Summary
Este protocolo describe la forma de cuantificar el Mg (II)-dependiente de la formación de la estructura del ARN superior mediante dos métodos de huella radical hidroxilo.
Abstract
Las moléculas de ARN desempeñan un papel esencial en la biología. Además de transmitir la información genética, el ARN puede plegarse en estructuras terciarias única que cumple un papel biológico específico, como regulador, carpeta o un catalizador. Información acerca de la formación terciaria de contacto es esencial para entender la función de moléculas de ARN. Radicales hidroxilo (OH •) son las sondas único de la estructura de los ácidos nucleicos, debido a su alta reactividad y tamaño pequeño. 1 Cuando se utiliza como una sonda de huellas, los radicales hidroxilo mapa de la superficie accesible al soluto de la columna vertebral fosfodiéster del ADN y el ARN 1 2 con tan fina como la resolución de un solo nucleótido. La huella radical hidroxilo se puede utilizar para identificar los nucleótidos dentro de una superficie de contacto intermolecular, por ejemplo, en el ADN en proteínas y complejos de un ARN-proteína. Equilibrio 3 y 4 cinética transiciones se puede determinar mediante la realización de la huella de radicales hidroxilo en función de un solutien la variable o la hora, respectivamente. Una característica clave de la huella es que la exposición limitada a la sonda (por ejemplo, "un solo ataque cinética") se traduce en la toma de muestras uniformes de cada nucleótido del polímero. 5
En este artículo, video, utilizar el dominio P4-P6 de la ribozima de Tetrahymena para ilustrar la preparación de ARN de la muestra y la determinación de Mg (II) mediada por las isotermas de plegado. Se describe la utilización del conocido protocolo de hidroxilo huella radical que requiere de H 2 O 2 (a esto lo llamamos el "peroxidación" protocolo) y un valor, pero no se conoce ampliamente, alternativa que utiliza naturalmente, O 2 disuelto (llamamos a esto "el oxidativo "protocolo). Una visión general de la reducción de datos, la transformación y los procedimientos de análisis se presenta.
Protocol
1. Preparación de los reactivos Huella
- Preparar un tampón de reacción 10x con 100 mM cacodilato de sodio, 1 mM EDTA y 1 M KCl. Ajustar el pH a 7.4. Filtro de la memoria intermedia con un 0,2 M de acetato de dispositivo de filtro (Nalgene). Nota: no ARN pipeta directamente en el buffer 10x.
- Prepare la mezcla de reacción de titulación para cada reacción, como se indica en la Tabla 1. El volumen de la mezcla de la valoración (1x buffer y Mg (II) a la concentración deseada) debe ser de 90 l, antes de añadir 10μl de ARN en tampón 1x.
- Preparar un buffer de RNasa T1 digestión que contiene urea 6.63M, citrato de sodio 20 mM, 1 mM EDTA, 0,25 mg / l tRNA, 0,025% cyanol xileno, y 0,025% de azul de bromofenol. Este buffer se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses.
- La reacción de Fenton requiere recién preparada las soluciones acuosas de 250 mM Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA y 500 mM de sodio L-ascorbato. Las concentraciones en el capítulo 10.5 son las más adecuadas para los experimentos de equilibrio en un tampón de cacodilato de sodio, tales como que no se eliminan los radicales y diversas concentraciones de iones divalentes.
- Los reactivos para la reacción de la huella peroxidativo (1.5.1) y oxidativo (1.5.2).
- La peroxidación reacción de Fenton requiere recién preparada las soluciones acuosas de 100 mM Fe-EDTA, y 50 mM de sodio L-ascorbato y el 1,5% H 2 O 2. La solución de Fe-EDTA se prepara mezclando Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 con EDTA a tener 1,1 veces el exceso de EDTA sobre el hierro.
- Justo antes de iniciar la reacción de escisión oxidativa (3.4.2), crear la mezcla de reacción de Fenton mediante la combinación de 2 l de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 mm), 2,2 l de EDTA (250 mM), 62,5 l L-ascorbato sódico (500 mM), 22,5 l buffer de reacción 10x y 135,5 l de H 2 O para llegar a la concentración final en la mezcla de reacción de huellas (3.4.2) de 0.10 mM, 0,11 y 6,61 mM, respectivamente.
2. ARN preparación para el experimento Huella
- ARN puede ser producido por la norma en la transcripción in vitro de seis plantillas de ADN o, si menor de 50 nucleótidos, pueden comprar (por ejemplo, en Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). Siga los procedimientos recomendados para la limpieza de laboratorio para mantener la integridad de las muestras de ARN durante los experimentos huella 7.
- 8 de desfosforilación in vitro ARN transcrito es necesaria antes de etiquetado P 32 del extremo 5 'del ARN. 10 pmol de RNA son finales etiquetados por kinasing. 9 La solución debe ser despejado con éxito después de la inactivación de la fosfatasa.
- Purificar el ARN marcado radiactivamente mediante electroforesis en gel de desnaturalización. El ARN se recupera por dos posteriores extracciones de gel con 0,3 M de acetato de sodio (pH 5,5). ARN se precipita mediante la mezcla de 0,5 ml de solución acuosa con 1 ml de etanol y la posteriorincubación durante 1 minuto en hielo seco. Giro de la muestra a 4 º C, 12500 rpm durante 0,5 horas. Descartar el sobrenadante y lavar el ARN precipitado con etanol al 70%. Aspirar el sobrenadante después de centrifugación adicional y seco en pelets en el vacío.
- Disolver los 32 P-etiquetados muestras de ARN en 330 ul de 1x Buffer.Pipet 30 l de la solución de ARN en un tubo de reacción, el precipitado con etanol y el ARN en seco en el vacío, mantenga este tubo para la generación de la escala de referencia (paso 3.5). Desnaturalizar la solución tampón de ARN por calentamiento a 95 ° C durante 2 min. Fresco de las muestras a temperatura ambiente durante 15 min y dar una vuelta rápida para reducir la condensación en las tapas de los tubos de nuevo el producto.
3. El experimento de Huella
- El peine de electroforesis determina el número máximo de puntos de datos por gel analítica. Nosotros usamos un peine y 30. La escalera de referencia ocupa dos pozos y el control de uncleaved. Prepare 27 tubos de reacción. El final de Mg (II) Concentradoscomplementos deben ser espaciados uniformemente en una escala logarítmica que abarca varios órdenes de magnitud cerca del punto medio de valoración.
- Por otra parte, se incuba el ARN y las soluciones de Mg (II) a 50 ° C durante 5 min. Mezclar 10 l de solución de ARN con 90 l de la cantidad correspondiente de Mg (II) en 1x buffer para alcanzar un volumen final de 100 microlitros. Incubar las soluciones durante 30 minutos a 50 ° C.
- Deje que las soluciones de equilibrio a 25 ° C durante 1 hora, mientras que plegado tiene lugar.
- Peroxidativo (3.4.1) o oxidativo (3.4.2) la reacción hidroxilo huella radical.
- Iniciar la reacción de peroxidación mediante la colocación de las gotas de 2 l de Fe-EDTA (100 mM), 2 l de sodio L-ascorbato (50 mM) y 2 l H 2 O 2 (1,5%), separadas unas de otras en el interior de la parte superior de la reacción tubo que contiene la solución de ARN e iniciar la reacción de la huella de una mezcla vigorosa. Detener la reacción después de 15 segundos mediante la adición de 300 l de etanol absoluto frío. A su vez los tubos de 3.5 veces. Precipitado, lavar ysecar el pellet como en el paso 2.4.
- Inicie el footprintingreaction oxidativo de radicales hidroxilo mediante la adición de 5 l de la mezcla de reacción recién preparada Fenton (1,6). Incubar durante 30 min a 25 ° C. Añadir 300 l de etanol absoluto frío para detener la reacción y mezclar girando el tubo 3-5 veces. Precipitado, lavar y secar el pellet, como se indica en el paso 2.4.
- Generar una RNasa T1 muestra de referencia digerir acuerdo con los procedimientos estándar de 10 con la solución preparada en el paso 1.3.
- Disolver pellets de ARN en 8 l de gel de carga de tintes II (Ambion) y el ARN se vuelve a suspender confirmar mediante el contador Geiger.
- Prepare una desnaturalización, gel de poliacrilamida al 8% de secuenciación de acuerdo con protocolos estándar. 11 muestras de carga, incluyendo dos referencias y un control. Separar fragmentos de ARN a 60 W - 75 W durante 2,5 horas. Exponer gel seco a una pantalla de fósforo de almacenamiento durante la noche. Exploración pantalla de fósforo con un sistema de imagen para autorradiografía sin película, por ejemplo,. Tormenta 865 (GE Healthcare) o tifón (GE Healthcare). Transferencia de archivos gel imagen en tu ordenador.
4. Análisis de Datos
- La reactividad del radical hidroxilo de cada nucleótido se determina mediante la cuantificación de la intensidad de cada banda en el gel de análisis. Descargue, instale y abra SAFA, un fácil utilizar el software de código abierto para montar una sola banda y cuantificación. 12, 13 Siga las instrucciones del manual del usuario. En pocas palabras, la carga de la secuencia de ARN como. Txt seguido de la imagen como un archivo de gel. Gel. Ajustar la intensidad de la banda, definir los carriles, elija un carril de anclaje, y realizar una alineación gel. Asignación de bandas de nucleótidos ocurre en referencia a la escalera de RNasa T1 digestión. Cuantificar las integrales de banda y usar la función de normalización / colorplot para normalizar y asignar los residuos potencialmente invariante. Guardar el resultado como un archivo. Txt.
- SAFA salidas de una hoja de cálculo que contiene las columnas que representan los carriles en el gel y las filas que representan entegrated banda de densidad de las bandas individuales correspondientes a los fragmentos de ARN. En primer lugar, identificar los sitios de protección que muestran un cambio notable en la accesibilidad de disolvente mediante la comparación del perfil de la protección derivada de la no Mg (II) de la muestra con el perfil de el punto final de Mg (II) de concentración (50 mM en nuestro ejemplo). Cuanto más bajo sea el valor, más protegido es el nucleótido está en contra del ataque de los radicales hidroxilo y viceversa.
- Crear isotermas plegado de las integrales de banda normalizado de las personas o grupos de nucleótidos frente a Mg (II) de concentración. Las isotermas son individualmente a escala de la saturación fraccional por fi = L + (U - L) •
donde f denota la densidad integrada de la banda (s) que se analiza, L y U representan los límites inferior y superior de la transición y 
es la saturación fraccional. 14 Los datos se ajustan utilizando una l no linealEste programa de análisis de cuadrados (Usamos ya sea de origen (OriginLab) o GraphPad (GraphPad Software, Inc.).) a la ecuación de Hill (1), 
donde K d es el equilibrio constante de disociación, [M] corresponde a la concentración de la variable que interviene en la reacción de plegamiento, Mg (II) en este ejemplo, y H n es el coeficiente de Hill. Este procedimiento de escalas de la transición a la saturación fraccional, determina su punto medio y proporciona una prueba fenomenológica de si la transición es sigmoidal. Isotermas derivadas de geles de secuenciación (Figura 3), que fueron analizados por SAFA (Figura 3B) y el ajuste como se describe anteriormente se muestran en la Figura 3C. Las isotermas de saturación fraccional se muestra en la Figura 3 se generaron por la escala en una hoja de cálculo de los valores generados por la SAFA contra el mejor ajuste de los límites superior e inferior (U y L) con la fracción de la ecuación = valor / (U - L) - L / (U - L).
es la saturación fraccional. 14 Los datos se ajustan utilizando una l no linealEste programa de análisis de cuadrados (Usamos ya sea de origen (OriginLab) o GraphPad (GraphPad Software, Inc.).) a la ecuación de Hill (1), 
5. Los resultados representativos:
La Figura 3 muestra los resultados representativos de P4-P6 ARN • Experimentos huella OH. La imagen de gel (izquierda) indica que una división de fondo) es mínimo (carril derecho), b) la asignación de un solo nucleótido es posible gracias a las bandas bien definidas en el carril de la T1 (RNasa T1 se unirá en cada G), y c) el radical hidroxilo la fragmentación inducida por el ARN está muy por encima del fondo. La transición de bajo a alto Mg (II) está afiliada con la disminución de la densidad de la banda integrada de individuos y grupos de bandas que indican la formación de la estructura del ARN terciario. Individuales o grupos de nucleótidos contiguos cuya división cambios de forma concomitante se conoce como "protección". Las protecciones • OH características de la Mg (II) mediada plegado de la ARN P4-P6 corresponden muy de cerca a las regiones inaccesibles solvente de la molécula de observar en su estructura cristalina. 15
Doblado las moléculas de ARN c uno tiene extensiones muy diferentes (es decir, qué tan cerca a un segundo plano la declinación banda densidades) de protección contra el contacto superior que no se han relacionado con el fenómeno de clara estructurales o dinámicas. Por lo tanto, algunas moléculas de ARN se muestran bien definidas las transiciones estructurales, como se muestra en la Fig. 3, y otros no. Intensidades de las bandas se cuantificó y se normalizó por la SAFA 12 análisis (Figura 3B). La salida es un "térmico" complot visualizar el grado relativo de la protección contra • OH. La transición de colores describe el cambio de la accesibilidad en Mg (II) Además. Blanco a rojo o azul muestra nucleótidos más accesible o más protegidas, respectivamente. Cada grado de sombreado está afiliado a un valor numérico que se pueden representar como una curva de protección (Figura 3C) y se analizaron mediante un modelo de unión, como la ecuación de Hill (1). La constante de equilibrio de disociación afiliado con la protección del 153-155 es aproximadamente el doble que el valor correspondiente de protección 163-164.
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Figura 1. Producción de radicales hidroxilo y P4-P6 plegamiento del ARN. A) Fe (II) cataliza la generación de radicales hidroxilo a partir de peróxido de hidrógeno. Ascorbato reduce Fe (III) de vuelta a hierro ferroso. B) En ausencia de Mg (II), sin estructura terciaria P4-P6 se forma, lo que los radicales hidroxilo para penetrar y romper todas las posiciones de columna vertebral accesible. Además de la Mg (II) inicia plegamiento de P4-P6, permitiendo sólo la columna vertebral accesible solvente para ser cortado por los radicales hidroxilo.
Figura 2. Esquema de un experimento de la huella de radicales hidroxilo. A Dephophorylation) y 32 P 5 'final de etiquetado de ARN. B) La purificación de 32 P-RNA marcado en un gel de poliacrilamida. C) La escisión de la banda de ARN, tras la extracción de ARN, y precipitación con etanol. D) Prefolding yplegamiento del ARN. E) La adición de recién preparada mezcla de reacción de Fenton para generar radicales hidroxilo. F) ARN separación fragmento de desnaturalización electroforesis en gel de poliacrilamida. G) La cuantificación de fragmentos de ARN por el software de SAFA.
Figura 3. Análisis de fragmentos de ARN después de la reacción peroxidativa huella Fenton. (A) El ARN fue expuesto a los radicales hidroxilo y los productos de degradación se resolvieron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE). La imagen muestra los productos de peroxidación de separación con la creciente concentración de Mg (II). Carriles de referencia y control están etiquetados. Este archivo de imagen es la entrada para el programa SAFA que cuantifica el volumen de cada banda. (B) El 'térmico' trama generada por la SAFA. (C) Una hoja de cálculo de los valores relacionados con la densidad de la banda integrada a la salida número de nucleótidos de SAFA es analizada por un modelo de unión, como el Cerro equatien (1). Regiones de protección fueron escogidos de acuerdo con el aumento de la densidad de banda integral en función de Mg (II) de concentración. El K d es el Mg (II) concentración en la que se dobla la mitad de la ARN en el sitio se está supervisando. El coeficiente de Hill, n H, es una medida de la pendiente de la curva que da información sobre la cooperatividad de unión y proporciona una estimación más baja para el número de iones de magnesio que participan en el plegamiento de este sitio en particular.
Tabla 1. Representante para la generación de volúmenes de muestras de ARN que contiene diferentes Mg (II) las concentraciones.
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Discussion
La huella radical hidroxilo es una herramienta valiosa para evaluar el área de superficie accesible disolvente de los ácidos nucleicos. Formación cualitativa y cuantitativa de la estructura terciaria 14 se puede seguir en función de parámetros como el tipo de iones y la concentración, pH, temperatura, proteínas de unión o plegamiento factores de co-. La atractiva combinación de un protocolo sencillo y de bajo costo y la accesibilidad resulta solvente y la información de plegado en un nivel de nucleótido único que hace este método muy atractivo. Tradicionalmente, la reacción de OH • huella se realiza mediante añadió H 2 O 2, un protocolo que nos referimos como "peroxidación" (Figura 1). La alternativa ("oxidación") el protocolo 17 que se destacan, naturalmente, utiliza O 2 disuelto para producir pequeñas cantidades de peróxido de hidrógeno a través de las reacciones 
Ambos métodos generate OH • a través de la oxidación de Fe (II) a Fe (III) de H 2 O 2 (Figura 1A). Preferencia personal parece determinar el protocolo que se utiliza por los miembros de nuestro laboratorio para el mapeo estructural y experimentos de equilibrio de valoración. Las reacciones de oxidación y peroxidación huella tardará unos 30 minutos y 1, respectivamente. Esta desventaja se compensa con el protocolo oxidativo ser un poco más simple (un reactivo se añade menos) y la "frescura" en los perfiles de la banda electroforética oxidativo. Aunque esta observación sugiere menos heterogeneidad en los productos de degradación • OH, esta hipótesis no ha sido probado. Le recomendamos que utilice el protocolo de oxidación para analizar un gran número de muestras de huellas (> 15) o las muestras que contienen H 2 O 2 componentes sensibles.
El uso de la carga negativa de los complejos EDTA Fe (II) (Figura 1A) impide la asociación de Fe (II) con la columna vertebral de fosfato con carga negativa de los ácidos nucleicosácido. 1 gratis Fe (II) puede unirse al ADN y ARN, y actuar como un precipitante y / o pueden catalizar la hidrólisis de la columna vertebral del ARN.
Las concentraciones de los reactivos presentados Fenton son ideales para romper P4-P6 ARN en un solo ataque condiciones necesarias para la cinética de la huella en la memoria se indica. Cinética de un solo golpe asegurarse de que la molécula de ARN se rompe una sola vez, en promedio. 18 Si una cantidad excesiva de reactivo de Fenton se utiliza, los productos de ARN puede surgir de la división de eventos de más de uno. Esto distorsiona la distribución de fragmentos hacia productos de degradación más corto. La extensión de la división radical debe ser ajustado de manera que el 20% del final de la etiqueta del ARN se escinde y ~ 80% de final de la etiqueta del ARN se mantiene intacta. Dosis-respuesta experimentos se deben utilizar para identificar la autoridad de Fe (II) / H 2 O 2 concentraciones para el logro de un solo ataque cinética en las condiciones de la solución de estudio de un investigador. 19
La relamapas ive solvente accesibilidad obtenidos de los análisis de huellas • OH puede ser utilizado solo para caracterizar la estructura del ARN, las estructuras plegables e intermedios formados durante los experimentos de plegado de equilibrio. Estos datos se pueden combinar con los resultados de las técnicas para abordar los cambios en la conformación global de 7, 20 y / o estudios de huellas químicas enzimáticas y 21, que fueron obtenidos en condiciones idénticas. De grano grueso, los modelos de estructuras de ARN 22 se pueden desarrollar utilizando química de radicales hidroxilo y complementarias y los perfiles enzimáticos huella como restricciones.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud-SR1 GM085130 y National Science Foundation MCB0929394. Agradecemos a la Dra. Marion Schmidt por su hospitalidad y por permitirnos filmar en su laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name | Company | Cat# | |
| Sodium Cacodylate(Caution! Toxic) | Sigma-Aldrich | C4945-25g | |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G | |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 | |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G | |
| Urea | Ambion | AM9902 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R-7876 | |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631-25g | |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma-Aldrich | F1543-500g | |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma-Aldrich | 349887 |
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