Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изготовление образцов, Imaging, и анализ протоколов для ножа сканирующей микроскопии

Published: December 9, 2011 doi: 10.3791/3248
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 5
1Department of Computer Science and Engineering, Texas A&M University, 2Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Kettering University, 43Scan, 5Department of Veterinary Integrative Biosciences, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Полный процесс от мозга подготовки образца до серийного секционирования визуализации с использованием ножа сканирующий микроскоп, для визуализации и анализа данных описывается. Эта техника в настоящее время используется для получения данных мозга мыши, но она применима и к другим органам, другим видам.

Abstract

Крупные достижения в области высокой пропускной способностью, с высоким разрешением, 3D микроскопии позволили приобретения больших объемов данных на нейроанатомической субмикронных разрешения. Одним из первых таких инструментов производству целого мозга масштаба данные ножа сканирующего микроскопа (KESM) 7, 5, 9, разработанный и размещенный в лаборатории авторов. KESM был использован для раздела и образ целого мозга мыши на субмикронных разрешение, раскрывая сложные детали нейронных сетей (АГ) 1, 4, 8, сосудистой сети (тушь) 1, 4 и тела клетки распределения (Нисслю) 3 . Использование KESM не ограничивается мыши, ни мозг. Мы успешно отображаемого осьминога мозг 6, мыши легких и головного мозга крыс. В настоящее время мы работаем над целой рыбы эмбрионов зебры. Данные, как они могут внести значительный вклад в исследование connectomics 10; на микроциркуляцию и гемодинамических исследований; и стереологии исследования полодинь точного наземного истины.

В этой статье мы опишем трубопроводов, в том числе подготовки образцов (фиксация, окрашивание и вложение), KESM конфигурации и настройки, секционирования и обработки изображений с KESM, обработки изображений, подготовки данных и визуализации данных и анализа. Акцент будет сделан на подготовку образца и визуализации / анализ полученных данных KESM. Мы ожидаем, что подробный протокол, представленные в этой статье, чтобы помочь расширить доступ к KESM и увеличения его использования.

Protocol

1. Подготовка образца: Гольджи-Кокса

  1. Этот протокол внимательно следит протокол Mayerich и соавт. 7.
  2. Мышь C57BL/6J глубоко под наркозом использованием ингаляционных изофлуран анестезии, а затем обезглавили.
  3. Мозг демонтирован и помещен в Гольджи-Кокса фиксации раствором (1% хромата калия, 1% бихромата калия и 1% хлорида ртути в деионизованной воде).
  4. Мозг остается в Гольджи-Кокса решение в темноте, при комнатной температуре от 10 до 16 недель.
  5. Мозги промывают в деионизированной воде на ночь в темноте.
  6. Промывать мозг погружается в 5% раствор гидроксида аммония в деионизованной воде в течение 7 до 10 дней в темном месте при комнатной температуре. Это длительное время на подготовку было обеспечить проникновение весь мозг, так что черный осадок имел возможность полностью форме в ткани.
  7. Мозг снова промыть в деионизированной воде при комнатной температуре в течение 4 часов и ткурица обезвоженной через градуированные ряду спиртов этилового 50% и 70% в холодильнике (4 ° С), и 85%, 95% (3 изменения), и 100% (от 4 до 5 смен) при комнатной температуре. Мозг остается в каждом решении в течение 24 часов.
  8. Обезвоженный мозг затем положить в ацетоне (от 3 до 4 изменений, каждое в течение одного дня), далее следуют аралдит-ацетон с аралдит до ацетона соотношении 1:2, 1:1, 2:1, и, наконец, 100% аралдит (3 изменений, каждый раз на ночь) в холодильнике (4 ° С).
  9. Наконец, рассматриваются мозг встроен в 100% аралдит и нагревают до 60 ° С в течение 3 дней (см. вложение протокола в Abbott и Сотело 2).
    Если пробы встроенные в LR Белый затем образцы передаются из последних 100% раствор этанола через три изменения решение LR Белый, каждый из которых хранится в холодильнике в течение ночи, которая является стандартной процедурой до полимеризации. Три изменения вносятся в целях обеспечения полного проникновения. Образец ткурица переданы на свежий LR Белый, который полимеризуется в закрытой таре при температуре 60 ° С в течение 24 часов, что необходимое количество времени и температуры для правильной полимеризации.
  10. Рис. 1 показана Гольджи-Кокса окрашенных мозга встроены в Araldite.
  11. Вылечить образца блок затем монтируется на металлическое кольцо образец использования эпоксидной смолы, и по бокам блока обрезается по мере необходимости (см. рис. 2).

2. Подготовка образца: Нисслю

  1. Мышь глубоко наркозом использованием кетамина и ксилазина (1,7 мг кетамина / 0,26 мг ксилазина на 20 грамм массы тела) вводят внутрибрюшинно, а затем перфузию transcardially, используя 50 мл комнатной температуре фосфатном буферном растворе (рН 7,4), затем 250 мл комнате Температура 10% нейтральном буферном растворе формалина (рН 7,4). и, наконец, с 3,0 мл неразбавленной тушью.
  2. Всего перфузии тело с физиологическим раствором и фиксатор необходимо очистить кровь от сердечно-сосудистой системы и зафиксировать ти ОПРОСЫ. Перфузии тушью необходимо полностью заполнить сосудистой сердечно-сосудистой системы.
  3. В результате мозг то обезвоженной через серию градуированных спирты этиловый (25% -100%), а затем встроенные в пластиковые аралдит следующий протокол в 1.8-1.9 выше. Если LR белый вложение средой, то протокол в 1,10 выше следования.

4. Подготовка образца: Общий вид, общие органы

  1. Для общего случая, фиксация может быть сделано либо с 10% нейтральном буферном растворе формалина или 4% параформальдегида.
  2. Для небольших объемов тканей, диффузия, а не перфузии рекомендуется для фиксации и окрашивания. В случае мелких организмов или органов, окрашивание также может быть сделано во время обезвоживания процесса.
  3. Вложение протокол же, как и выше, хотя время для решения инфильтрация может быть уменьшена для органов или организмов, которые намного меньше, чем весь мозг мыши.
jove_title "> 5. KESM установки и обработки изображений

  1. Выключите насос, свою очередь, на сцене, включите камеру, включите осветитель.
  2. Поднимите нож и объективным.
  3. Установить образец кольцо.
  4. Мера измерения образца и создать файл конфигурации для KESM этап Controller2 приложения.
  5. Начало KESM этап Controller2 и инициализировать стадии.
  6. Нижний нож / цель, включить насос.
  7. Фокус объективных и камера, поворотом ручки фокусировки на оптические поезд и настроечного поля зрения камеры относительно ножа.
  8. Нажмите на [Go], чтобы начать съемки.
  9. См. рис. 3-8. Смотрите 9, 7 для технических деталей.

6. Обработка изображений и подготовки данных

  1. Скопируйте Процессор KESM стека исполняемой в папку данных в конфигурационной папке файл (00000, 00001 и др.).
  2. Запуск процессора KESM стека для удаления артефактов освещения и нормализовать интенсивность фона во всехизображений. Повторите эти действия для всех данных, вложенные папки.
  3. Подготовка многомасштабных плитки из набора данных и загрузить и установить файлы в мозг KESM веб-сервер Atlas.
  4. См. рис. 9.

7. Визуализация данных и анализа

  1. Визуализация использованием Атлас KESM мозга. К http://kesm.cs.tamu.edu и выберите соответствующий атлас.
    1. Перейдите, как в Google Maps.
    2. Увеличение и уменьшение масштаба, как в Google Maps.
    3. Для перехода на разной глубине, выбрать, как глубоко, чтобы пойти на каждом шаге из выпадающего меню, а затем нажмите на кнопки [+] или [-] для увеличения или уменьшения г глубины.
    4. Настраивает номер с помощью выпадающего меню.
    5. Настраивает интервал с помощью выпадающего меню.
    6. См. рис. 11.
  2. Визуализация использованием MeVisLab.
    1. Запуск MeVisLab.
    2. Создать новый проект.
    3. В следующем, новые модули могут быть по созданию типинг в имени модуля в окне команд.
    4. Создать модуль [Compose3Dfrom2DFiles], и перейти к нужной папке. Введите строку файла и щелкните на [GetFileList]. Убедитесь, что выбранные изображения может поместиться в памяти. Нажмите кнопку [Create3D] для создания объема.
    5. Создать модуль [SetWorldMatrix], и установить "Масштаб" в разделе "Элементарные преобразования" х, у, г до соответствующего размера воксела (0,6, 0,7, 1,0 для 10X 0.45NA цель). Ссылка [Compose3Dfrom2DFiles] до [SetWorldMatrix].
    6. Установить матрицы и преобразования в "Матрице Состав" на "Игнорировать", "Игнорировать", "Вперед".
    7. Создать модуль [Arithmetic1] и установите "Функция", чтобы "Обратить (Max-IMG)".
      Ссылка [SetWorldMatrix] до [Arithmetic1].
    8. Создать модуль [View3D] и подключить [Arithmetic1].
    9. В View3D, в то время как правая кнопка мыши нажата, перемещать мышь вокруг настроить порог. Можно обрезать регионов, изменить ориентацию (перемещение мыши, левая кнопка мыши нажата), изменение освещенности (объем renderinг или ПМС), включить / выключить фон и др.
    10. См. рис. 10.

8. Представитель Результаты:

Здесь, мы представляем весь мозг данных и деталей. Рис. 12-15 показать весь мозг тушь, Гольджи, и Нисслю наборов данных 1, 4, 3.

Рисунок 1
Рисунок 1. Фиксированная, с пятнами, и встроенных мозга мыши

Рисунок 2
Рисунок 2. Embedded образцов мозга мыши установлен на образце кольцо.

Рисунок 3
Рисунок 3. Сканирование Knife Edge микроскоп (KESM). Фотография KESM выдается его основных компонентов отмечены: (1) высокоскоростной линии сканирования камера, (2) объектива микроскопа, (3) алмаз сборку ножа и легкой коллиматор, (4) спеcimen резервуар (для воды изображений погружение), (5) трехосный точность воздушного подшипника этапе (6) белого света осветителя микроскопа, (7) Водяной насос (сзади) для удаления секционного ткани, (8) PC сервер для контроля стадии и получения изображений, (9) гранитным основанием, и (10) гранита моста.

Рисунок 4
Рисунок 4. Изображений принципы KESM. Основные работы KESM иллюстрируется. Объективные и нож удерживается на месте, в то время образцу, наносимой на стадии позиционирования ходов (стрелки с сплошная линия) с разрешением 20 нм, а скорость движения 1-5, и получает соскабливают ножом против алмаза (5 мм в ширину для 10х цель), генерируя шлифе перетекание нож (стрелка с сплошная линия). Линия сканирования изображений производится у самого кончика ножа.

Рисунок 5
Рисунок 5. Камеру KESM и объективного контроля фокусировки.

Рисунок 6
Рисунок 6. KESM сборку ножа и элементы управления.

Рисунок 7
Рисунок 7. Первоначальная фокусировки с наблюдением порт.

Рисунок 8
Рисунок 8. KESM этап контроллер 2 приложений (скриншот).

Рисунок 9
Рисунок 9. KESM стек процессор приложений (скриншот).

Рисунок 10
Рисунок 10. MeVisLab приложение (скриншот).

Рисунок 11
Рисунок 11 KESM мозга Атлас:. Web-интерфейс (скриншот).

Рисунок 12
Рисунок 12. KESM целого мозга данных тушь. Том визуализации данных KESM стеки показана сосудистого набора данных. (А) Крупный план сосудистой данных. Ширина ~ 100 мкм. (BD) Три стандартных видом на весь мозг мыши сосудистую (subsampled из данных высокого разрешения). Ширина ~ 10 мм.

Рисунок 13
Рисунок 13. KESM весь мозг мыши Гольджи данных.

Рисунок 14
Рисунок 14. KESM Гольджи данных деталей.

Рисунок 15
Рисунок 15. KESM целого мозга Нисслю данных. (А) крупным планом Nissl данных. ~ 300 мкм 3. (BD) Три стандартных видом на весь мозг мыши данных Нисслю (subsampled из данных высокого разрешения). Сечение показано четкое представление о внутренней структуре.

Discussion

KESM позволяет субмикронного уровня обследования больших объемов биологических образцов (~ 1 см 3). Такой объем достаточно, чтобы держать весь органов малого животных, таких как мозг, легкие, сердце, почки и др. Отсканированные изображения из таких органов могут обеспечить беспрецедентный количественную информацию о структурной организации этих органов, а также включить вычислительного моделирования различных функциональных аспекты этих органов, в том числе схемы и сетевые динамики, электрические свойства, динамика жидкостей и воздушных потоков, и мышечная динамика.

Протокол подготовки образцов и после анализа протоколов, описанных в этой статье, как ожидается, поможет за пределами исследовательских групп, чтобы иметь более легкий доступ к KESM и полученных данных. Протокол KESM операция поможет этим внешним исследователям оценить преимущества и ограничения этого уникального метода визуализации.

Disclosures

Тодд Хаффман С 3Scan, коммерческие компании, которая производит и продает KESM технологии (патент США # 6744572).

Acknowledgments

Этот проект был профинансирован NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), Технология Техаса Расширенные программы (# АТФ-000512-0146-2001, # АТФ-000512-0261-2001), штат Техас М & Research Foundation, факультете компьютерных наук и инженерии в Техасе & M University и 3Scan. Мы хотели бы поблагодарить Бернара Mesa (Micro Star Technologies) для технических консультаций и поддержки KESM приборов. Основные части разработки и реализации KESM делал Брюс Х. Маккормик, который умер в 2007 году.

References

  1. Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).
  2. Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
  3. Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).
  4. Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).
  5. Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).
  6. Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
  7. Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
  8. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
  9. McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).
  10. Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).

Tags

Биоинженерия выпуск 58 физической секционирования серийные срезы световая микроскопия сканирование мозга микротома

Erratum

Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013. Citeable Link.

A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  2. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  3. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  4. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  5. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  6. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  7. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  8. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  9. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

to:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
  2. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
  3. The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
  4. After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
  5. The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
  6. After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
Изготовление образцов, Imaging, и анализ протоколов для ножа сканирующей микроскопии
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J.,… More

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., Huffman, T., Keyser, J., Abbott, L. C. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter