Summary
Descrevemos dois métodos táteis testes sensoriais para períodos agudos ou crônicos de lesão medular em ratos. Estes procedimentos validados pode detectar o desenvolvimento e manutenção da alodinia-like sensações.
Abstract
Lesão da medula espinal (SCI) prejudica os sistemas sensoriais causando alodinia 1-8. Para identificar as causas celulares e moleculares da alodinia, sensíveis e testes sensoriais válido em modelos de ratos SCI é necessário. No entanto, até recentemente, nenhuma abordagem de teste único foi validado para a SCI de modo que os métodos padronizados não foram implementadas em laboratórios. Além disso, métodos de teste disponíveis não poderiam ser implementadas de forma aguda ou grave do motor quando existiam deficiências, impedindo estudos sobre o desenvolvimento do SCI-induzida alodinia 3. Aqui nós apresentamos dois métodos de ensaio sensoriais através von Frey cabelo (VFH) monofilamentos que quantificam mudanças táteis limiares sensoriais após SCI 4-5. Um teste é o bem estabelecida teste Up-Down que demonstra alta sensibilidade e especificidade em diferentes gravidades do SCI, quando testado cronicamente 5. O outro teste é um teste recentemente desenvolvido VFH dorsal que pode ser aplicada de forma aguda após SCI quando umllodynia desenvolve, antes da recuperação motora 4-5. Cada monofilamento VFH aplica uma força calibrado quando tocado para a pele da pata traseira até se dobra. No método de cima para baixo, VFHs alternadas de forças superiores ou inferiores são usados no dermátomo L5 plantar para delinear limiares de retirada flexores. Sucessivamente mais elevadas forças são aplicadas até retirada ocorre em seguida, VFHs menor força é usado até retirada cessa. O limiar táctil reflecte a força necessária para eliciar retirada em 50% dos estímulos. Para o teste de novo, cada VFH é aplicado ao dermátomo dorsal L5 da pata do rato, enquanto é suportado pelo avaliador. A estimulação VFH ocorre em ordem crescente de vigor até pelo menos 2 dos 3 aplicações de uma determinada força produz a retirada da pata. Limiar sensorial táctil é a força mais baixa para eliciar% retirada 66 do tempo. Procedimentos de testes de aclimatação, e pontuação são descritos. Ensaios aberrantes que exigem um reteste ensaios e típicos são definidos. Uso de Animais waprovado pela Ohio State University Animal Care e do Comitê uso.
Protocol
1. Cima / Baixo Plantar Von Frey Testes
A finalidade do ensaio consiste em determinar a sensibilidade táctil medindo a força muito é necessária para eliciar retirada da pata do estímulo. Comercialmente disponíveis calibrados Von Frey monofilamentos do cabelo entre as gamas de 4,56 e 6,10 são usados para estimular a pata. Outros estímulos sensoriais como a visualização do estímulo ou propriocepção pode confundir as medidas de limiar tátil para respostas baseadas em input visual ou proprioceptiva são inválidos. Para evitar que a visualização do monofilamento contacto com a pele, nós testamos apenas enquanto o rato é comer cereal. Este distracter cognitiva, também assegura que todos os ratos são testados em níveis basais semelhantes de conforto. Para evitar respostas devido a proprioceptiva, em vez de entrada tátil, que não incluem ensaios em que o monofilamento levanta ou movimenta a pata.
PROCEDIMENTOS PARA A aclimatação A. ABORDAGEM UP-DOWN
- Presente fruto Cereal na gaiola para ratos reconhecer e buscar a recompensa do alimento. Os ratos não precisam de ser privados de alimentos, em qualquer ponto do processo gentling ou ensaios.
- Os ratos são pronta para ser aclimatados ao ambiente de teste e os procedimentos uma vez que comem de cereais na gaiola de origem. Aclimatação ocorre ao longo de pelo menos 4 sessões de 10 minutos cada um, mas mais podem ser necessários. Dez sessões minutos são utilizados de modo a que os ratos não se tornam saciados antes do fim da sessão.
- Colocar o rato na câmara de ensaio com três pedaços de cereal fruta. Fornecer cereais adicional 1-2 em um momento como eles são consumidos. Na terceira sessão, enquanto o rato está comendo, produzir movimentos da mão sob o piso de arame para que o rato se acostuma ao movimento abaixo da sua pata. Na quarta sessão, aplicar o monofilamento 5,18 para a superfície plantar da pata aproximadamente uma vez por minuto para um total de dez apresentações. Um rato ingênuo não deve responder a esse estímulo limiar sub.
- Altoy os pedaços de cereais consumidos, freqüência de micção e defecação, congelamento e comportamentos da preparação. Comportamento de congelamento ocorre em duas formas: a) o rato é crouched baixo para o chão geralmente perto da parede traseira ou virada para fora a partir do examinador e permanece imóvel, b) o rato é encurvado no meio da gaiola e, geralmente, vibra seus dentes . Comportamentos de congelamento pode continuar por longos períodos de tempo.
- Um rato acariciados que está pronto para o teste vai comer quase continuamente durante 10 minutos. Ele vai mover-se facilmente na gaiola e procure cereais muito rapidamente depois de consumir o passado. É importante ressaltar que o rato não vai parar de comer ou se distraia com movimentos das mãos sob o chão de arame ou aplicação de monofilamento para a pata.
PROCEDIMENTOS DE ENSAIO PARA A ABORDAGEM B. UP-DOWN
- Ratos produzem vocalizações de socorro que estão acima de nossa gama humana aural. Ratos à espera de serem testados devem ser mantidos em uma sala separada, para que eles não podem ouvir estas vocalizations.
- Ratos com lesão da medula espinhal que são apropriadas para cima e para baixo von Frey testes de cabelo devem demonstrar a sustentação de peso com os membros. Membros que são incapazes de suportar o rato não pode ser fiavelmente testado porque a aplicação de monofilamentos move da pata antes de as curvas de cabelo.
- Coloque um rato na câmara de ensaio com 2 ou 3 partes de cereais. Ratos deve estar comendo durante cada aplicação VFH.
- Rolar um dado para determinar que a HL para começar a testar em primeiro lugar. Mesmo números representam a pata direita e números ímpares representam a esquerda.
- Comece a sessão de testes com o monofilamento 5,18. Respostas retirada pode ocorrer 4,56-6,10 em ratos normais e SCI e do monofilamento 5,18 cai no meio da gama.
- Não aplique o monofilamento, enquanto um rato congela, se agacha ou não comer. Se o testador espera, às vezes essas condições será resolvida e os testes podem continuar. Se o rato exibe esses comportamentos e seu tempo total no aplicativoAratus é de 20 minutos, parar o teste reteste e desde o início no dia seguinte. Não retire o rato enquanto ele está exibindo esses comportamentos, pois isso pode aumentar a sua ocorrência. Aguarde até que o rato foge desses padrões antes de manuseá-lo para evitar o reforço destes comportamentos.
- Tocar o monofilamento com o dermátomo L5 plantar da pata posterior entre as almofadas de pé até dobra (ver Figura 1A). Esta aplicação suave e estável deve levar cerca de um segundo e depois removê-lo da pele. Evitar tocar qualquer parte dos pés de apoio como a sensibilidade da pele é muito mais baixa nestas áreas. Este toque único constitui um julgamento.
- Uma resposta positiva ocorre quando o rato retirar a pata rapidamente até longe do monofilamento. A retirada deve ser iniciado pelo tempo que o monofilamento é removido, a fim de confirmar que a resposta está associado com a aplicação de monofilamento.
- Assista ao animal para outra evidência de consciência da motoque nofilament como vocalização, olhando para baixo, para trás ou na pata testado, lambendo a pata, retirada da pata sustentada ou espasmos das orelhas. Nota-los na folha de dados. Quando estes comportamentos ocorrem com a retirada da pata, serve como evidência de percepção supraespinal do estímulo.
- Se houver uma resposta positiva, aplicar o monofilamento mais baixo seguinte. Se não houver nenhuma resposta (negativo), mover-se para o monofilamento superior seguinte. Permitir que 30 segundos entre cada aplicação monofilamento para os receptores sensoriais para voltar ao disparo de linha de base antes de testar novamente (para evitar a adaptação).
- Continue aplicando monofilamentos superior ou inferior para a pata traseira com base nas respostas positivas ou negativas até que você tenha 10 tentativas. Em seguida, repita na outra pata traseira. (Ver ficha exemplo).
- A maior VFH que pode ser testado sem a introdução de input proprioceptivo e levantando a pata é 6,10. O 6.45VFH e maiores não deve ser utilizado porque a pata levanta antes do monofilament curvas. Se não houver nenhuma resposta a 6,10, em seguida, o ensaio seguinte irá aplicar o 6,10 novamente.
- A resposta deve ser anulada eo julgamento deve ser re-testado se um dos seguintes ocorre durante a aplicação do estímulo ou retirada da pata:
- O rato não é continuamente comer.
- O rato se afasta do estímulo VFH antes da dobragem do monofilamento, tornando-se impossível saber a força aplicada que provoca a resposta de retirada.
- A pata é levantada pela VFH (ou antes ou depois da VFH é dobrado) proporcionando proprioceptiva além de estímulos tácteis.
- A sessão de testes geralmente pode ser concluído em menos de 15 minutos para ambos os membros posteriores.
C. PROCESSAMENTO DE DADOS PARA A ABORDAGEM UP-DOWN
- Um teste bem sucedido terá 10 ensaios sequenciais para cada pata.
- O valor do limiar táctil é o mais baixo monofilamentos que produz retirada da pata no & ge, 50% das apresentações e 3 ou mais apresentações do monofilamento que ser dado (ver ficha exemplo, os limiares são circulado).
- Um monofilamento com apenas 2 ensaios totais não é selecionado como o limite, mesmo quando um ensaio é positivo e um negativo. Várias apresentações do estímulo são melhores indicadores do padrão de respostas a essa força.
- Se não houver nenhuma monofilamentos que produz respostas positivas em pelo menos 50% dos testes, o rato é dada uma pontuação de 6,45. Isto significa que o rato não detectar a maior monofilamento testável de 6,10 além acaso. Um valor de 6,45 é dada porque representa o valor mais alto do que a faixa testável de monofilamentos.
- Converter o valor limite para as patas direita e esquerda em vigor grama. Os valores de força de grama será fornecida pelo fornecedor dos cabelos de von Frey. . Para os dados a partir de lesões bilaterais, a força grama limiar para as duas patas podem ser calculadas em conjunto para produzirum único escore.
2. Dorsal Von Frey Testes
O objectivo deste ensaio consiste em determinar a sensibilidade táctil em ratos com controlo do motor, tais pobre que eles não podem ser testados utilizando os métodos típicos de VFH plantares. Ele quantifica a quantidade de força de toque é necessário para produzir uma resposta aversiva. Para evitar respostas a estímulos proprioceptivos, que não incluem ensaios em que a pata é movido pelo VFH durante a aplicação. Além disso, não inclui os ensaios em que o VFH desliza ou é escovada através da superfície dorsal do pé.
PROCEDIMENTOS PARA DORSAL aclimatação A. VON FREY TESTE
- Ratos delicados para quatro sessões de 10 minutos cada, antes do teste basal e lesão medular.
- Frouxamente embrulhar o rato em uma toalha pequena de modo que os quartos traseiros são expostos como mostrado abaixo (Figura 1B). Posicionar o rato sobre uma mesa com as patas posteriores levemente repousando sobre a superfície. Utilizam a mesmaconfortável, mas não enrole e segure firme para cada rato. Apoiando o seu antebraço na ponta da mesa pode reduzir a variabilidade entre ratos.
- Um rato suavizado que está pronto para o teste não vai resistir a ser realizada na toalha por vários minutos consecutivos, porém você pode ter que re-enrole o rato 1 ou 2 vezes durante o teste de duas patas traseiras.
PROCEDIMENTOS DE ENSAIO PARA B. DORSAL VON FREY TESTE
- Role um dado para determinar qual dos membros pélvicos para começar a testar em primeiro lugar. Mesmo números representam a pata direita e números ímpares representam a esquerda.
- Frouxamente embrulhar o rato a toalha deixando os quartos traseiros expostas.
- Estímulo tátil é aplicado somente após o rato é calmo e tranquilo, pelo menos, 10 segundos.
- Começando com a VFH 4,56, aplicar o monofilamento perpendicularmente à superfície dorsal entre o metatarso primeira e segunda cerca de 1 cm proximal ao conjunto (Figura 1C). Aplicar o monofilamento de uma ste, lisoady forma ao longo de um intervalo de um segundo até que ele se curva, em seguida, removê-lo. Este toque único constitui um julgamento.
- Uma resposta positiva ocorre quando o rato se move rapidamente a pata longe do estímulo. A direção do movimento é muitas vezes posterior ou externa antes do membro posterior é flexionado. A retirada deve ser iniciado pelo tempo que o monofilamento é removido, a fim de confirmar que a resposta está associado com a aplicação de monofilamento.
- Aplicar o monofilamento 4,56 mais duas vezes com, pelo menos, 30 segundos entre as aplicações, a fim de evitar a "windup" sensorial e para permitir que os receptores sensoriais para voltar à linha de base antes de disparar reanálise (para evitar a adaptação).
- Um teste de estímulo deve ser reaplicados se os deslizamentos VFH e suavemente arranha a pele, tornando a entrega força mais de uma escova ou um varrimento ao invés de um contacto pontiagudo.
- Se houver menos do que 2 (ou seja, 1 ou 0) respostas positivas para o monofilamento 4,56, o VFH maior seguinte é aplicada 3vezes da mesma maneira.
- Desta forma, VFHs progressivamente maiores de 4,56 por meio de 5,88 são aplicadas até dois ou mais respostas positivas ocorrer, ou até que a maior VFH é atingido.
- O limiar de retirada da pata é o mais baixo VFH que provoca pelo menos 2 respostas positivas de 3 ensaios.
- Repita com a outra pata.
- Uma sessão de testes geralmente pode ser completada em 15 minutos para ambas as patas traseiras.
3. Os resultados representativos
Um teste bem sucedido resultará na retirada imediata e rápida da pata traseira para um VFH perpendicularmente à região centro-plantar (Figura 1A) ou a superfície dorsal entre o 1 º e 2 º metatarsos 1 cm da articulação (Figura 1C) . Estas respostas são computados para derivar limiar tátil para cada pata. Limiares táteis de dorsais testes VFH em SCI aguda mostrou excelente fidelidade com plantares limiares VFH derivard às vezes crónicas (Figura 2). Declínios nos limites táteis derivadas dos ensaios plantar ou dorsal ocorrer por SCI graduada (Figura 3 3,5). Esta hipersensibilidade manifesta mais cedo como 7 dias após a lesão medular e é mantida durante a duração da experiência 3-4,6. Enquanto uma gama de gravidades SCI não afectam tácteis limiares sensoriais da pata, em declínios limiares ocorrer por SCI mais grave (Figura 3). Importante, o desenvolvimento de alodinia abaixo do nível do-se uma resposta tudo ou nada que ocorre quando existe uma perda de mais de 60% da matéria branca no epicentro lesão. (Figura 4 3).
Limiares táteis pode decair e produzir respostas às forças artificiais VFH baixos. Pelo menos duas condições pode produzir decadência limiar - rapidamente aplicar o VFH para a pele de uma forma ou picando jabbing ou não esperando o tempo suficiente entre as aplicações de estímulo. Para ter certeza de queos limiares tácteis são genuínos, deve ser tomado cuidado para aplicar cada VFH utilizando uma abordagem semelhante velocidade baixa e do intervalo de interstimulus deve ser pelo menos 30 seg. Também mostramos que o comportamento alimentar reduz decadência limiar de 5.
Figura 1. Esquemática e fotografia representando o local de estimulação VFH para a plantar e dorsal von Frey cabelo teste (VFH). A) Para o ensaio VFH plantar, o von Frey cabelo deve ser aplicado perpendicularmente à pata posterior meados de plantar cerca de 1 cm posterior para a falange do meio (como indicado pela caixa vermelha no diagrama da superfície plantar da pata posterior a) com uma lenta velocidade constante até que ele se curva. B e C) Para a técnica VFH dorsal, o rato é livremente enrolado numa toalha cirúrgica, como mostrado na fotografia. O VFH é aplicada à superfície dorsal da pata entre o approximatel primeiro e segundo metatarsoy de 1 cm proximal ao conjunto.
Figura 2. Dorsais von limiares cabelo Frey sensoriais correlacionar a VFH plantar padrão. (N-44; coeficiente de Pearson = 0,503, p <0,01, r2 = 0,67). As linhas tracejadas mostram o limiar de corte para sensação antialodínicas usando VFH o dorsal ou as técnicas VFH plantares e indicam que os limiares analgésica antialodínica ao fim de 7 dias após a LM, utilizando o teste VFH dorsal prever alodinia abaixo do nível do-crónica determinada por métodos VFH plantares.
Figura 3. Primeiros dorsais von limiares cabelo Frey sensoriais prever antialodínicas e não antialodínicas sensibilidade tátil através gravidades lesões em momentos posteriores. Comparáveis limiares sensoriais ocorreram entre 7 dias VFH dorsal pós SCI e 28 dias pós-SCI medidas VFH plantares. Semelhança notável ocorreu por um ampla gama de SCI, com alodinia significativa observada em moderada a grave SCI (p <0,05 deslocamento 1,1 mm vs todos os outros grupos).
Figura 4. Porcentagem de ratos que receberam laminectomia (sem SCI) e grupos SCI mostrando pata alodinia em 6 semanas após a SCI. Alodinia foi visto apenas em ratos com moderada ou grave SCI (OSU dispositivo ESCID 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 mm deslocamentos da medula), enquanto que ratos com lesão medular leve (0,3, 0,5, 0,7 mm deslocamentos da medula espinhal) apresentaram respostas normais a estimulação tátil. Representante coronais seções da medula espinhal coradas para mielina no epicentro da lesão para laminectomia (controle não lesionado), leve (0,5 deslocamento mm), moderada (1,1 deslocamento mm) e grave (1,3 deslocamento mm) contusões medulares são incluídas para mostrar o grau de axonal poupando que está associado com esta hipersensibilidade. (Barra de escala = 0,5 mm).
Figura 5. Uma ficha de dados de amostra para cima e para baixo testes cabelo von Frey. O valor do cabelo e do resultado (positivo ou negativo) são registadas para cada ensaio. Indicações de consciência supra-espinhal do teste são observadas. No final do teste, as respostas em cada valor de cabelo são computados. O valor limite selecionado para os dados de exemplo está cercada.
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Discussion
Os métodos de ensaio VFH aqui apresentados representam dois paradigmas de teste que são sensíveis e válido para uso em modelos de ratos SCI. É importante ressaltar que o teste VFH dorsal foi criado para avaliação da recuperação da sensação tátil das patas traseiras de forma aguda após médio-torácico SCI quando ratos são incapazes de estar em seus quartos traseiros. Este paradigma de teste pode também ser utilizado quando os ratos recuperar a capacidade de suportar o seu peso e para os membros posteriores após cervical SCI.
Os dois paradigmas demonstrado aqui utilizar VFH calibrado para determinar o limiar táctil de cada pata posterior. Outros métodos determinar a freqüência de retirada, quer um estímulo normalmente inócuo ou nocivo normalmente. Já mostramos anteriormente que pequenas melhorias nos limiares táteis podem representar a diferença entre a presença de dor neuropática crônica e sensação tátil normal. Assim, utilizando métodos de teste experimentais que derivam dor limiares podem falitar tradução de potenciais intervenções terapêuticas para a clínica.
Tal como acontece com todos os testes comportamentais, é imperativo para minimizar o número de variáveis de confusão no interior do ambiente de teste que podem afectar o resultado do teste comportamental 9. Assim, é importante que cada sessão de teste ocorre ao mesmo tempo do dia, na mesma temperatura e humidade controlada sala. Além disso, uma vez que os ratos comunicar vocalmente em uma gama de ultra-sons, é importante que os ratos de espera a serem testados são mantidos numa sala separada até à sua início do ensaio. Langford et al 10 mostraram uma dramática evidência de que os animais ingênuos sentir dor depois de testemunhar um cagemate expostos à estimulação nociceptiva. Para continuar a reduzir a variabilidade no teste sensorial tátil, nós utilizamos cereal açucarado como uma distração cognitiva durante o teste VFH plantar. Ao fazê-lo, nós estabilizar as respostas do animal. O limiar é menos provável para se decomporem em todatestando quando um aparelho distractor é fornecida do que quando não é um 5. Essa estabilização é provavelmente devido ao excesso com têmpera de comportamentos e catastrofização, dois estados antecipados, onde a ameaça de dor medo e ativa centros emocionais do cérebro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
NIH NS43798 (DMB), F31 NS058138 NIH (MRD); P30-NS045758 (CBSCR), e os Veteranos Paralisados da América # 2451 (DMB) e # 2707 (MRD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Semmes-Weinstein Monofilaments | Stoelting Co. | 58011 | |
| Fish Breeder Box | Any Supplier | Hole drilled in side for cereal delivery | |
| Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid) | Hardware Store | ||
| Elastic to hold fish breeder box in place | Any Supplier | ||
| Sugared Cereal | Grocery Store | ||
| Surgical Huck Towel 16"x 23" | Medical Supply Store | ||
References
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