II) (Figur 1A) förhindrar sammanslutning av Fe (II) med negativt laddade fosfat ryggraden i nukleinsyrasyra. 1 Gratis Fe (II) kan binda till DNA och RNA och fungera som ett fällningsmedel och / eller kan katalysera hydrolysen av RNA ryggraden.

De presenterade koncentrationer av Fenton reagenser är perfekt för att klyva P4-P6 RNA under en enda drabbade kinetik nödvändiga förutsättningarna för footprints i de angivna buffert. Enda träff kinetik se till att den RNA-molekylen klyvs endast en gång i genomsnitt. 18 Om en alltför stor mängd Fenton reagensen används, kan RNA produkter uppstå från mer än en klyvning händelse. Denna bias fragmentet fördelningen mot kortare sönderdelningsprodukterna. Omfattningen av radikal klyvning måste justeras så att ~ 20% i slutet märkt RNA klyvs och ~ 80% i slutet märkt RNA förblir intakt. Dos-respons experiment måste användas för att identifiera lämpliga Fe (II) / H 2 O 2 halter för att nå enda hit kinetik under lösningen villkoren för en utredare studie. 19

Den fråIve lösningsmedel tillgänglighet kartor från • OH footprints analyser kan användas ensamt att karakterisera RNA-struktur, falsning och mellanliggande strukturer som bildas under experiment jämvikt vikning. Dessa data kan kombineras med resultat från tekniker hantera förändringar i den globala konformation 7, 20 och / eller enzymatiska och kemiska studier footprints 21 som genererats under identiska förhållanden. Grovkorniga modeller av RNA strukturer 22 kan utvecklas med hjälp av hydroxylradikaler och kompletterande kemiska och enzymatiska profiler footprints som begränsningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Health RO1-GM085130 och National Science Foundation MCB0929394. Vi tackar Dr Marion Schmidt för sin gästfrihet och för att tillåta oss att filma i hennes laboratorium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name Company Cat#
Sodium Cacodylate(Caution! Toxic) Sigma-Aldrich C4945-25g
EDTA (0.5 M) Ambion AM9260G
DEPC treated water Ambion AM9915G
Sodium Acetate (3 M) Ambion AM9740
MgCl2 (1 M) Ambion AM9530G
Urea Ambion AM9902
Sodium Citrate Sigma-Aldrich W302600
tRNA Sigma-Aldrich R-7876
Sodium-L-ascorbate Sigma-Aldrich A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O Sigma-Aldrich F1543-500g
RNase T1 Fermentas EN0541
Hydrogen Peroxide (30%) Sigma-Aldrich 349887

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
  2. Celander, D. W., Cech, T. R. Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).
  3. Celander, D. W., Cech, T. R. Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule. Science. 251, 401-407 (1991).
  4. Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting. Science. 279, 1940-1943 (1998).
  5. Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts. Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).
  6. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).
  7. Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting. Methods. 49, 142-147 (2009).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).
  9. Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes. Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).
  10. Knapp, G. Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure. Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).
  11. Slatko, B. E., Albright, L. M. Denaturing gel electrophoresis for sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).
  12. Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 11, 344-354 (2005).
  13. Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA. Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).
  14. Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme. Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).
  15. Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science. 273, 1678-1685 (1996).
  16. Petri, V., Brenowitz, M. Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).
  17. Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations. J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).
  18. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).
  19. Shcherbakova, I., Mitra, S. Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure. Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).
  20. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
  21. McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly. Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).
  22. Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters. RNA. 15, 189-199 (2009).
Övervakning Jämvikt Förändringar i RNA-struktur med "Peroxidative" och "oxidativ" hydroxylradikaler footprints
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bachu, R., Padlan, F. S., Rouhanifard, S., Brenowitz, M., Schlatterer, J. C. Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting. J. Vis. Exp. (56), e3244, doi:10.3791/3244 (2011).More

Bachu, R., Padlan, F. S., Rouhanifard, S., Brenowitz, M., Schlatterer, J. C. Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting. J. Vis. Exp. (56), e3244, doi:10.3791/3244 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter