Akut og kronisk Tactile sensorisk analyse efter Rygmarvsskader i rotter

Summary

Vi beskriver to taktile sensoriske testmetoder til akutte eller kroniske perioder rygmarvsskade i rotter. Disse validerede procedurer kan registrere udvikling og vedligeholdelse af allodyni-lignende fornemmelser.

Abstract

Rygmarvsskade (SCI) forringer sansesystemer forårsager allodyni ^1-8. At identificere cellulære og molekylære årsager til allodyni, følsomme og gyldig sensorisk test i rotter fællesskabsinteresse modeller er nødvendig. Men indtil for nylig, havde ingen enkelt test metode er valideret for SCI, så standardiserede metoder ikke er blevet gennemført på tværs af laboratorier. Derudover kunne tilgængelige testmetoder ikke kan gennemføres akut eller når svær Bevægelseshindrede eksisteret, forhindrer undersøgelser af udviklingen af SCI-induceret allodyni ^3. Her præsenterer vi to validerede sensoriske testmetoder ved hjælp af von Frey hår (VFH) monofilamenter, som kvantificere ændringer i taktile sensoriske tærskler efter SCI ^4-5. En test er veletableret Up-Down test, som viser stor følsomhed og specificitet på tværs af forskellige SCI sværhedsgrader, når testet kronisk ^5. Den anden test er en nyudviklet dorsale VFH test, der kan anvendes akut efter SCI, når enllodynia udvikler, før motoren genopretning ^4-5. Hver VFH monofilamenter gælder en kalibreret kraft, når rørte på huden af ​​bagpoten indtil den bøjer. I op-ned-metoden, er alternerende VFHs af højere eller lavere kræfter anvendes på sålen L5 dermatom at afgrænse flexor tilbagetrækning tærskelværdier. Stadig højere kræfter anvendes, indtil tilbagetrækning sker da lavere kraft VFHs anvendes indtil tilbagetrækning ophører. Den taktile tærskelværdi afspejler den nødvendige kraft til at fremkalde tilbagetrækning i 50% af stimuli. For den nye test er hver VFH påføres dorsale L5 dermatom af poten, mens rat understøttes af undersøgeren. Den VFH stimulation sker i stigende rækkefølge indtil mindst 2 ud af 3 ansøgninger på en given kraft producerer tilbagetrækning af poten. Berøringsmæssig sensorisk tærskelværdi er den laveste kraft til at fremkalde tilbagetrækning 66% af tiden. Akklimatisering, test-og scoring procedurer er beskrevet. Afvigende forsøg, der kræver en retest og typiske forsøg er defineret. Animal brug wsom er godkendt ved Ohio State University Animal Care og brug Udvalg.

Protocol

1. Op / Ned Plantar Von Frey test

Formålet med test er at bestemme berøringsfølsomhed ved at måle, hvor meget kraft er nødvendig for at fremkalde pote tilbagetrækning fra stimulus. Kommercielt tilgængelige kalibrerede Von Frey hår monofilamenter mellem områder af 4,56 og 6,10 bruges til at stimulere poten. Andre sanseindtryk som visualisering af stimulus eller proprioception kan forvirre taktile tærskel foranstaltninger, så svar baseret på visuel eller proprioceptive input er ugyldige. For at forhindre visualisering af monofilament rører huden, vi tester kun mens rotten spiser korn. Denne kognitive distracter, sikrer også, at alle rotter testes på samme grundlæggende niveau af komfort. For at undgå reaktioner som følge proprioceptive snarere end taktile input, vi ikke omfatter forsøg, hvor monofilament løfter eller flytter pote.

A. akklimatisering PROCEDURER FOR OP-NED TILGANG

1. Nuværende frugt Cereal i hjemmet buret så rotter genkende og søge føde belønning. Rotter behøver ikke at være fødevarer afskåret på ethvert punkt i gentling eller test-processen.
2. Rotter er klar til at blive akklimatiseret til afprøvning miljøet og fremgangsmåder, når de æder frugt korn i hjemburet. Akklimatisering sker over mindst 4 sessioner af 10 minutter hver, men flere kan være behov for. Ti minutters sessioner anvendes således, at rotterne ikke bliver mæt før afslutningen af ​​sessionen.
3. Placere rotte i testkammeret med tre stykker frugt korn. Giv ekstra frugt korn 1-2 ad gangen, så de er spist. På det tredje møde, mens rotten spiser, producerer håndbevægelser under wiren gulvet, så rotten bliver vant til bevægelse under sin pote. På den fjerde samling anvende 5,18 monofilamenter på den plantare overflade af poten cirka en gang i minuttet i alt ti præsentationer. En naiv rotte må ikke svare på denne sub tærskel stimulus.
4. Tally stykker af korn forbruges, hyppig vandladning og afføring, frysning, og grooming adfærd. Frysning Problemet opstår på to måder: a) rotte bøjede lav til jorden sædvanligvis nær bagvæggen eller vender væk fra undersøgeren og forbliver ubevægelig b) rotten er bøjet over i midten af ​​buret og sædvanligvis Deltagere tænder . Frysning adfærd kan fortsætte i lange perioder.
5. En kælet rotte, der er klar til testning vil spise næsten konstant i 10 minutter. Det vil bevæge sig let i buret og søge frugt korn meget hurtigt efter indtagelse af den sidste. Vigtigt er det, vil rotten ikke stoppe med at spise eller blive distraheret af håndbevægelser under wiren gulvet eller monofilamenter ansøgning til pote.

B. TEST PROCEDURER FOR OP-NED TILGANG

1. Rotter producerer nød vokaliseringer, der ligger over vores menneskelige lydlig sortiment. Rotter venter på at blive testet, bør opbevares i et separat rum, så de kan ikke høre disse VOCalizations.
2. Rotter med rygmarvsskade, der er passende for op-ned von Frey hår test skal demonstrere vægtbærende med benene. Lemmer, der ikke er i stand til at støtte rotten ikke pålideligt kan testes, fordi anvendelsen af ​​monofilamenter flytter pote før hår bøjer.
3. Placere en rotte i testkammeret med 2 eller 3 stykker frugt korn. Rotterne skal spise under hver VFH ansøgning.
4. Rul en terning for at afgøre, hvilke HL til at begynde at teste først. Lige numre repræsenterer højre pote og ulige numre repræsenterer venstre.
5. Begynd test session med 5,18 monofilament. Tilbagetrækning reaktioner kan forekomme 4,56-6,10 hos normale og SCI rotter og 5,18 monofilamenter falder i midten af ​​området.
6. Må ikke anvendes en monofilament, mens en rotte fryser, hug eller ikke spiser. Hvis testeren venter, til tider disse betingelser vil løse og test kan genoptages. Hvis rotten viser disse adfærdsmønstre og den samlede tid i AppAratus er 20 minutter, stopper test, og omprøvningen fra begyndelsen af ​​dagen. Du må ikke fjerne rotten, mens det er at vise disse adfærdsmønstre, da dette kan øge deres forekomst. Vent, indtil rotten bryder ud af disse mønstre før du håndterer det at undgå at styrke disse adfærdsmønstre.
7. Rør monofilamenter til L5 sålen dermatom i bagpoten mellem fodstykkerne indtil det bøjer (se figur 1A). Denne glatte støt gennemførelse bør tage omkring et sekund og derefter fjerne det fra huden. Undgå at berøre nogen del af trædepuder, da hudens følsomhed er meget lavere i disse områder. Denne enkelt tryk udgør en retssag.
8. En positiv reaktion optræder, når rotten hurtigt løfter pote op væk fra monofilament. Tilbagetrækningen skal initieres på det tidspunkt monofilamentet fjernes for at bekræfte, at reaktionen er forbundet med monofilament ansøgning.
9. Se dyr til andre beviser for bevidsthed om monofilament berøring såsom vokalisering, søger nedad, bagud eller på den testede pote, slikke poten, vedvarende pote tilbagetrækning eller trækninger ørerne. Bemærk dem på databladet. Når disse adfærdsmønstre forekomme med potetilbagetrækning det tjener som bevis for supraspinal opfattelse af stimulus.
10. Hvis der er en positiv reaktion anvender det næstlaveste monofilament. Hvis der ikke er nogen reaktion (negativ), bevæge sig op til det næste højere monofilament. Tillad 30 sekunder mellem hver monofilamenter ansøgning til de sensoriske receptorer til at komme tilbage til baseline fyring inden fornyet prøvning (for at forhindre tilpasning).
11. Fortsætte med at anvende højere eller lavere monofilamenter på bagpoten baseret på positive eller negative reaktioner, indtil du har 10 forsøg. Derefter gentages på den anden bagpote. (Se eksempel datablad).
12. Den højeste VFH der kan afprøves, uden at indføre proprioceptive input og løfte pote er 6,10. Den 6.45VFH og større bør ikke anvendes, fordi pote løfter før monofilament bøjninger. Hvis der ikke er nogen reaktion på 6,10 så næste forsøg vil anvende 6,10 igen.
13. En reaktion skal blive annulleret, og forsøget skal testes igen, hvis en af ​​følgende sker under stimulus ansøgning eller potetilbagetrækning:
    1. Rotten er ikke konstant at spise.
    2. Rotte bevæger sig væk fra VFH stimulus før bøjning af monofilament, hvilket gør det umuligt at vide den påførte kraft, der fremkalder tilbagetrækning respons.
    3. Poten løftes af VFH (enten før eller efter VFH er bøjet) tilvejebringelse proprioceptive foruden taktil stimulering.
14. En test session normalt kan afsluttes på mindre end 15 minutter for begge bagben.

C. Databehandling for op-ned TILGANG

1. En vellykket test vil have 10 på hinanden følgende forsøg for hver pote.
2. Værdien af ​​den taktile tærskel er det laveste monofilament, der producerer potetilbagetrækning på & ge, 50% af de præsentationer og 3 eller flere præsentationer af monofilament har der gives (se eksempel datablad, er tærskler cirkel).
3. En monofilamenter med kun 2 i alt forsøg ikke er valgt som tærsklen, selv når en retssag er positiv og en negativ. Flere præsentationer af stimulus er bedre indikatorer for det mønster af reaktioner på denne kraft.
4. Hvis der ikke er monofilamenter, der producerer en positiv respons på mindst 50% af prøverne er rotte fik en score på 6,45. Dette betyder, at rotten ikke detektere den højeste testes monofilamenter af 6,10 over tilfældig chance. En værdi på 6,45 er givet, fordi det er det næste højere værdi end testes forskellige monofilamenter.
5. Konverter tærskelværdi for højre og venstre poter i gram kraft. De gram kraft værdier vil blive leveret af leverandøren af ​​von Frey hår. . For data fra bilaterale skader, kan tærsklen gram kraft for de to poter som middelværdier sammen for at giveen enkelt karakter.

2. Dorsal Von Frey Testing

Formålet med denne test er at bestemme berøringsfølsomhed i rotter med en sådan dårlig motorstyring, at de ikke kan testes ved anvendelse af typiske plantare VFH metoder. Det kvantificerer hvor meget tryk kraft er nødvendig for at frembringe en aversiv reaktion. For at undgå reaktioner på proprioceptive stimuli, vi ikke omfatter forsøg, hvor pote flyttes ved VFH under påføringen. Derudover, vi ikke omfatter forsøg, hvor VFH podekviste eller børstes over dorsale overflade af foden.

A. akklimatisering PROCEDURER for dorsal Von Frey TEST

1. Blide rotter for fire sessioner af 10 minutter før baseline test og rygmarvsskade.
2. Løst wrap rotte i et lille håndklæde, så bagparten er eksponeret som vist nedenfor (Figur 1B). Placer rotte hen over et bord med bagpoterne let hvilende på overfladen. Brug sammesidder tæt men ikke stramt wrap og hold for hver rotte. Forfriskende din underarm på kanten af ​​bordet kan mindske variationen mellem rotter.
3. En kælet rotte, der er klar til test, vil ikke modstå at blive holdt håndklædet i ringen i flere på hinanden følgende minutter, men du kan blive nødt til at re-vikle rotte 1 eller 2 gange i løbet af afprøvningen af ​​begge bagpoter.

B. TEST PROCEDURER for dorsal Von Frey TEST

1. Rul en terning for at afgøre, hvilke bagben til at begynde at teste først. Lige numre repræsenterer højre pote og ulige numre repræsenterer venstre.
2. Løst wrap rotten håndklædet i ringen forlader de udsatte bagparten.
3. Taktil stimulus kun anvendes, når rotten er rolig og stille i mindst 10 sekunder.
4. Begyndende med 4,56 VFH anvende monofilamentet vinkelret på den dorsale overflade mellem den første og anden metatarsal omkring 1 cm proximalt til den fælles (figur 1C). Påfør monofilament i en jævn, STEAdy måde i løbet af en sekunders interval, indtil det bøjer derefter fjerne den. Denne enkelt tryk udgør en retssag.
5. En positiv reaktion optræder, når rotten hurtigt bevæger poten væk fra stimulus. Bevægelsesretningen er ofte bageste eller ydre før bagbenet bøjes. Tilbagetrækningen skal initieres på det tidspunkt monofilamentet fjernes for at bekræfte, at reaktionen er forbundet med monofilament ansøgning.
6. Påfør 4,56 monofilamenter to gange med mindst 30 sekunder mellem applikationer for at forhindre sensorisk "windup" og at tillade sensoriske receptorer til at komme tilbage til baseline fyres inden fornyet prøvning (for at forhindre tilpasning).
7. En stimulus test bør genanvendes, hvis VFH glider og forsigtigt strejfer huden, hvilket gør den kraft leveringen mere af en børste eller et sweep i stedet for en spids kontakt.
8. Hvis der er færre end 2 (dvs. 1 eller 0) positive reaktioner på 4,56 monofilament, er den næste større VFH anvendes 3gange på samme måde.
9. På denne måde bliver gradvist større VFHs fra 4,56 gennem 5,88 anvendes, indtil to eller flere positive reaktioner opstår, eller indtil den største VFH er nået.
10. Den potetilbagetrækning tærskel er den laveste VFH som fremkalder mindst 2 positive svar ud af 3 forsøg.
11. Gentag på den anden pote.
12. En test session kan normalt afsluttes i 15 minutter for begge bagpoter.

3. Repræsentative resultater

En vellykket test vil resultere i øjeblikkelig, rask tilbagetrækning af bagpoten til en vinkelret påført VFH til midten af plantar region (figur 1A) eller den dorsale flade mellem 1 ^m og ^2. metatarsus 1 cm fra den fælles (figur 1C) . Disse responser er optalt at udlede taktil tærskelværdi for hver bagpote. Taktile tærskler fra ryg VFH test i akut SCI viste fremragende præcision med plantar VFH tærskler udleded til kroniske gange (figur 2). Fald i taktile tærskler afledt af plantar eller dorsal tests opstår for graduerede SCI (Figur 3 ^3,5). Dette hypersensitivitet manifesterer så tidligt som 7 dage efter SCI og opretholdes under hele forsøget ^3-4,6. Mens en række af SCI sværhedsgrader ikke påvirker taktile sensoriske tærsklerne i poten, fald i tærskler forekomme mere alvorlig SCI (Figur 3). Vigtigt, udvikling af under-niveau allodyni er en alt-eller ingen reaktion, som opstår, når der er et tab på mere end 60% af den hvide substans ved læsion epicentret. (Figur 4 ^3).

Taktile tærskelværdier kan henfalde og producere kunstige reaktioner med lav VFH kræfter. Mindst to betingelser kan frembringe tærskel henfald - hurtigt anvende VFH på huden i en stak eller stikke måde eller ikke ventet længe nok mellem stimulus anvendelser. For at være sikker på, atde taktile tærskler er ægte, skal der drages omsorg for at anvende hver VFH hjælp af en lignende lav hastighed tilgang og interstimulus intervallet skal være mindst 30 sek. Vi har også vist, at spiseadfærd reducerer tærskel forfald ^5.

Figur 1. Skematisk og fotografi, der viser placeringen af VFH stimulation for sålen og dorsale von Frey hår (VFH) testning. A) Til plantar VFH undersøgelse bør von Frey hår påføres vinkelret på midten af ​​fodsålen bagpote cirka 1 cm posteriort for den midterste Phalange (som angivet ved den røde boksen i diagram af den plantare overflade af bagpote) ved en langsom konsekvent hastighed, indtil det bøjer. B og C) For den dorsale VFH teknik er rotten løst pakket ind i en kirurgisk håndklæde, som vist på fotografiet. Den VFH påføres på den dorsale overflade af poten mellem den første og anden metatarsal approximately 1 cm proksimalt til fælles.

Figur 2. Dorsal von Frey hår sensoriske tærskler korrelerer til standard plantar VFH. (N-44; Pearson koefficient = 0,503, p <0,01, r2 = 0,67). Stiplede linjer viser cutoff tærsklen for allodyniske fornemmelse ved anvendelse af enten den dorsale VFH eller plantare VFH teknikker og indikerer, at allodyniske tærskelværdier 7 dage efter SCI anvender Dorsal VFH testen forudsige kronisk under niveau allodyni bestemmes ved plantare VFH metoder.

Figur 3. Tidlige ryg von Frey hår sensoriske tærskler forudsige allodynisk og ikke-allodynisk berøringsfølsomhed tværs skade sværhedsgrader på senere tidspunkter. Sammenlignelige sensoriske tærskler fandt sted mellem 7 dage efter SCI Dorsal VFH og 28 dage efter SCI plantar VFH foranstaltninger. Bemærkelsesværdig lighed forekom en bred vifte af SCI, med signifikant allodyni bemærkes moderat til svær SCI (p <0,05 1,1 mm forskydning i forhold til alle andre grupper).

Figur 4. Procentdel af rotter, der fik laminektomi (ingen SCI) og SCI grupper viser bagpote allodyni ved 6 uger efter SCI. Allodyni blev kun set i rotter med moderate eller svære Sci (OSU ESCID indretning 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 mM ledning forskydninger), mens rotter med mild Sci (0,3, 0,5, 0,7 mM rygmarv forskydninger) udviste normale reaktioner på taktil stimulering. Repræsentative koronale rygmarv sektioner farvet for myelin på læsionen epicentret for laminektomien (skadede kontrol), mild (0,5 mm forskydning) er moderate (1,1 mm forskydning) og alvorlig (1,3 mm forskydning) rygmarv blodudtrædninger indbefattet for at vise graden af ​​axonal besparende der er forbundet med denne overfølsomhed. (Målestok = 0,5 mm).

k ">

Figur 5. En prøve datablad for op-ned von Frey hår test. Håret værdi og resultat (positiv eller negativ), registreres for hvert forsøg. Indikationer af supraspinal bevidsthed om den afprøvning, er noteret. Ved slutningen af ​​testen, er svarene på hvert hår værdi optalt. Den valgte tærskelværdi for eksempel data med en cirkel.

Discussion

De VFH testmetoder præsenteret her repræsenterer to test paradigmer, der er følsomme og gyldige til brug i rotte fællesskabsinteresse modeller. Vigtigt er det, blev dorsale VFH test skabt til vurdering af inddrivelsen af ​​taktile fornemmelse af bagpoterne akut efter midten af ​​thorax SCI, når rotterne er ude af stand til at stå på deres bagparten. Denne afprøvning paradigme kan også anvendes, når rotter genvinder evnen til at understøtte deres vægt og bagbenene efter cervikal SCI.

De to paradigmer vist her udnytter kalibreret VFH at bestemme den taktile tærskelværdi for hver bagpote. Andre metoder bestemme frekvensen af ​​tilbagetrækning til enten en normalt uskadelige eller normalt skadelig stimulus. Vi har tidligere vist, at små forbedringer i taktile tærskler kan repræsentere forskellen mellem tilstedeværelsen af ​​kronisk neuropatisk smerte og normal berøringsindtryk. Derfor udnytte eksperimentelle testmetoder, der stammer smerte tærskler kan fafacilitere translation af potentielle terapeutiske interventioner til klinikken.

Som med alle adfærdsmæssige test, er det vigtigt at minimere antallet af konfoundere i testmiljø, der kan påvirke resultatet af den adfærdsmæssige test ^9. Det er således vigtigt, at hver testsession finder sted på samme tidspunkt på dagen, på den samme temperatur-og fugtighedsreguleret rum. Hertil kommer, at eftersom rotter kommunikere vocally i et ultrasonisk området, er det vigtigt, at rotter venter på at blive testet holdes i et separat rum, indtil de prøvning påbegyndes. Langford et al ¹⁰ viste dramatiske beviser for, at naive dyr oplever smerter efter vidner til en cagemate udsættes for skadelige stimulation. For yderligere at eliminere variationer i taktile sensorisk test, anvender vi sukkervand korn som en kognitiv distraktør under plantar VFH test. Derved stabilisere vi svarene fra dyret. Tærsklen er mindre tilbøjelige til at henfalde heletests, når en distraktør gives, end når man ikke er ^5. Denne stabilisering skyldes sandsynligvis den hærdning af hypervigilant og catastrophizing adfærd, to foregribende stater, hvor truslen om smerte aktiverer frygt og følelsesmæssige centre i hjernen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store