Summary
Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-T de memoria efectora (TEM) de linfocitos. Aquí se demuestra cómo activar antígenos específicos de células TEM, inducir DTH adoptivos en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.
Abstract
Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-efector linfocitos T de memoria que se infiltran en el sitio de la inyección de un antígeno contra el que ha sido el sistema inmunológico preparado. La reacción inflamatoria se caracteriza por enrojecimiento e inflamación del sitio de estímulos antigénicos. Es un modelo práctico para determinar la eficacia in vivo de los inmunosupresores. DTH cutánea puede ser inducido, ya sea por transferencia adoptiva de linfocitos T antígeno-específicos o mediante la inmunización activa con un antígeno, y el desafío posterior intradérmica con el antígeno para inducir la reacción inflamatoria en la piel de una zona determinada. Respuestas DTH pueden ser inducidas a diversos antígenos, para la ovoalbúmina ejemplo, la tuberculina, toxoide tetánico, o hemocianina de lapa californiana. Estas reacciones también pueden ser inducidos en contra de autoantígenos, por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP) en ratas con encefalomielitis autoinmune experimental inducida con MBP, un modelo animal de esclerosis múltiple (1). Aquí se demuestra la forma de inducir una reacción adoptivos DTH en ratas Lewis. En primer lugar, se estimula la ovoalbúmina específicos de las células T in vitro y se inyecta por vía intraperitoneal estas células activadas a las ratas ingenuo. Después de permitir que las células que se equilibre en vivo durante 2 días, le desafío a las ratas con ovoalbúmina en el pabellón de una oreja, mientras que el otro oído Wil reciben solución salina. La reacción inflamatoria será visible 3-72 horas más tarde y espesor de la oreja se medirá como una indicación de la gravedad de DTH.
Protocol
1. La estimulación de los linfocitos T específicos ovoalbúmina
Descanso específicos ovoalbúmina las células T son estimulados con ovoalbúmina en la presencia de ratas Lewis timocitos irradiados (30 Gy) como células presentadoras de antígeno (APC), en medio de estimulación (Preparar en DMEM + penicilina / estreptomicina / L + GLUT-AANE RPMI + Vitaminas + + 2ME suero de rata + ovoalbúmina, a las concentraciones finales se señala en la lista de materiales.)
Suero de rata preparación
- Tomamos el suero de las ratas que el sacrificio como donantes timo.
- Las ratas son profundamente anestesiados por inhalación de halotano y tanta sangre como sea posible es dibujado por la perfusión cardiaca (5-10 ml por rata) con jeringas de 10 ml y 23 G 1 "agujas, después de que las ratas son decapitados inmediatamente para asegurar la muerte.
- La sangre se deja coagular durante 10 minutos a 37 ° C seguido por 10 min en hielo.
- El coágulo se extrae y se dio el resto del líquido.
- El suero se recoge, filtra de manera estéril y almacenadas a -20 ° C.
Preparación de las células presentadoras de antígeno
- Tome el timo de una rata decapitado con instrumentos estériles y colocarlo en PBS con penicilina y estreptomicina (PBS-PS), sobre el hielo.
- Tome el timo a una campana de cultivo de tejidos, lo limpia de coágulos sanguíneos y otros tejidos contaminantes y cortar en trozos pequeños en un colador de la célula (Fisher # 08-771-2) colocada en una placa de Petri de 10 cm con 10 ml de PBS- PS.
- Cada pieza se presiona a través del filtro de células usando la parte de atrás de un estéril de 1 ml émbolo de la jeringa. Recoger la única suspensión de células en un tubo de 50 ml en hielo.
- Enjuague el filtro celular con 20-40 ml más de PBS-PS. Centrifugar la suspensión a 1250g y resuspender el precipitado en PBS-PS, 5 ml / timo, en el hielo.
- Irradiar esta suspensión (30 Gy) en un irradiador gamma e inmediatamente lavar dos veces con 50 ml de PBS-PS.
Nota: Los mejores donantes del timo son las ratas jóvenes adultos, de 5-7 semanas de edad. Las ratas de hasta 10 semanas puede ser utilizado, pero el número de células disminuye con el tiempo. El género no es importante, aunque algunas personas dicen que los hombres son mejores donantes del timo. Siempre usamos las mujeres, porque todos nuestros animales están alojados en la misma habitación y no queremos que hombres y mujeres en la misma habitación.
Estímulo
- Lave los linfocitos T una vez y contar con ellos.
- Contar las células presentadoras de antígeno.
- Mezcle 3 x 10 6 ovoalbúmina específicos de las células T de 150 x 10 6 vehículos blindados en una placa de Petri de 10 cm con 10 ml de medio de estimulación.
- Incubar durante 48 horas a 37 ° C.
2. La transferencia adoptiva de los linfocitos T específicos ovoalbúmina
- Las ratas que utilizamos como receptores son mujeres 70-10 semanas de edad.
- Contar con los linfocitos T, que debe ser grande y redondo. Las células presentadoras de antígeno estará muerto.
- Centrifugar los linfocitos T y volver a suspender las de 10 x 10 6 células / ml en PBS.
- Inyectar 1 ml por vía intraperitoneal con jeringas de 3 ml y 23 G 1 agujas ".
3. Desafío con el antígeno en el oído
- Dos días después de la transferencia adoptiva, se inyectan 20 l de una solución de 1 mg / ml ovoalbúmina (= antígeno relevante) por un oído y solución salina (o antígeno irrelevante) en el otro oído. No filtrar la solución de antígeno, ya que puede perder los agregados que potencian la reacción inflamatoria.
Nota: Las ratas deben ser anestesiados para evitar movimientos. Si usted es diestro, mantenga la oreja entre el dedo pulgar izquierdo y el dedo índice, el dedo índice está dentro del oído y de la rata frente a usted.
- Se inyecta la solución en el pabellón auricular de la oreja utilizando 27G ½ "agujas. Trate de inyectarse a todas las ratas exactamente en el mismo lugar.
4. La medición de DTH
- El oído comenzará a girar roja e hinchada como un signo de inflamación. Medir el grosor de cada oído con un micrómetro de resorte (por ejemplo modelo PK-0505 de Mitutoyo).
- Tome 5-6 mediciones para cada oído en cada punto del tiempo y calcular la media.
- La inflamación máximo debe ocurrir entre 24 y 72 horas.
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Discussion
El desafío antigénico también se puede realizar en otros sitios, por ejemplo en la piel de la espalda (2). Sin embargo nos encontramos que un reto. Usando el pabellón de la oreja, como se muestra en este video, permite la medición más precisa de la reacción de DTH.
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Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Alexander Flugel (Martinsried, Alemania) para darnos la GFP-etiquetados, ovoalbúmina línea de células T específicas utilizadas en este protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
