Prøven Forberedelse, Imaging, og analyse protokoller for Knife-edge Scanning Mikroskopi

Summary

Hele prosessen fra hjernen prøven forberedelse til seriell seksjonering bildebehandling bruker Knife-Edge Scanning Microscope, til data visualisering og analyse er beskrevet. Denne teknikken er for tiden benyttes til å erverve mus hjernen data, men det er anvendelig til andre organer, andre arter.

Abstract

Store fremskritt i high-throughput, høy oppløsning, 3D mikroskopi teknikker har muliggjort oppkjøp av store mengder nevroanatomi data på submicrometer oppløsning. En av de første slike instrumenter som produserer hel-hjerne-skala data er Knife-Edge Scanning Microscope (KESM) ^{7, 5, 9,} utviklet og hostet i forfatternes lab. KESM har blitt brukt til seksjonen og bilde hel mus hjerner på submicrometer oppløsning, avslører den intrikate detaljer om nevrale nettverk (Golgi) ^{1, 4, 8,} vaskulære nettverk (tusj) ^{1, 4} og cellen kroppen distribusjon (Nissl) ³ . Bruken av KESM er ikke begrenset til musen eller hjernen. Vi har klart å avbildes blekkspruten hjernen ^6, mus lunge og rotte hjernen. Vi jobber for tiden på hele sebrafisk embryoer. Data som disse i stor grad kan bidra til connectomics forskning ^10; til mikrosirkulasjonen og hemodynamiske forskning, og å stereology forskning ved proviDing en eksakt bakken sannheten.

I denne artikkelen vil vi beskrive rørledningen, inkludert prøven forberedelse (festing, flekker, og embedding), KESM konfigurering og oppsett, seksjonering og bildebehandling med KESM, bildebehandling, data forberedelser og data visualisering og analyse. Hovedvekten vil være på prøven forberedelse og visualisering / analyse av innhentet KESM data. Vi forventer at detaljert protokoll som presenteres i denne artikkelen for å bidra til å utvide tilgangen til KESM og øke sin utnyttelse.

Protocol

1. Prøve tilberedning: Golgi-Cox

1. Denne protokollen følger nøye protokollen fra Mayerich et al. ^Syv.
2. Den C57BL/6J musen er dypt anesthetized bruker isofluran inhalant anestesi og deretter halshugget.
3. Hjernen er fjernet og plassert i en Golgi-Cox fiksering løsning (1% kalium kromat, 1% kalium dichromate, og 1% kvikksølv klorid i avionisert vann).
4. Hjernen er igjen i Golgi-Cox løsning i mørket, ved romtemperatur, 10 til 16 uker.
5. Hjernen skylles i avionisert vann over natten i mørket.
6. Det skylles hjernen er nedsenket i 5% ammoniumhydroksid løsning i avionisert vann i 7 til 10 dager i mørke ved romtemperatur. Denne lange forberedelser tiden var å sikre infiltrasjon av hele hjernen, slik at det svarte bunnfallet hadde en sjanse til å fullstendig form i vevet.
7. Hjernen er skylles igjen i avionisert vann ved romtemperatur i 4 timer og thøne dehydrert gjennom en gradert serie ethyl alkoholer: 50% og 70% i kjøleskap (4 ° C), og 85%, 95% (3 endringer), og 100% (4 til 5 endringer) i romtemperatur. Hjernen er igjen i hver løsning i 24 timer.
8. Den dehydrert hjernen er deretter satt i aceton (3 til 4 endringer, hver på én dag), etterfulgt av en Araldite-aceton blanding med Araldite til aceton forholdet 1:2, 1:1, 2:1, og til slutt i 100% Araldite (3 endringer, hver gang over natten), i kjøleskap (4 ° C).
9. Endelig er behandlet hjernen innebygd i 100% Araldite og oppvarmet til 60 ° C i 3 dager (jfr. innebygging protokollen i Abbott og Sotelo ^2).
   Dersom prøvene er innebygd i LR Hvite da prøvene overføres fra de siste 100% etanol løsning gjennom tre endringer av LR Hvite løsning som er hver oppbevares i kjøleskap over natten, som er en standard prosedyre før polymerisasjon. Tre endringer er gjort for å sikre full infiltrasjon. Prøven er thøne overføres til frisk LR hvite som er polymerisert i en lukket beholder ved 60 ° C i 24 timer, som er den nødvendige mengden av tid og temperatur for riktig polymerisasjon.
10. Fig. 1 viser et Golgi-Cox beiset hjernen innebygd i Araldite.
11. Det herdede prøveblokken er da montert på metall prøven ringen med epoxy, og sidene av blokken trimmet som nødvendig (se fig. 2).

2. Prøve forberedelser: Nissl

1. Musen er sterkt bedøvet med ketamin og xylazin (1,7 mg ketamin / 0,26 mg xylazin per 20 gram kroppsvekt) injisert intraperitonealt og deretter perfused transcardially bruke 50 ml av romtemperatur fosfat-bufret saltvann (pH 7,4), fulgt av 250 mL av rom temperatur 10% nøytral bufret formalin (pH 7,4). og til slutt med 3,0 cc av ufortynnet tusj.
2. Hele kroppen perfusjon med saltvannsoppløsning og festing er nødvendig å fjerne blodet fra det kardiovaskulære systemet og å fikse TI ssues. Perfusjon med tusj er nødvendig for å fylle blodkar av det kardiovaskulære systemet.
3. Den resulterende Hjernen er så dehydrert gjennom en serie av gradert ethyl alkoholer (25% -100%) og deretter innebygd i Araldite plast følge protokollen i 1.8 til 1.9 ovenfor. Hvis LR hvite er innebygging medium da protokollen i 1.10 ovenfor er fulgt.

Fire. Prøve forberedelser: Generic arter, generisk organer

1. For det generiske tilfellet kan feste gjøres med enten 10% nøytral bufret formalin eller 4% Paraformaldehyde.
2. For små vev volumer, er diffusjon istedenfor perfusjons anbefales for fiksering og farging. I tilfelle av små organismer eller organer, kan flekker også gjøres i løpet av dehydrering prosessen.
3. Den embedding-protokollen er den samme som ovenfor, selv om tidene for løsningen infiltrasjon kan reduseres for organer eller organismer som er mye mindre enn hele musen hjernen.

jove_title "> 5. KESM oppsett og bildebehandling

1. Slå av pumpen, slå på scenen, slå på kameraet, slå på lyset.
2. Raise kniv og objektiv.
3. Installer prøven ring.
4. Mål prøven dimensjon og lage en konfigurasjonsfil for KESM Stage Controller2 søknad.
5. Begynn KESM Stage Controller2 og initialisere scenen.
6. Lavere kniv / objektiv, slå på pumpen.
7. Fokus objektiv og kamera, ved å dreie fokus knotten på den optiske toget og justere kameraets synsfelt i forhold til kniveggen.
8. Trykk på [GO] for å initiere bildebehandling.
9. Se fig. 3-8. Se ^{9, 7} for tekniske detaljer.

Seks. Bildebehandling og data forberedelse

1. Kopier KESM Stack Processor kjørbare inn i data-mappen under konfigurasjonsfilen mappen (00000, 00001, etc.).
2. Kjør KESM Stack Processor å fjerne belysning artefakt og normalisere bakgrunnen intensiteten i allebilder. Gjenta for alle data undermapper.
3. Forbered Multiskala fliser fra datasettet og laste opp og satt opp filene i KESM Brain Atlas web server.
4. Se fig. 9.

7. Data visualisering og analyse

1. Visualisering bruker KESM Brain Atlas. Gå til http://kesm.cs.tamu.edu og velg riktig atlas.
   1. Naviger som i Google maps.
   2. Zoom inn og ut som i Google maps.
   3. Å gå til en annen dybde, velg hvor dypt til å gå på hvert trinn fra rullegardinmenyen, og klikk deretter på enten [+] eller [-] for å øke eller redusere z dybde.
   4. Juster overlay nummeret ved å bruke rullegardinmenyen.
   5. Juster overlay intervall ved å bruke rullegardinmenyen.
   6. Se fig. 11.
2. Visualisering ved hjelp MeVisLab.
   1. Launch MeVisLab.
   2. Opprett et nytt prosjekt.
   3. I det følgende kan nye moduler kan skape ved å typing i modulen navn i kommandoen esken.
   4. Lag modul [Compose3Dfrom2DFiles], og gå til ønsket mappe. Enter file streng og klikk på [GetFileList]. Sørg for at de valgte bildene kan passe i minnet. Klikk på [Create3D] for å skape volum.
   5. Lag modul [SetWorldMatrix], og angi "Scale" under "Elementary Transforms" x, y, z til riktig voxel størrelse (0,6, 0,7, 1,0 for en 10X 0.45NA mål). Link [Compose3Dfrom2DFiles] til [SetWorldMatrix].
   6. Still Matrix og forvandler under "Matrix Komposisjon" til "Ignorer", "Ignorer", "Forward".
   7. Lag modul [Arithmetic1] og sett "Function" til "Inverter (Max-Img)".
      Link [SetWorldMatrix] til [Arithmetic1].
   8. Lag modul [View3D] og koble [Arithmetic1].
   9. I View3D, mens høyre musknapp trykkes, beveger musen rundt for å justere terskelen. Du kan beskjære regioner, endre orientering (flytte musen mens venstre museknapp er trykket), endre belysning (volum rendering eller MIP), slå på / av bakgrunn, etc.
   10. Se fig. 10.

8. Representant Resultater:

Her presenterer vi hel-hjerne data og detaljer. Fiken. 12-15 viser hel-hjerne India Ink, Golgi og Nissl datasett ^{1, 4, 3.}

Figur 1. Faste, beiset, og innebygd mus hjernen

Figur 2. Innebygd mus hjernen prøven montert på prøven ring.

Figur 3. The Knife Edge Scanning Microscope (KESM). Et bilde av KESM er vist med sine hovedkomponenter merket: (1) high-speed line-scan kamera, (2) mikroskop objektiv, (3) diamant kniv montering og lys collimator, (4) SPEcimen tank (for vann nedsenking imaging), (5) med tre akser Precision Air-bærende scenen, (6) med hvitt lys mikroskop illuminator, (7) vannpumpe (i ryggen) for fjerning av seksjonert vev, (8) PC-server for scene kontroll og bilde oppkjøpet, (9) granitt base, og (10) granitt bro.

Figur 4. Imaging prinsipper KESM. Rektor ved drift av KESM er illustrert. Målet og kniven holdes på plass, mens prøven festet på posisjonering scenen trekk (pil med heltrukket linje) på oppløsning på 20 nm og kjørehastighet på 1-5, og får skrapet mot diamond kniv (5 mm bred for 10X objektiv), genererer en tynn del flyter over kniven (pil med heltrukket linje). Line-scan bildebehandling er gjort nær svært spissen av kniven.

Figur 5. KESM kamera og objektiv fokusere kontroller.

Figur 6. KESM kniv montering og kontroller.

Figur 7.. Initial fokus gjennom observasjon porten.

Figur 8. KESM Stage Controller to program (skjermbilde).

Figur 9. KESM stack prosessor program (skjermbilde).

Figur 10. MeVisLab program (skjermbilde).

Figur 11 KESM Brain Atlas:. Web-grensesnitt (screenshot).

Figur 12. KESM hel-hjerne tusj data. Volum visualiseringer av KESM data stabler vises for vaskulære datasettet. (A) Nærbilde av vaskulære data. Bredde ~ 100 UM. (Bd) Tre standard utsikt over hele musen hjernen blodkar (subsampled fra høyoppløselige data). Bredde ~ 10mm.

Figur 13. KESM hel-hjerne mus Golgi data.

Figur 14. KESM Golgi data detaljer.

Figur 15. KESM hel-hjerne Nissl data. (A) Nærbilde av Nissl data. ~ 300 UM ^3. (Bd) Tre standard utsikt over hele musen hjernen Nissl data (subsampled fra høyoppløselige data). Tverrsnitt vises for et klart syn av den interne strukturer.

Discussion

Den KESM gir en submicrometer nivå undersøkelse av store mengder biologisk prøvemateriale (~ 1 cm ^3). Denne typen volumet er nok til å holde hele små dyr organer, som hjerne, lunger, hjerter, nyrer, Skannede etc. bilder fra slike organer kan gi enestående kvantitativ informasjon om strukturelle organiseringen av disse organene, og aktivere beregningsorientert modellering av ulike funksjonelle aspekter av disse organene, inklusive krets og nettverk dynamikk, elektriske egenskaper, væske og luft flow dynamikk, og muskuløs dynamikk.

Prøven forberedelse protokoll og post-analyse protokoll beskrevet i denne artikkelen er forventet å bidra utenfor forskningsmiljøene til å ha lettere tilgang til KESM og den resulterende data. Den KESM drift protokollen vil hjelpe disse eksterne forskere til å verdsette fordelene og begrensninger av denne unike imaging modalitet.