Summary
Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) CCR7-efektör bellek T (TEM) lenfositlerin aracılık ettiği inflamatuar bir reaksiyon. Burada, antijen spesifik TEM hücreleri aktive Lewis sıçanlarda evlatlık DTH neden ve inflamatuar yanıt izlemek nasıl göstermektedir.
Abstract
Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH), bağışıklık sisteminin astarlanmalıdır karşı antijen enjeksiyonu site sızmaya CCR7 efektör bellek T lenfositleri aracılık ettiği inflamatuar bir reaksiyondur. Inflamatuar reaksiyon antijenik meydan yerinde kızarıklık ve şişme ile karakterize edilir. Immunsupresanların in vivo etkinliğini belirlemek için uygun bir model. Kutanöz DTH, antijen-spesifik T lenfositlerin evlatlık havalesi ile veya antijen ile aktif bağışıklama ve inflamatuar reaksiyon, belirli bir cilde alanda ikna etmek için antijen ile daha sonraki intradermal meydan tarafından başlatılabilir. DTH yanıtları örnek ovalbumin, tüberkülin, tetanoz toksoidi ya da anahtar deliği limpet hemosiyanin için, çeşitli antijenleri ikna olabilir. Bu tür reaksiyonlar da MBP, multipl skleroz (1) için bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomyelit indüklenen sıçan miyelin bazik protein (MBP), örneğin, otoantijen karşı tetiklenen olabilir. Burada nasıl ikna etmek için Lewis sıçanlarda bir evlatlık DTH reaksiyon göstermektedir. Biz ilk kez in vitro ovalbumin-spesifik T hücreleri uyarmak ve naif sıçanlarda bu aktive hücrelerinin intraperitoneal enjekte. Hücreleri, 2 gün boyunca in vivo olarak dengelenmesi için izin sonra, diğer kulak wil tuzlu alırken, fareler bir kulak kepçesi ovalbuminspesifik ile meydan okuyacak. Inflamatuar reaksiyon 3-72 saat sonra görülebilir ve kulak kalınlığı DTH şiddetinin bir göstergesi olarak ölçülen olacak.
Protocol
1. Ovalbumin-spesifik T lenfositlerin uyarılması
Dinlenme ovalbumin-spesifik T hücreleri, antijen sunan hücreler (APC) olarak Uyarım Orta ışınlanmış Lewis sıçan timositleri (30 Gy), (DMEM + Pen / Strep / L-Glut + NEAA + RPMI Vitaminler hazırlanın varlığı ovalbumin ile uyarılan + 2ME + Rat Serum + ovalbumin final konsantrasyonlarda malzeme listesinde kaydetti.)
Sıçan serum hazırlık
- Biz timus vericisi olarak kurban sıçanlarda serum alır.
- Sıçanlar halotan inhalasyon derin anestezi ve kardiyak perfüzyon (sıçan başına 5-10 ml), 10 ml şırınga ve sıçanlarda ölüm sağlamak için hemen dekapite sonra 23 G 1 "iğneler, kullanarak mümkün olduğunca fazla kan olarak çizilir.
- Kan 37, 10 dakika süreyle pıhtı izin ° C 10 dakika buz üzerinde izledi.
- Pıhtı çıkarılır ve kalan sıvı döndü.
- -20 ° C'de, serum toplanan steril filtreden ve saklanır
Antijen sunan hücreler hazırlanması
- Steril aletler kullanılarak dekapite sıçan timus alın ve PBS içeren penisilin ve streptomisin (PBS-PS), buz üzerine yerleştirin.
- Bir doku kültürü kaput timus atın, kan pıhtılaşması ve diğer kirlenmesine neden olan doku temiz ve küçük parçalar halinde kesip, 10 ml içeren bir 10 cm petri yerleştirilir bir hücre süzgeç (Fisher # 08-771-2) PBS- PS.
- Her bir parça, 1 ml steril bir şırınga pistonu geri kullanarak hücre süzgecinden bastırılır. 50 ml tüp içine buz üzerinde bir tek hücre süspansiyonu toplayın.
- PBS-PS 20-40 daha fazla ml hücre süzgeç durulayın. 1250g süspansiyon santrifüj ve buz üzerinde PBS-PS pelet, 5 ml / timus, tekrar süspansiyon haline getirin.
- Bir gama ışınlama bu süspansiyon (30 Gy) ışın tedavisi ve hemen, 50 ml PBS-PS ile iki kez yıkayın.
Not: En iyi timus bağışçılar, eski genç erişkin sıçan, 5-7 hafta . 10 hafta kadar rat kullanıldı ama zamanla hücre sayısı azalır olabilir. Bazı insanlar, erkekler daha iyi timus donörlerin olduğunu söylemek rağmen Cinsiyet önemli değildir. Tüm hayvanlar aynı oda içinde muhafaza edilir çünkü her zaman kadın ve erkekler ve kadınlar aynı odada istemiyorum.
Uyarım
- T lenfositleri bir kez yıkayın ve bunları saymak.
- Antijen-sunan hücreler güvenin.
- Mix 3 x 10 6 10 ml stimülasyon orta içeren 10 cm'lik petri 150 x 10 6 APC'ler ovalbumin-spesifik T hücreleri.
- 37 az 48 saat inkübe ° C.
2. Ovalbumin-spesifik T lenfositleri evlatlık transferi
- Alıcıları olarak kullandığımız fareler 7-10 hafta yaşlı kadın vardır.
- T lenfositleri sayın büyük ve yuvarlak olmalıdır. Antijen-sunan hücreler ölmüş olacak.
- T lenfositleri Santrifüj ve 10 x 10 6 hücre / ml PBS onları tekrar süspansiyon haline getirin.
- 1 ml intraperitoneal 3 ml şırınga ve 23 G 1 "iğneler kullanılarak enjekte edilir.
3. Kulak antijen ile Mücadelesi
- İki gün evlatlık transferi sonra, bir kulak ve diğer kulak tuzlu su (ya da ilgisiz antijen), 1 mg / ml ovalbumin çözümü (= ilgili antijen) 20 ul enjekte edilir. Inflamatuar reaksiyon geliştirmek agrega kaybedebilirsiniz antijen çözüm filtre yapmayın.
Not: sıçanlarda hareketleri önlemek için anestezi olmalıdır. Sağ elini, sol başparmak ve işaret parmağı, işaret parmağı kulak içinde olmak ve size dönük olacak şekilde sıçan arasındaki kulak tutun.
- 27G ½ "iğne ile kulak kepçesi çözüm enjekte edilir. Farelerin hepsinde aynı yerde tam olarak enjekte etmeye çalışın.
4. DTH, ölçümü
- Kulak inflamasyonun bir işareti olarak şişer ve kırmızı dönmeye başlayacak. Yaylı mikrometre (örnek model Mitutoyo gelen PK-0505) ile her bir kulak kalınlığı ölçülür.
- Her zaman bir noktada her bir kulak için 5-6 ölçüm ve ortalama hesaplamak.
- 24 ve 72 saatleri arasında maksimum şişme meydana gelmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antijenik meydan aynı zamanda, arka (2) cilt örneğin, diğer sitelerde de yapılabilir. Ancak bu zorlu bulabilirsiniz. Bu videoda gösterildiği gibi kulak kepçesi, DTH reaksiyon en hassas ölçüm için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz bu protokolü kullanılan GFP etiketli ovalbumin-spesifik T hücre hattı bize sağlamak için Dr. Alexander Flügel (Martinsried Almanya) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
