Acuta e Cronica test sensoriale tattile dopo lesione del midollo spinale in ratti

Summary

Descriviamo due metodi di test sensoriali tattili per periodi acuti o cronici di lesioni del midollo spinale nei ratti. Queste procedure validate in grado di rilevare lo sviluppo e la manutenzione di allodinia simili sensazioni.

Abstract

Lesione del midollo spinale (SCI) altera i sistemi sensoriali che causano allodinia ^1-8. Per identificare le cause cellulari e molecolari di allodinia, sensibile e valido test sensoriali su ratti modelli SCI è necessario. Tuttavia, fino a poco tempo fa, un approccio unico test è stato validato per SCI in modo che i metodi standardizzati non sono stati attuati attraverso laboratori. Inoltre, metodi di prova disponibili non hanno potuto essere attuate acuta o quando esistono gravi difficoltà motorie, impedendo gli studi dello sviluppo di SCI-indotta allodinia ^3. Qui vi presentiamo due metodi di test convalidati sensoriali utilizzando von Frey capelli (VFH) monofilamenti che quantificano cambiamenti soglie sensoriali tattili dopo SCI ^4-5. Una prova è la ben consolidata Up-Down prova che dimostra un'alta sensibilità e specificità nei diversi livelli di gravità durante il test SCI cronicamente ^5. Il test è un altro recente sviluppo di test VFH dorsale che può essere applicato dopo acutamente SCI quandollodynia sviluppa, prima del motore recupero ^4-5. Ogni monofilamento VFH applica una forza calibrata quando viene toccata alla pelle della zampa posteriore fino piega. Nel metodo di up-down, VFHs alternanza di forze superiori o inferiori sono usati sul plantare dermatomero L5 a delineare soglie di ritiro flessori. Successivamente le forze più elevate vengono applicate fino alla sospensione si verifica allora VFHs forza inferiori vengono utilizzati fino alla sospensione cessa. La soglia tattile riflette la forza necessaria per provocare il ritiro nel 50% degli stimoli. Per il nuovo test, ogni VFH viene applicato al dermatomero L5 dorsale della zampa il ratto è supportato dal esaminatore. La stimolazione VFH si verifica in ordine crescente di forza almeno fino al 2 di 3 applicazioni ad una data forza produce il ritiro zampa. Soglia sensoriale tattile è la più bassa forza per sollecitare il ritiro il 66% del tempo. Procedure di acclimatazione, di prova e di scoring sono descritti. Sperimentazioni aberranti che richiedono un test retest e tipico sono definiti. Animal uso wcome approvato dalla Ohio State Animal Care University e del Comitato uso.

Protocol

1. Up / Down plantare Von Frey Testing

Lo scopo della prova è di determinare la sensibilità tattile misurando la forza molto è richieste per provocare il ritiro zampa dallo stimolo. Disponibili in commercio calibrati Von monofilamenti capelli Frey tra gli intervalli di 4,56 e 6,10 sono utilizzati per stimolare la zampa. Altri stimoli sensoriali, come la visualizzazione dello stimolo o di propriocezione può confondere le misure di soglia tattili così risposte basate su input visivi o propriocettivi non sono validi. Per impedire la visualizzazione del monofilo toccare la pelle, si verifica soltanto quando il ratto è mangiare cereali. Questo distrattori cognitivo, assicura inoltre che tutti i ratti vengono testati a livelli simili al basale di comfort. Per evitare risposte dovute a propriocettiva, piuttosto che di input tattile, noi non includono processi in cui il monofilamento alza o muove la zampa.

PROCEDURE acclimatazione A. Per la UP-down

1. Presente frutta Cereal nella gabbia casa in modo da ratti riconoscere e cercare la ricompensa cibo. I ratti non hanno bisogno di essere priva cibo in qualsiasi punto del processo Gentling o test.
2. Rats sono pronti per essere acclimatati all'ambiente procedure di prova e una volta che mangiano cereali frutta nella gabbia casa. Acclimatazione si verifica in almeno 4 sessioni di 10 minuti ciascuno, ma più potrebbero essere necessarie. Dieci minuti sessioni vengono utilizzate in modo che i topi non saziare prima della fine della sessione.
3. Mettere il topo nella camera di prova con tre pezzi di cereali frutta. Fornire cereali frutta ulteriore 1-2 alla volta in cui sono consumati. Sulla terza sessione, mentre il topo è mangiare, produrre i movimenti delle mani sotto il pavimento di filo in modo che il topo si abitua al movimento di sotto della sua zampa. Sulla quarta sessione, applicare il monofilamento 5,18 alla superficie plantare della zampa circa una volta al minuto per un totale di dieci presentazioni. Un topo ingenuo non dovrebbe rispondere a questo stimolo soglia sub.
4. Altoy i pezzi di cereali consumati, frequenza della minzione e la defecazione, il congelamento, e comportamenti governare. Comportamento di congelamento avviene in due modi: a) il ratto è accucciato basso a terra di solito vicino alla parete posteriore o rivolto verso l'esaminatore e resta immobile, b) il ratto è curvo nel mezzo della gabbia e chiacchiera di solito i suoi denti . Comportamenti congelamento può continuare per lunghi periodi di tempo.
5. Un topo ingentilita che è pronto per il test mangerà quasi ininterrottamente per 10 minuti. Si muoversi facilmente nella gabbia e cercare di cereali frutti molto rapidamente dopo aver consumato l'ultimo. È importante sottolineare che il ratto non smettere di mangiare o essere distratto da movimenti della mano sotto il pavimento o l'applicazione del filo monofilamento alla zampa.

PROCEDURE DI COLLAUDO PER LA B. UP-down

1. Rats produrre vocalizzazioni di soccorso che si trovano sopra la nostra gamma sonora umana. Rats in attesa di essere testati devono essere conservati in una stanza separata in modo che non riesce a sentire queste vocalizations.
2. I ratti con lesioni del midollo spinale che sono appropriati per up-down test dei capelli von Frey deve dimostrare il carico con gli arti. Membra che non sono in grado di supportare il topo non può essere attendibilmente verificato perché l'applicazione dei monofilamenti muove la zampa prima che si piega dei capelli.
3. Mettere un topo nella camera di prova con 2 o 3 pezzi di cereali frutta. I ratti devono essere mangiare durante ogni applicazione VFH.
4. Tirare un dado per determinare quali HL di iniziare a provare per primo. Anche i numeri rappresentano la zampa destra e numeri dispari rappresentano la sinistra.
5. Iniziate la sessione di test con il monofilo 5.18. Risposte ritiro può avvenire 4,56-6,10 in ratti normali e SCI e il 5,18 monofilo cade a metà della gamma.
6. Non applicare un monofilamento, mentre un topo si blocca, si acquatta o non mangiare. Se il tester attende, a volte queste condizioni si risolve e la sperimentazione può riprendere. Se il ratto visualizza questi comportamenti e il tempo totale in appArato è di 20 minuti, arrestare il test e retest fin dall'inizio il giorno successivo. Non rimuovere il ratto mentre è la visualizzazione di questi comportamenti in quanto ciò potrebbe aumentare la loro presenza. Attendere che il ratto scoppia di questi modelli prima di toccarla per evitare un rafforzamento questi comportamenti.
7. Toccare il monofilamento al dermatomero L5 plantare della zampa posteriore tra i rilievi del piede si piega fino a quando (si veda la Figura 1A). Questa corretta applicazione costante dovrebbe prendere circa un secondo e poi rimuoverlo dalla pelle. Non toccare alcuna parte dei rilievi del piede come la sensibilità della pelle è molto inferiore in queste aree. Questo tocco unico costituisce una prova.
8. Una risposta positiva si verifica quando il topo alza velocemente la zampa al riparo dal monofilamento. Il recesso deve essere avviata dal tempo viene rimosso il monofilo per confermare che la risposta è associato all'applicazione monofilamento.
9. Guarda l'animale per altre prove di consapevolezza del motocco nofilament come vocalizzazione, guardando verso il basso, all'indietro o la zampa testato, leccare il, il ritiro zampa sostenuta zampa o spasmi le orecchie. Nota di loro sul foglio dati. Quando questi comportamenti si verificano con ritiro zampa serve come prova di percezione sopraspinale dello stimolo.
10. Se vi è una risposta positiva, applicare il monofilamento più basso successivo. Se non vi è alcuna risposta (negativa), passare al monofilamento immediatamente superiore. Lasciare 30 secondi tra ogni applicazione monofilo per i recettori sensoriali per tornare alla linea di base prima di ripetere il test di cottura (per evitare adattamento).
11. Continuare ad applicare i monofilamenti superiori o inferiori alla zampa posteriore in base alle risposte positive o negative fino ad avere 10 prove. Quindi ripetere il altra zampa posteriore. (Vedi scheda esempio).
12. La più alta VFH che può essere testato senza introdurre dell'input propriocettivo e sollevando la zampa è 6.10. Il 6.45VFH e più grande non dovrebbe essere usato perché solleva la zampa prima monofilament curve. Se non c'è risposta alle 6.10 allora la prova successiva applicherà il 6,10 di nuovo.
13. Una risposta deve essere annullata e il processo deve essere ri-testato se una delle seguenti si verifica durante l'applicazione dello stimolo o ritiro zampa:
    1. Il ratto non è continuo mangiare.
    2. Il ratto si allontana dallo stimolo VFH prima della piegatura del monofilo, rendendo impossibile conoscere la forza applicata che suscita la risposta ritiro.
    3. La zampa viene sollevato dal VFH (prima o dopo la VFH è piegato) fornire propriocettiva in aggiunta alla stimolazione tattile.
14. Una sessione di test di solito può essere completato in meno di 15 minuti per entrambe le zampe posteriori.

C. DI TRATTAMENTO DEI DATI PER LA UP-down

1. Un test di successo avrà 10 trial sequenziali per ogni zampa.
2. Il valore della soglia tattile è il più basso monofilamento che produce ritiro zampa su & ge il 50% delle presentazioni e dei 3 o più presentazioni del monofilo hanno essere dato (cfr. scheda, ad esempio, le soglie sono cerchiati).
3. Un monofilo con solo 2 prove totale non è selezionato come soglia anche quando si prova è positivo e uno negativo. Presentazioni multiple dello stimolo sono migliori indicatori del modello di risposta a tale forza.
4. Se non c'è monofilamento che produce risposte positive su almeno il 50% dei test, il ratto viene dato un punteggio di 6,45. Ciò significa che il topo non ha rilevato il massimo monofilamenti testabile di 6,10 oltre casualità. Un valore di 6,45 è dato perché rappresenta il successivo valore più alto rispetto alla gamma verificabile di monofilamenti.
5. Convertire il valore di soglia per le zampe a destra ea sinistra in vigore grammo. I valori di grammatura saranno forniti dal fornitore dei peli von Frey. . Per i dati provenienti da lesioni bilaterali, la forza grammo soglia per le due zampe possono essere mediati insieme per produrreun unico punteggio.

2. Dorsal Von Frey Testing

Lo scopo di questo test è determinare la sensibilità tattile in ratti con tale controllo motore poveri che non possono essere testati utilizzando i metodi tipici VFH plantari. Si quantifica quanta forza tocco è necessaria per produrre una risposta avversione. Per evitare risposte agli stimoli propriocettivi, non includono gli studi in cui viene spostata la zampa dal VFH durante l'applicazione. Inoltre, noi non includono prove in cui il VFH scivola o si spazzolato su tutta la superficie dorsale del piede.

PROCEDURE PER LA DORSALE acclimatazione A. VON FREY TEST

1. Ratti Gentle per quattro sessioni di 10 minuti ciascuno prima del test di base e lesioni del midollo spinale.
2. Liberamente avvolgere il topo in un piccolo asciugamano in modo che i quarti posteriori sono esposti come indicato di seguito (Figura 1B). Posizionare il ratto su una tabella con le zampe posteriori appoggiando sulla superficie. Utilizzare lo stessoaderente ma non stretta avvolgente e tenere premuto per ogni ratto. Tutori per l'avambraccio sul bordo del tavolo può ridurre la variabilità tra i topi.
3. Un topo ingentilita che è pronto per il test non resisteranno si terrà la spugna per diversi minuti consecutivi, ma potrebbe essere necessario ri-avvolgere il topo 1 o 2 volte durante la prova di entrambe le zampe posteriori.

PROCEDURE DI COLLAUDO PER DORSALE B. VON FREY TEST

1. Tirare un dado per determinare quale arto posteriore di iniziare a provare per primo. Anche i numeri rappresentano la zampa destra e numeri dispari rappresentano la sinistra.
2. Liberamente avvolgere il topo la spugna lasciando esposti i quarti posteriori.
3. Stimolo tattile viene applicata solo dopo che il ratto è calmo e tranquillo per almeno 10 secondi.
4. Partendo con il VFH 4,56, applicare il monofilamento perpendicolarmente alla superficie dorsale tra il primo metatarso e seconda circa 1 cm prossimale alla giunzione (Figura 1C). Applicare il monofilamento in un liscio, steAdy modo in un intervallo di un secondo, finché si piega poi rimuoverlo. Questo tocco unico costituisce una prova.
5. Una risposta positiva si verifica quando il topo si muove rapidamente la zampa lontano dallo stimolo. La direzione di movimento è spesso posteriore o esterna prima dell'arto posteriore è flesso. Il recesso deve essere avviata dal tempo viene rimosso il monofilo per confermare che la risposta è associato all'applicazione monofilamento.
6. Applicare il monofilamento 4,56 due volte con almeno 30 secondi tra le applicazioni al fine di prevenire sensoriale "windup" e per permettere ai recettori sensoriali di tornare alla linea di base prima di sparare rianalisi (per prevenire l'adattamento).
7. Un test di stimolo devono essere fornite, se le polizze VFH e sfiora delicatamente la pelle, rendendola più forza la consegna di un pennello o una scansione piuttosto che un contatto a punta.
8. Se ci sono meno di 2 (cioè 1 o 0) risposte positive alla monofilo 4,56, il VFH immediatamente superiore viene applicata 3volte nello stesso modo.
9. In questo modo, VFHs progressivamente crescenti da 4,56 5,88 attraverso vengono applicate fino a due o più risposte positive verificarsi o fino a quando la maggior VFH viene raggiunto.
10. La soglia di ritiro zampa è il più basso VFH che suscita almeno 2 risposte positive su 3 prove.
11. Ripetere l'altra zampa.
12. Una sessione di test di solito può essere completato in 15 minuti per entrambe le zampe posteriori.

3. Risultati rappresentativi

Un test positivo si tradurrà in immediato, il ritiro vivace della zampa posteriore ad un VFH perpendicolarmente applicato al mid-plantare regione (Figura 1A) o la superficie dorsale tra il 1 ^° e 2 ^° metatarso 1 cm dal giunto (Figura 1C) . Queste risposte vengono conteggiati per ricavare la soglia tattile per ogni zampa posteriore. Soglie tattili da dorsali test VFH in acuta SCI ha dimostrato fedeltà eccellente con plantari soglie VFH derivanod a volte croniche (Figura 2). La diminuzione delle soglie tattili derivanti da prove plantare o dorsale verificarsi per graduata SCI (Figura 3 ^3,5). Questa ipersensibilità si manifesta già 7 giorni dopo SCI e viene mantenuta per tutta la durata dell'esperimento ^3-4,6. Mentre una serie di rigori SCI non influiscono soglie sensoriali tattili della zampa, in calo soglie verificarsi per più grave SCI (Figura 3). È importante, lo sviluppo di sotto-livello allodinia è una risposta di tutto o niente che si verifica quando vi è una perdita di oltre il 60% della materia bianca all'epicentro lesione. (4 Figura ^3).

Soglie tattili possono decomporsi e produrre risposte artificiali alle forze VFH bassi. Almeno due condizioni possono produrre decadimento soglia - rapida applicazione della VFH alla pelle in un modo o frugando jabbing o non aspettare abbastanza a lungo tra le applicazioni di stimolo. Per essere certi chele soglie tattili sono genuini, bisogna fare attenzione ad applicare ogni VFH utilizzando un approccio simile a bassa velocità e l'intervallo interstimulus deve essere di almeno 30 sec. Abbiamo anche dimostrato che mangiare comportamento riduce il decadimento soglia del ^5.

Figura 1. Schema e fotografia che ritrae la posizione di stimolazione VFH per il plantare e dorsale capelli von Frey (VFH) test. A) Per il test VFH plantare, il pelo Von Frey dovrebbe essere applicata perpendicolarmente alla metà-plantare zampa posteriore circa 1 cm posteriormente alla falange centrale (come indicato dal riquadro rosso nel diagramma della superficie plantare della zampa posteriore) ad una velocità lenta velocità costante fino a quando si piega. B e C) Per la tecnica VFH dorsale, il ratto è liberamente avvolto in un telo chirurgico, come mostrato nella fotografia. Il VFH viene applicato alla superficie dorsale della zampa in approximatel tra il primo e il secondo metatarsoy 1 centimetro prossimale al giunto.

Figura 2. Dorsali von soglie capelli Frey sensoriali sono correlati alla norma VFH plantare. (N-44; Coefficiente di Pearson = 0,503, p <0.01, r2 = 0,67). Le linee tratteggiate mostrano la soglia limite per la sensazione allodinia utilizzando il VFH dorsale o le tecniche VFH plantari e indicano che le soglie allodinia a 7 giorni dopo SCI utilizzando il test dorsale VFH prevedere cronica di sotto-livello di allodinia determinata con metodi VFH plantari.

Figura 3. Prime dorsali von soglie capelli Frey sensoriali prevedere allodinia e non allodinia sensibilità tattile tra gravità delle lesioni in punti temporali successivi. Paragonabili soglie sensoriali si è verificato tra 7 giorni successivi VFH dorsale SCI e 28 giorni post-misure VFH SCI plantari. Notevole somiglianza si è verificato per un vasta gamma di SCI, con allodinia significativo osservato in moderata a grave SCI (p <0,05 vs 1,1 mm Cilindrata tutti gli altri gruppi).

Figura 4. Percentuale di ratti trattati con laminectomia (no SCI) e gruppi che mostrano SCI zampa posteriore allodinia a 6 settimane dopo la SCI. Allodinia è stato visto solo in ratti con moderata o grave SCI (OSU ESCID dispositivo 0.9, 1.1, 1.25, 1.3 spostamenti del cavo mm), mentre i ratti con lieve SCI (0,3, 0,5, 0,7 mm spostamenti del midollo spinale) esposti normali risposte alla stimolazione tattile. Rappresentative sezioni coronali midollo spinale colorate per la mielina all'epicentro lesione per laminectomia (controllo illeso), lieve (0,5 mm di spostamento), moderati (1,1 mm di spostamento) e grave (1,3 mm di spostamento), contusioni del midollo spinale sono inclusi per mostrare il grado di assonale risparmiando associato a questa ipersensibilità. (Bar Scala = 0,5 mm).

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Figura 5. Una scheda dei dati di esempio per up-down capelli testing von Frey. Il valore capelli e il risultato (positivo o negativo) sono registrate per ogni prova. Indicazioni di consapevolezza sopraspinale dei test sono noti. Alla fine del test, le risposte ad ogni valore di capelli sono conteggiati. Il valore di soglia selezionato per i dati di esempio è cerchiata.

Discussion

I metodi di prova VFH qui presentati rappresentano due paradigmi di test che sono sensibili e valida per l'utilizzo in modelli di ratto SCI. È importante sottolineare che il test dorsale VFH è stato creato per la valutazione del recupero della sensazione tattile delle zampe posteriori acutamente seguenti mediotoracico SCI quando i ratti sono in grado di reggersi sulle proprie posteriori. Questo paradigma di test può essere utilizzato anche quando i ratti riacquistare la capacità di sostenere il loro peso e per gli arti posteriori dopo cervicale SCI.

I due paradigmi dimostrato qui utilizzare VFH tarato per determinare la soglia tattile di ogni zampa posteriore. Altri metodi determinare la frequenza di recesso sia ad uno stimolo normalmente innocue o nocive in genere. Abbiamo precedentemente dimostrato che piccoli miglioramenti soglie tattili possono rappresentare la differenza tra la presenza di dolore neuropatico cronico e normale sensazione tattile. Quindi utilizzando metodi di test sperimentali che derivano dolore soglie possono facilitate traduzione di eventuali interventi terapeutici per la clinica.

Come con tutti i test comportamentale, è indispensabile ridurre al minimo il numero di confondenti all'interno dell'ambiente di test che possono influenzare l'esito della prova comportamentale ^9. Pertanto, è importante che ogni sessione di test si verifica al momento stesso del giorno, nella stessa temperatura ambiente ed umidità controllata. Inoltre, poiché ratti comunicare vocalmente in un intervallo di ultrasuoni, è importante che i ratti attesa di essere testati sono tenuti in una camera separata fino al loro inizio test. Langford et al ¹⁰ hanno mostrato evidenza drammatica che gli animali naïve provare dolore dopo aver assistito ad uno cagemate esposto a stimoli nocivi. Per ridurre ulteriormente la variabilità in test sensoriali tattili, ci avvaliamo di cereali zuccherata come un distrattore cognitive durante il test VFH plantare. Così facendo, si stabilizzare le risposte dell'animale. La soglia è meno probabile che decadere tuttatest quando un distrattore viene fornito rispetto a quando non è ^5. Questa stabilizzazione è probabilmente dovuto al rinvenimento di comportamenti e di ipervigilanza catastrophizing, due stati anticipatori in cui la minaccia del dolore attiva paura e centri emotivi del cervello.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store