Summary
Se describen dos métodos de pruebas sensoriales táctiles para los períodos agudos o crónicos de la lesión de la médula espinal en ratas. Estos procedimientos validados puede detectar el desarrollo y mantenimiento de la alodinia-como sensaciones.
Abstract
Lesión de la médula espinal (SCI) altera los sistemas sensoriales que causan la alodinia 1-8. Para identificar las causas celulares y moleculares de la alodinia, sensibles y pruebas válidas sensorial en ratas modelos SCI es necesario. Sin embargo, hasta hace poco, no hay un solo enfoque de las pruebas han sido validadas para SCI para que los métodos estandarizados no se han aplicado a través de los laboratorios. Además, los métodos de ensayo disponibles no pudo ser implementado de forma aguda o severa cuando existía motrices, la prevención de los estudios sobre el desarrollo de la lesión medular inducida por la alodinia 3. Aquí se presentan dos métodos de prueba validados sensoriales usando von Frey pelo (VFH) monofilamentos que cuantifican los cambios en los umbrales sensoriales táctiles 4-5 después de la lesión. Una de las pruebas es el bien establecida arriba-abajo de prueba que demuestra una alta sensibilidad y especificidad en los distintos niveles de gravedad SCI en las pruebas crónica 5. La otra prueba es una prueba recientemente desarrollada VFH dorsal que puede ser aplicado después de SCI aguda cuando unllodynia desarrolla, antes de la recuperación del motor 4-5. Cada monofilamento VFH se aplica una fuerza calibrada cuando se toca a la piel de la pata trasera hasta que se dobla. En el método de arriba-abajo, VFHs alternancia de las fuerzas superiores o inferiores se utilizan en el dermatoma L5 plantar para delimitar los umbrales de los flexores de abstinencia. Fuerzas cada vez más elevados se aplican hasta que la retirada se produce luego baje VFHs fuerza se usan hasta que la retirada se detiene. El umbral táctil refleja la fuerza requerida para provocar la retirada en el 50% de los estímulos. Para la prueba de nuevo, cada VFH se aplica a la dermatoma dorsal L5 de la pata, mientras que la rata es apoyada por el examinador. La estimulación se produce VFH en orden ascendente de la fuerza hasta por lo menos 2 de 3 aplicaciones a la fuerza dada produce retirada de la pata. Umbral sensorial táctil es la menor fuerza para provocar la retirada 66% del tiempo. Los procedimientos de aclimatación, de pruebas y calificación se describen. Juicios aberrantes que requieren un retest ensayos y típicos se definen. El uso de animales waprobado por el Cuidado de Animales de Ohio State University y el empleo.
Protocol
1. Arriba / Abajo plantar Von Frey Pruebas
El propósito del ensayo es determinar la sensibilidad táctil mediante la medición de cómo la fuerza se requiere mucho para obtener retirada de la pata del estímulo. Comercialmente disponibles calibrados Von monofilamentos cabello Frey entre los rangos de 4,56 y 6,10 se utilizan para estimular la pata. Otra entrada sensorial como la visualización del estímulo o la propiocepción puede confundir medidas táctiles umbral de lo que las respuestas basadas en la información visual o propioceptiva no son válidos. Para evitar la visualización del monofilamento de tocar la piel, ponemos a prueba sólo cuando la rata está comiendo cereales. Este elemento de distracción cognitiva, también se asegura de que todas las ratas se ponen a prueba en los niveles básicos similares de confort. Para evitar las respuestas debido a propioceptiva en lugar de la entrada táctil, que no incluyen los ensayos en los que el monofilamento levanta o se mueve la pata.
A. PROCEDIMIENTOS PARA EL ENFOQUE aclimatación ARRIBA-ABAJO
- Presente la fruta Cereal en la jaula para ratas reconocer y buscar la recompensa de comida. Las ratas no tienen que ser privadas de comida en cualquier punto del proceso de Amabilizar o ensayos.
- Las ratas están listos para ser aclimatado al entorno de pruebas y los procedimientos una vez que comer cereal de fruta en la jaula. Aclimatación se produce en al menos 4 sesiones de 10 minutos cada uno, pero más pueden ser necesarios. Diez sesiones de hora se utilizan para que las ratas no es saciado antes de la final de la sesión.
- Colocar la rata en la cámara de pruebas con tres piezas de fruta de cereales. Proporcionar cereales de fruta adicional de una a dos a un tiempo, ya que se comen. En la tercera sesión, mientras que la rata está comiendo, producen movimientos de la mano bajo el piso de alambre para que la rata se acostumbre al movimiento por debajo de su pata. En el cuarto período, aplicar el monofilamento 5,18 a la superficie plantar de la pata aproximadamente una vez por minuto para un total de diez presentaciones. Una rata inocente no debe responder a este estímulo umbral de sub.
- AltoY las piezas de cereal consumidos, la frecuencia de la micción y la defecación, la congelación, y las conductas de aseo personal. Comportamiento de congelación se produce de dos maneras: a) la rata se agachó al suelo generalmente cerca de la pared posterior o de espaldas a la examinador y permanece inmóvil, b) la rata se encorvado en el centro de la jaula y generalmente parlotea sus dientes . Comportamientos de congelación puede continuar durante largos períodos de tiempo.
- Una rata suavizó que está listo para la prueba se comen casi continuamente durante 10 minutos. Se mueven con facilidad en la jaula y buscar cereales frutos muy rápidamente después de consumir el último. Es importante destacar que la rata no dejar de comer o se distraiga con movimientos de la mano bajo el piso de alambre o monofilamento de aplicación a la pata.
B. PROCEDIMIENTOS DE VERIFICACIÓN PARA EL ENFOQUE DE ARRIBA-ABAJO
- Las ratas producen vocalizaciones de angustia que están por encima de nuestro rango auditivo humano. Ratas a la espera de ser probado se debe mantener en una habitación separada, de modo que no pueden escuchar estos COValizations.
- Las ratas con lesión de médula espinal que son apropiados para arriba-abajo las pruebas de von Frey pelo debe demostrar la carga de peso con las extremidades. Las ramas que no son capaces de apoyar a la rata no puede ser probado de forma fiable ya que la aplicación de monofilamentos mueve la pata antes de las curvas del pelo.
- Coloque una rata en la cámara de prueba con 2 o 3 piezas de fruta de cereales. Las ratas se debe comer durante cada aplicación VFH.
- Tira un dado para determinar qué HL para empezar a probar en primer lugar. Los números representan la pata derecha y los números impares representan la izquierda.
- Comienza la sesión de pruebas con el monofilamento 5.18. Respuestas de retirada puede producirse 4,56 a 6,10 en ratas normales y SCI y el monofilamento 5,18 cae en el centro de la gama.
- No aplique un monofilamento, mientras que una rata se congela, se agacha o no comer. Si el probador de espera, a veces, estas condiciones se resolverá y se pueda reanudar la prueba. Si la rata muestra estos comportamientos y el tiempo total en la aplicaciónArato se encuentra a 20 minutos, detenga la prueba y vuelva a probar desde el principio al día siguiente. No retire la rata mientras está mostrando estas conductas ya que puede aumentar su incidencia. Espere hasta que la rata se escapa de estos patrones antes de manipularla para evitar reforzar estas conductas.
- Toque el monofilamento para el dermatoma L5 plantar de la pata posterior entre las almohadillas de las patas hasta que se dobla (ver Figura 1A). Esta aplicación firme y pareja debe tomar alrededor de un segundo y luego retírela de la piel. Evite tocar cualquier parte de las almohadillas de las patas como la sensibilidad de la piel es mucho menor en estas áreas. Esto solo toque constituye un ensayo.
- Una respuesta positiva se produce cuando la rata rápidamente levanta la pata hasta lejos del monofilamento. La retirada debe ser iniciado por el momento de la retirada del monofilamento con el fin de confirmar que la respuesta se asocia con la aplicación de monofilamento.
- Mira al animal para otras pruebas de conocimiento de la monofilament táctil como la vocalización, mirando hacia abajo, hacia atrás o en la Pata de la prueba, lamiendo la pata, retirada de la pata sostenida o contracciones nerviosas de las orejas. Tenga en cuenta que en la hoja de datos. Cuando estos comportamientos se producen con la retirada de la pata que sirve como evidencia de la percepción supraespinal del estímulo.
- Si hay una respuesta positiva, aplicar el monofilamento más baja siguiente. Si no hay respuesta (negativo), se mueven hasta el monofilamento superior siguiente. Espere 30 segundos entre cada aplicación de monofilamento para los receptores sensoriales para volver a la leña de referencia antes de volver (para evitar la adaptación).
- Continuar la aplicación de monofilamentos de mayor o menor a la pata trasera sobre la base de las respuestas positivas o negativas, hasta que tenga 10 ensayos. A continuación, repita en la otra pata trasera. (Ver hoja de datos ejemplo).
- La mayor VFH que se puede probar sin la introducción de la información propioceptiva y levantando la pata es de 6,10. El 6.45VFH y más grande no debe ser utilizado porque la pata levanta antes de la Monofcurvas ilament. Si no hay respuesta a 6,10 entonces el siguiente ensayo se aplicará el 6,10 de nuevo.
- La respuesta debe ser anulada y el juicio se debe volver a probar si uno de los siguientes síntomas durante la aplicación del estímulo o de retirada de la pata:
- La rata no está continuamente comer.
- La rata se aleja del estímulo VFH antes de la flexión del monofilamento, lo que hace imposible saber la fuerza aplicada que provoca la respuesta de retirada.
- La pata es levantada por el VFH (ya sea antes o después de la VFH está doblada) proporcionar propioceptiva además de la estimulación táctil.
- Una sesión de pruebas por lo general se puede completar en menos de 15 minutos para las dos patas traseras.
C. PROCESAMIENTO DE DATOS PARA EL ENFOQUE DE ARRIBA-ABAJO
- Una prueba con éxito tendrá 10 pruebas consecutivas por cada pata.
- El valor del umbral táctil es el más bajo de monofilamento que produce en la retirada de la pata y ge, el 50% de las presentaciones y 3 o más presentaciones del monofilamento tendrá que prestar (ver hoja de datos ejemplo, los umbrales son un círculo).
- Un monofilamento con sólo 2 ensayos totales no se selecciona como el umbral aún cuando un ensayo es positivo y uno es negativo. Varias presentaciones del estímulo son mejores indicadores de la pauta de las respuestas a esa fuerza.
- Si no hay monofilamento que produce respuestas positivas en al menos 50% de las pruebas, la rata se le da una puntuación de 6,45. Esto significa que la rata no se detectó la mayor monofilamento de 6.10 comprobable más allá de la casualidad. Un valor de 6,45 se da porque representa el siguiente valor más alto de la gama de monofilamentos comprobable.
- Convertir el valor umbral para las patas izquierda y derecha en vigor gramo. Los valores de fuerza gramo será suministrado por el proveedor de los filamentos de von Frey. . Para los datos de lesiones bilaterales, la fuerza g umbral de las dos patas se pueden promediar en conjunto para produciruna sola puntuación.
2. Dorsal de Von Frey Pruebas
El propósito de este ensayo es determinar la sensibilidad táctil de las ratas con el control del motor como pobres que no pueden ser probados utilizando los métodos típicos plantares VFH. Se cuantifica la cantidad de fuerza de contacto es necesario para producir una respuesta aversiva. Para evitar las respuestas a los estímulos propioceptivos, que no incluyen ensayos en los cuales se mueve la pata por la VFH durante la aplicación. Además, no se incluyen los ensayos en los que el VFH se desliza o se cepilla a través de la superficie dorsal del pie.
A. PROCEDIMIENTOS PARA EL DORSAL DE PRUEBAS aclimatación Von Frey
- Ratas suaves para cuatro sesiones de 10 minutos cada uno antes de la prueba de referencia y las lesiones de la médula espinal.
- Sin apretar envolver la rata en una toalla pequeña por lo que los cuartos traseros se exponen como se muestra a continuación (Figura 1B). Coloque la rata sobre una mesa con las patas traseras ligeramente descansando sobre la superficie. Utilice el mismoajustado, pero no abrigo apretado y mantener para cada rata. Apoyando su antebrazo en el borde de la mesa puede reducir la variabilidad entre las ratas.
- Una rata acariciadas que está listo para la prueba no se resisten a ser celebrada en la toalla durante varios minutos consecutivos, sin embargo es posible que tenga que volver a ajustar la rata 1 o 2 veces durante la prueba de las dos patas traseras.
B. PROCEDIMIENTOS DE VERIFICACIÓN PARA LAS PRUEBAS DE DORSAL Von Frey
- Tira un dado para determinar qué miembros traseros para empezar a probar en primer lugar. Los números representan la pata derecha y los números impares representan la izquierda.
- Envuelva sin apretar la rata en la toalla dejando expuestos los cuartos traseros.
- Estímulo táctil sólo se aplica después de la rata es de calma y tranquilidad por lo menos durante 10 segundos.
- Comenzando con el VFH 4,56, aplicar el monofilamento perpendicularmente a la superficie dorsal entre el primer metatarso y segundo aproximadamente 1 cm proximal a la articulación (Figura 1C). Aplicar el monofilamento en un ste liso,Ady forma en un intervalo de un segundo hasta que se dobla y luego retírela. Esto solo toque constituye un ensayo.
- Una respuesta positiva se produce cuando la rata se mueve rápidamente la pata lejos del estímulo. La dirección del movimiento es a menudo posterior o externa antes de la extremidad posterior está flexionada. La retirada debe ser iniciado por el momento de la retirada del monofilamento con el fin de confirmar que la respuesta se asocia con la aplicación de monofilamento.
- Aplicar el monofilamento 4.56 dos veces más con al menos 30 segundos entre las aplicaciones con el fin de prevenir sensorial "cuerda" y permitir que los receptores sensoriales de volver a los valores basales de cocción antes de volver (para evitar la adaptación).
- Una prueba de estímulo debe volver a aplicar, si se desliza VFH y suavemente roza la piel, haciendo que la entrega de fuerza de más de una brocha o un barrido en lugar de un contacto en punta.
- Si hay menos de 2 (es decir, 1 o 0) respuestas positivas a la monofilamento de 4,56, el siguiente mayor VFH se aplica 3veces en la misma manera.
- De esta manera, VFHs progresivamente mayores de 4,56 a través de 5,88 se aplican hasta que dos o más respuestas positivas se producen o hasta que la mayor VFH se alcanza.
- El umbral de retirada de la pata es el más bajo VFH que provoca por lo menos 2 respuestas positivas de 3 intentos.
- Repita con la otra pata.
- Una sesión de pruebas por lo general se puede completar en 15 minutos para las dos patas traseras.
3. Los resultados representativos
Una prueba con éxito dará lugar a la retirada inmediata, a paso ligero de la pata trasera a una VFH perpendicularmente aplica a la región a mediados de plantar (Figura 1A) o la superficie dorsal entre el 1 º y 2 º metatarsiano de 1 cm de la articulación (Figura 1C) . Estas respuestas se cuentan para obtener el umbral táctil para cada pata trasera. Umbrales táctiles de dorsales en las pruebas de VFH lesión medular aguda mostraron una excelente fidelidad con plantares umbrales VFH derivand a veces crónicos (Figura 2). La disminución de los umbrales táctiles derivados de las pruebas plantar o dorsal ocurrir por graduado SCI (Figura 3 3,5). Esta hipersensibilidad se manifiesta tan pronto como sea 7 días después de SCI y se mantiene durante la duración del experimento 3-4,6. Mientras que una amplia gama de niveles de gravedad SCI no afectan a los umbrales sensoriales táctiles de la pata, la disminución de los umbrales se producen durante más severa SCI (Figura 3). Es importante destacar que el desarrollo de alodinia por debajo de nivel es una respuesta de todo o nada que se produce cuando hay una pérdida de más de 60% de la materia blanca en el epicentro lesión. (Figura 4 3).
Umbrales táctiles pueden descomponerse y producir respuestas artificiales a las fuerzas de VFH bajos. Por lo menos dos condiciones puede producir deterioro del umbral - la rápida aplicación de la VFH a la piel de una manera o de meter golpeando o no esperar el tiempo suficiente entre las aplicaciones de estímulo. Para estar seguros de quelos umbrales táctiles son genuinos, se debe tener cuidado al aplicar cada VFH utilizando un método similar de baja velocidad y el intervalo inter debe ser al menos 30 segundos. También hemos demostrado que la conducta de comer reduce la caries umbral del 5.
Figura 1. Esquema y fotografía correspondiente a la ubicación de la estimulación VFH para el plantar y dorsal de pelo de von Frey (VFH) la prueba. A) Para las pruebas VFH plantar, el pelo de von Frey debe ser aplicada perpendicularmente a la pata trasera mediados de plantar aproximadamente 1 cm por detrás de la falange media (como se indica por el cuadro rojo en el diagrama de la superficie plantar de la pata trasera) en un lento velocidad constante hasta que se dobla. B y C) Para la técnica VFH dorsal, la rata está ligeramente envuelto en una toalla quirúrgica como se muestra en la fotografía. El VFH se aplica a la superficie dorsal de la pata entre el approximatel metatarsiano primero y segundoy 1 cm proximal a la articulación.
Figura 2. Dorsales de von Frey pelo umbrales sensoriales se correlacionan con VFH plantar estándar. (N-44, el coeficiente de Pearson = 0,503, p <0,01, r2 = 0,67). Las líneas punteadas muestran el umbral de corte para la sensación de alodinia utilizando el VFH dorsal o las técnicas VFH plantares e indican que los umbrales de alodínico a los 7 días después de la lesión mediante la prueba de VFH dorsal predecir crónica por debajo del nivel de la alodinia por métodos VFH plantares.
Figura 3. Los primeros dorsales de von Frey pelo umbrales sensoriales predecir la sensibilidad al tacto y no alodınico alodınico-a través de niveles de gravedad de lesiones en los puntos de tiempo posteriores. En comparación, los umbrales sensoriales ocurrió entre 7 días después de VFH dorsal SCI y 28 días posteriores medidas SCI plantares VFH. Similitud notable se produjo por un amplia gama de SCI, con alodinia significativa observada en el LIC de moderada a grave (p <0,05 mm de desplazamiento 1,1 vs todos los demás grupos).
Figura 4. Porcentaje de las ratas que recibieron una laminectomía (sin SCI) y los grupos de SCI muestran pata trasera alodinia a las 6 semanas después de la lesión. Alodinia sólo se observó en las ratas con moderados o graves SCI (OSU dispositivo ESCID 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 mm de desplazamiento de la médula), mientras que las ratas con insuficiencia renal leve (SCI 0,3, 0,5, 0,7 mm de desplazamiento de la médula espinal) mostraron respuesta normal a la estimulación táctil. Representante de las secciones coronales de la médula espinal teñidas por la mielina en el epicentro de la lesión de laminectomía (control sano), leve (0,5 mm de desplazamiento), moderados (1,1 mm de desplazamiento) y severa (1,3 mm de desplazamiento) contusiones de la médula espinal se incluyen para mostrar el grado de axonal preservación que está asociado con esta hipersensibilidad. (Barra de escala = 0,5 mm).
Figura 5. Una hoja de datos de ejemplo de arriba-abajo la prueba del pelo de von Frey. El valor del pelo y el resultado (positivo o negativo) se registran para cada ensayo. Indicaciones de la toma de conciencia supraespinal de las pruebas se observó. Al final de la prueba, las respuestas en cada valor de pelo son contados. El valor del umbral seleccionado para los datos de ejemplo es un círculo.
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Discussion
Los métodos de prueba VFH presentados aquí representan dos paradigmas experimentales, que son sensibles y válidos para su uso en modelos de rata SCI. Es importante destacar que el dorsal prueba de VFH fue creado para la evaluación de la recuperación de la sensación táctil de las patas traseras agudamente después de medio-torácico SCI cuando las ratas no son capaces de pararse sobre sus cuartos traseros. Este paradigma de la prueba también se puede utilizar cuando las ratas a recuperar la capacidad de soportar su peso y de las extremidades posteriores del cuello uterino después de SCI.
Los dos paradigmas se ha demostrado aquí utilizan VFH calibrado para determinar el umbral táctil de cada pata trasera. Otros métodos de determinar la frecuencia de retirada ya sea a un estímulo normalmente inocuo o nocivo normalmente. Hemos demostrado previamente que las pequeñas mejoras en los umbrales táctiles pueden representar la diferencia entre la presencia de dolor crónico neuropático y sensación táctil normal. Por lo tanto la utilización de los métodos experimentales de prueba que se derivan del dolor umbrales de mayo de FAcilitar la traducción de posibles intervenciones terapéuticas a la clínica.
Al igual que con todas las pruebas de comportamiento, es imprescindible para reducir al mínimo el número de factores de confusión en el entorno de pruebas que puedan afectar a los resultados de la prueba de comportamiento 9. Por lo tanto, es importante que cada sesión de evaluación se produce en la misma hora del día, en la misma temperatura y humedad controlada habitación. Además, puesto que las ratas comunicarse vocalmente en una gama de ultrasonidos, es importante que las ratas a la espera de ser probado se mantienen en una habitación separada hasta que su inicien las pruebas. Langford et al 10 demostraron una evidencia dramática de que los animales no tratados experimentan dolor después de presenciar un compañeros de jaula expuesta a estímulos nocivos. Para reducir aún más la variabilidad en las pruebas sensoriales táctiles, utilizamos cereal azucarado como un distractor durante las pruebas cognitivas VFH plantar. De este modo, se estabilizan las respuestas del animal. El umbral es menos probable que a lo largo de las cariesprueba cuando un distractor se proporciona que cuando uno no es de 5. Esta estabilización se debe probablemente a la moderación de los comportamientos hipervigilantes y catastrofismo, dos estados de previsión en que la amenaza del dolor se activa el miedo y los centros emocionales del cerebro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
NIH NS43798 (DMB), NIH F31 NS058138 (MRD), P30-NS045758 (CBSCR), y los Veteranos Paralíticos de América # 2451 (DMB) y # 2707 (MRD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Semmes-Weinstein Monofilaments | Stoelting Co. | 58011 | |
| Fish Breeder Box | Any Supplier | Hole drilled in side for cereal delivery | |
| Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid) | Hardware Store | ||
| Elastic to hold fish breeder box in place | Any Supplier | ||
| Sugared Cereal | Grocery Store | ||
| Surgical Huck Towel 16"x 23" | Medical Supply Store | ||
References
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