Preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja

Summary

El proceso completo, desde la preparación del cerebro muestra de imágenes en serie de seccionamiento con el microscopio de filo de la navaja, a la visualización y análisis de datos se describe. Esta técnica se utiliza actualmente para obtener datos del cerebro del ratón, pero es aplicable a otros órganos, otras especies.

Abstract

Los principales avances en alto rendimiento, de alta resolución, técnicas de microscopía 3D han permitido la adquisición de grandes volúmenes de datos neuroanatómicos a una resolución de submicrométricas. Uno de los primeros instrumentos como la producción de todo el cerebro escala de datos es el microscopio de filo de la navaja (KESM) ^{7, 5, 9,} desarrollada y alojada en el laboratorio de los autores. KESM se ha utilizado para la sección y el cerebro de toda la imagen del ratón con una resolución de submicrométricas, revelando los detalles intrincados de las redes neuronales (Golgi) ^{1, 4, 8,} redes vasculares (tinta china) ^{1, 4,} y la distribución de las células del cuerpo (Nissl) ³ . El uso de KESM no se limita al ratón ni el cerebro. Hemos logrado imágenes del cerebro del pulpo ^6, pulmón de ratón, y el cerebro de la rata. En estos momentos estamos trabajando en conjunto embriones de peces cebra. Datos como estos pueden contribuir enormemente a la investigación conectómica ^10, de la micro y la investigación hemodinámica, y la investigación estereología por disposicionesDing an. exacta verdad-terreno

En este artículo vamos a describir la tubería, incluyendo la preparación de muestras (fijación, tinción, y la inclusión), configuración y puesta en marcha KESM, la sección y la imagen con la KESM, procesamiento de imágenes, preparación de datos, y visualización de datos y análisis. Se hará hincapié en la preparación de muestras y la visualización / análisis de los datos obtenidos KESM. Esperamos que el protocolo detallado que se presenta en este artículo para ayudar a ampliar el acceso a KESM y aumentar su utilización.

Protocol

1. Preparación de la muestra: Golgi-Cox

1. Este protocolo sigue de cerca el protocolo de Mayerich et al. ^7.
2. El ratón C57BL/6J es profundamente anestesiados con anestesia inhalatoria con isoflurano y luego decapitado.
3. El cerebro es removido y colocado en una solución de fijación de Golgi-Cox (1% de cromato de potasio, dicromato de potasio al 1% y 1% de cloruro de mercurio en agua desionizada).
4. El cerebro es la izquierda en la solución de Golgi-Cox en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 10 a 16 semanas.
5. Los cerebros se enjuagan en agua desionizada durante la noche en la oscuridad.
6. El cerebro enjuagado se sumerge en una solución de amonio al 5% de hidróxido en agua desionizada durante 7 a 10 días en la oscuridad a temperatura ambiente. Esta vez fue una larga preparación para asegurar la infiltración de todo el cerebro, de manera que el precipitado negro tuvieron la oportunidad de forma completamente en el tejido.
7. El cerebro se aclara de nuevo con agua desionizada a temperatura ambiente durante 4 horas y tgallina deshidratados en una serie gradual de alcoholes etílico: 50% y 70% en el refrigerador (4 ° C), y el 85%, 95% (3 cambios), y el 100% (4 a 5) cambios en la temperatura ambiente. El cerebro se deja en cada solución durante 24 horas.
8. El cerebro deshidratado se pone entonces en acetona (3 a 4 cambios, cada uno por un día), seguido por una mezcla de acetona con Araldite Araldite a acetona proporción de 1:2, 1:1, 2:1, y finalmente en 100% araldite (3 cambios, cada vez durante la noche), en el refrigerador (4 ° C).
9. Finalmente, el cerebro trata está integrado en el 100% Araldite y se calienta a 60 ° C durante 3 días (cf. Protocolo de incrustación de Abbott y Sotelo ^2).
   Si las muestras están incrustadas en LR White continuación las muestras se transfieren de la solución de etanol últimos 100% a través de tres cambios de LR solución Blanca que cada uno mantenerse en el refrigerador durante la noche, que es un procedimiento estándar antes de la polimerización. Tres cambios se realizan para garantizar la infiltración total. La muestra se tgallina transferido a un nuevo blanco LR que se polimeriza en un recipiente cerrado a 60 ° C durante 24 horas, que es la cantidad necesaria de tiempo y temperatura para la polimerización adecuada.
10. Fig. 1 muestra un cerebro de Golgi-Cox manchada incrustado en Araldite.
11. Primero la muestra curada se monta en el anillo de muestra de metal con epoxi, y los lados de la manzana recortada como sea necesario (ver fig. 2).

2. Preparación de la muestra: Nissl

1. El ratón está profundamente anestesiados con ketamina y xilacina (1,7 mg de ketamina / xilazina 0,26 mg por cada 20 gramos de peso corporal) inyecta por vía intraperitoneal y perfundidos transcardially con 50 ml de la temperatura ambiente de buffer fosfato salino (pH 7,4), seguido por 250 ml de habitación temperatura de 10% neutral formalina tamponada (pH 7,4). y, finalmente, con 3,0 cc de pura tinta china.
2. Perfusión de todo el cuerpo con solución salina y fijador es necesario para limpiar la sangre del sistema cardiovascular y para fijar el ti TEMAS. Perfusión con tinta china es necesaria para llenar completamente la vasculatura del sistema cardiovascular.
3. El cerebro resultante se deshidrata a través de una serie de alcoholes clasificado de etilo (25% -100%) y luego incorporados en plásticos araldite siguiendo el protocolo de 1,8-1,9 por encima. Si LR blanco es el medio de inclusión que el protocolo de 1,10 mencionado anteriormente.

4. Preparación de la muestra: las especies genéricas, los órganos de genéricos

1. Para el caso genérico, la fijación se puede hacer con cualquiera de 10% neutral paraformaldehido tamponado% de formalina o 4.
2. Para el volumen de tejido pequeños, la difusión en lugar de la perfusión se recomienda para la fijación y la tinción. En el caso de los pequeños organismos u órganos, coloración también se puede hacer durante el proceso de deshidratación.
3. El protocolo de incorporación es el mismo que el anterior, aunque los tiempos para la infiltración de una solución puede ser reducido por los órganos u organismos que son mucho más pequeños que el cerebro del ratón entero.

jove_title "KESM> 5. configuración y la imagen

1. Apague la bomba, a su vez en el escenario, a su vez en la cámara, a su vez en la iluminación.
2. Levante un cuchillo y objetiva.
3. Instale el anillo de la muestra.
4. Medir la dimensión de muestras y crear un archivo de configuración de la aplicación Etapa KESM Controller2.
5. Inicio KESM Controller2 etapa e iniciar la etapa.
6. La cuchilla inferior / objetivo, a su vez en la bomba.
7. Enfoque objetivo y la cámara, girando la perilla de enfoque en el tren óptico y el ajuste de campo de la cámara de vista en relación con el filo de la navaja.
8. Pulse en [Ir] para iniciar la formación de imágenes.
9. Vea las figuras. 8.3. Véase el punto ^{9, 7} para los detalles técnicos.

6. Procesamiento de imágenes y preparación de datos

1. Copia de la pila de KESM ejecutable del procesador en la carpeta de datos en la carpeta de archivo de configuración (00000, 00001, etc.)
2. Ejecutar el procesador de la pila KESM para eliminar los artefactos de iluminación y normalizar la intensidad de fondo en todos loslas imágenes. Repita la operación para todas las subcarpetas de datos.
3. Prepare las baldosas de escala múltiple del conjunto de datos y cargar y configurar los archivos en el servidor web del cerebro KESM Atlas.
4. Ver fig. 9.

7. Visualización de datos y análisis

1. Visualización utilizando el atlas del cerebro KESM. Ir al http://kesm.cs.tamu.edu y seleccione el atlas correspondiente.
   1. Navegar como en los mapas de Google.
   2. Acercar y alejar al igual que en los mapas de Google.
   3. Para ir a una profundidad diferente, seleccione la profundidad de ir a cada paso en el menú desplegable, a continuación, haga clic en cualquiera [+] o [-] para aumentar o disminuir la profundidad z.
   4. Ajustar el número de superposición utilizando el menú desplegable.
   5. Ajustar el intervalo de superposición utilizando el menú desplegable.
   6. Ver fig. 11.
2. Visualización mediante MeVisLab.
   1. Lanzamiento MeVisLab.
   2. Crear un nuevo proyecto.
   3. En el siguiente, los nuevos módulos se pueden crear por tymesa de ping en el nombre del módulo en el cuadro de comandos.
   4. Crear un módulo [Compose3Dfrom2DFiles], e ir a la carpeta deseada. Introduzca la cadena de archivo y haga clic en [GetFileList]. Asegúrese de que las imágenes seleccionadas pueden caber en la memoria. Haga clic en [Create3D] para crear volumen.
   5. Crear un módulo [SetWorldMatrix], y establecer la "escala" en "Transforma Primaria" x, y, z con el tamaño adecuado voxel (0,6, 0,7, 1,0 para un objetivo 0.45NA 10X). Enlace [Compose3Dfrom2DFiles] a [SetWorldMatrix].
   6. Establecer la matriz y se transforma en "composición de la matriz" a "Ignore", "Ninguna", "Adelante".
   7. Crear un módulo [Arithmetic1] y establecer la "función" a "Invertir (Max-IMG)".
      Enlace [SetWorldMatrix] a [Arithmetic1].
   8. Crear un módulo [View3D] y conectar [Arithmetic1].
   9. En View3D, mientras que el botón derecho del ratón se presiona, mueve el ratón para ajustar el umbral. Puede recortar las regiones, la orientación del cambio (movimiento de mouse botón izquierdo del ratón mientras se pulsa), iluminación de cambio (renderin volumeng o MIP), activar / desactivar el fondo, etc
   10. Ver fig. 10.

8. Los resultados representativos:

A continuación, presentamos los datos de todo el cerebro y los detalles. Higos. 12-15 muestran a todo el cerebro tinta china, Golgi, Nissl y conjuntos de datos de ^{1, 4, 3.}

Figura 1. Cerebro de ratón fija, se tiñe y embebidos

Figura 2. Muestras de cerebro de ratón integrado montado en el anillo de la muestra.

Figura 3. El filo del cuchillo Microscopio de Barrido (KESM). Una foto de la KESM se muestra con sus principales componentes marcados: (1) de montaje de alta velocidad de la línea de barrido de la cámara, (2) objetivo del microscopio, (3) cuchilla de diamante y el colimador de luz, (4) de la SPECimen tanque (para obtener imágenes de la inmersión en agua), (5) de tres ejes de aire de precisión teniendo etapa, (6) blanco-luz del iluminador microscopio, (7) la bomba de agua (en la parte posterior) para la extracción de tejido seccionado, (8) PC servidor para el control de la etapa y la adquisición de imágenes (9), base de granito, y (10) puente de granito.

Figura 4. Principios de imágenes de la KESM. El director de operaciones de KESM se ilustra. El objetivo y el cuchillo se mantiene en su lugar, mientras que la muestra colocada en la etapa de movimientos de posicionamiento (flecha con línea continua) en la resolución de 20 nm y la velocidad de desplazamiento de 1-5, y se raspó contra la cuchilla de diamante (5 mm de ancho para el objetivo de 10X), generando una lámina delgada que fluye sobre el cuchillo (flecha con línea continua). Línea de exploración de imágenes se realiza cerca de la punta del cuchillo.

Figura 5. KESM cámara y objetivo de los controles de enfoque.

Figura 6. Asamblea KESM cuchillo y controles.

Figura 7. Inicial centrado a través del puerto de observación.

Figura 8. Controlador KESM Etapa 2 de la aplicación (de pantalla).

Figura 9. Pila KESM procesador de aplicaciones (screenshot).

Figura 10. MeVisLab aplicación (captura de pantalla).

Figura 11 KESM Atlas del Cerebro:. Web-interfaz (pantalla).

Figura 12. KESM todo el cerebro de datos con tinta china. Visualizaciones volumen de datos KESM pilas se muestran para el conjunto de datos vascular. (A) Close-up de los datos vascular. Ancho ~ 100 um. (Bd) de tres vistas estándar de toda la vasculatura del cerebro del ratón (submuestras de datos de alta resolución). Ancho ~ 10mm.

Figura 13. KESM todo el cerebro del ratón de datos de Golgi.

Figura 14. KESM Golgi detalles de los datos.

Figura 15. KESM todo el cerebro de datos Nissl. (A) Primer plano de la Ndatos ISSL. ~ 300 um ^3. (Bd) de tres puntos de vista estándar de la totalidad del cerebro del ratón de datos Nissl (submuestras de datos de alta resolución). Sección transversal se muestra una visión clara de las estructuras internas.

Discussion

El KESM permite un estudio submicrométricas a nivel de grandes volúmenes de muestras biológicas (~ 1 cm ^3). Este tipo de volumen es suficiente para almacenar toda órganos de animales pequeños, como el cerebro, pulmones, corazón, riñones, etc escaneadas las imágenes de los órganos pueden proporcionar información sin precedentes cuantitativa sobre la organización estructural de estos órganos, y permitir el modelado computacional de diversos funcionales aspectos de estos órganos, incluyendo la dinámica del circuito y de la red, propiedades eléctricas, de fluidos y la dinámica del flujo de aire, y la dinámica muscular.

El protocolo de preparación de muestras y el protocolo de post-análisis detallados en este artículo se espera para ayudar a grupos al margen de la investigación para tener un acceso más fácil a la KESM y los datos resultantes. El protocolo de operación KESM ayudará a los investigadores externos a apreciar los beneficios y limitaciones de esta técnica de imagen única.