Summary
हम नवजात cardiomyocytes और आतंच ऊतक इंजीनियरिंग के लिए hydrogel constructs में encapsulation के लिए कक्षों की तैयारी के अलगाव का वर्णन. हम संस्कृति सक्रिय बिजली की उत्तेजना और सेल व्यवहार्यता और immunohistological धुंधला पर उत्पन्न बल सहित अवधि के बाद ऊतक इंजीनियर मायोकार्डियम का विश्लेषण करने के लिए विधियों का वर्णन.
Protocol
1. नवजात cardiomyocyte अलगाव - तैयारी (पहले दिन)
इस अनुभाग में बनाई गई समाधान: PBS-ग्लूकोज समाधान, मीडिया रोक .
- 5 एमएल जोड़ने पेनिसिलिन (100 इकाइयों / एमएल / μg मिलीलीटर क्रमशः 100) स्ट्रेप्टोमाइसिन और ग्लूकोज की 1.98 ग्राम 250 मिलीलीटर 1x बाँझ फॉस्फेट खारा (पीबीएस) buffered द्वारा पीबीएस शर्करा एक समाधान तैयार है और अतिरिक्त के साथ समाधान की मात्रा 500 मिलीलीटर के लिए लाने बाँझ 1x पीबीएस.
- 250ml बाँझ है Dulbecco संशोधित है ईगल मध्यम (DMEM) के लिए 25 मिलीलीटर FBS और पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 मिलीलीटर (ऊपर के रूप में एक ही एकाग्रता) को जोड़ने से रोक मीडिया की तैयारी और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ DMEM के साथ 500 मिलीलीटर से पहले बाँझ फ़िल्टरिंग मात्रा लाने के.
- शल्य वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा अलगाव के लिए आवश्यक उपकरणों को जीवाणुरहित: hemostat, # 5 संदंश, बड़ी कैंची, सूक्ष्म कैंची, और एक स्केलपेल संभाल (# 4).
2. नवजात cardiomyocyte अलगाव - तैयारी (फसल के दिन)
बाँझपन बनाए रखने के लिए यकीन है कि
इस खंड में प्रयुक्त समाधान: PBS-ग्लूकोज समाधान Betadine,
- प्रत्येक कूड़े के लिए, दो बाँझ 100 मिमी पेट्री डिश ले, उन्हें हुड में जगह और ~ ठंडा पीबीएस शर्करा की 10 एमएल के साथ भरें. ये तो एक बाँझ संस्कृति हुड में बर्फ के साथ बर्फ भरी बाल्टी में रखा जाना चाहिए.
- Betadine की 30-40 एमएल के साथ हुड में एक 250 एमएल बीकर रखें.
- एक बोतल और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सील जगह में 50 एमएल / PBS-ग्लूकोज के कूड़े जोड़ें.
- प्रत्येक व्यक्ति के लिए, एक शोषक हुड काम की सतह पर Underpad पीठ जगह और बाँझ टांगना के केंद्र कार्य क्षेत्र को छू नहीं सावधान किया जा रहा शीर्ष पर एक बाँझ टांगना जगह. उपकरणों को छूने के बिना शल्य चिकित्सा और बाँझ टांगना पर एक 4 x 4 धुंध पैड उपकरणों डंप. टांगना पर एक बाँझ # 20 स्केलपेल ब्लेड और डंप खोलें, फिर गैर बाँझ दस्ताने के साथ छू नहीं सावधान किया जा रहा है.
- और अपारदर्शी कंटेनर, जगह पिल्ले में बांध जगह से हुड में पिल्ले को ले लो
- बाँझ दस्ताने पर रखो
- चौथाई में धुंध मोड़ो, hemostat और Betadine बीकर में जगह के साथ दबाना.
- स्केलपेल संभाल पर स्केलपेल ब्लेड रखो और अलग निर्धारित करें.
3. नवजात cardiomyocyte अलगाव - दिल विच्छेदन
समाधान: इस खंड में प्रयुक्त Betadine, पीबीएस शर्करा समाधान
- अंगूठे और तर्जनी के बीच कंधे ब्लेड के बीच त्वचा pinching द्वारा पिल्ला अपने गैर प्रमुख हाथ में उठाओ. बड़ी कैंची का प्रयोग, एक कटौती में पिल्ला सिर काटना. पिल्ला आगे के पीछे से कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें कि रीढ़ की हड्डी पूरी तरह कटे है सुनिश्चित करें.
- झाड़ू से साफ़ करना betadine लथपथ धुंध के साथ पिल्ला के सीने में. कंधे ब्लेड के साथ pinching द्वारा पिल्ला सुरक्षित. दिल को बेनकाब करने के लिए आंशिक thoracotomy प्रदर्शन करना. लागू दबाव बढ़ाएँ, जिससे scalpular विच्छेदन के लिए पसलियों पिछले दिल को मजबूर.
- महान जहाजों तोड़ और दिल को दूर करने के लिए दिल के पीछे स्केलपेल ब्लेड चलाएँ. पीबीएस - ग्लूकोज है कि बर्फ पर है युक्त पेट्री डिश में दिल रखें.
- कूड़े में एक पिल्ला के लिए चरण 1-3 दोहराएँ.
4. नवजात cardiomyocyte अलगाव myocyte अलगाव
समाधान बनाया है / इस खंड में इस्तेमाल किया: समाधान पीबीएस ग्लूकोज, collagenase समाधान, समाधान रोक
- एक बार दिल पृथक किया गया है, बर्फ ठंड पीबीएस ग्लूकोज समाधान में rinsing द्वारा किसी भी अवशिष्ट रक्त और संयोजी ऊतक निकालने के लिए, शीर्ष 1 / दिल के 3 को हटाने के लिए ठंडे बर्फ के साथ एक ताजा पेट्री डिश में केवल निलय ऊतक और जगह अलग पीबीएस ग्लूकोज, पहले तैयार है.
- सावधानी ~ 1 घन सूक्ष्म कैंची और संदंश का उपयोग मिमी में दिल कीमा.
- एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक लो, कैंची का उपयोग इतना है कि विंदुक के मुँह ~ 3 मिमी व्यास में है टिप कटौती. विंदुक का प्रयोग करें एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार और बर्फ पर जगह में ऊतक समाधान के टुकड़े और सभी हस्तांतरण.
- 37 की बोतल में प्रकार द्वितीय collagenase के पिल्ले के कूड़े के अनुसार 15,000 इकाइयों (इकाइयों / मिलीग्राम बहुत पर निर्भर है) और जगह वजन ° सी गरम पीबीएस शर्करा पहले तैयार collagenase समाधान बनाने. एक अलग बोतल में अच्छी तरह से और बाँझ फिल्टर मिक्स. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में वापस प्लेस. 37 डिग्री सेल्सियस के रूप में अच्छी तरह से पानी स्नान में रोक समाधान रखें.
- कीमा बनाया हुआ ऊतक अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. निकालें सतह पर तैरनेवाला तक कुल मात्रा ~ 10 एमएल है. अपकेंद्रित्र ट्यूब collagenase समाधान के 7 मिलीलीटर जोड़ें.
- ऊतक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या ओवन के अंदर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर एक ट्यूब रैक में और collagenase टुकड़े के साथ शंक्वाकार ट्यूब रखो. कक्षीय हिलनेवाला और लगभग 60 rpm पर मुड़ें दरवाज़ा बंद. 7 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें. Collagenase बीएसी जगह सुनिश्चित करेंपानी के लिए इसे गर्म रखने के स्नान में कश्मीर.
- जब सिपाही बाहर चला जाता है, डाकू में शंक्वाकार वापस ले आओ. इसके अलावा गर्म collagenase लाने और हुड में समाधान रोक. धीरे ऊतक टुकड़े 5-7 बार उन्हें तोड़ने टाइट्रेट. टाइट्रेट करना के बाद, टुकड़े को नीचे (2-3 मिनट) के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. बंद के रूप में के रूप में सतह पर तैरनेवाला की बहुत संभव महाप्राण (व्यंजन) बहुत सावधान किया जा रहा करने के लिए नहीं चूसना ऊतक टुकड़े. बाद में, collagenase ऊतक के टुकड़े के लिए समाधान के 7 मिलीलीटर जोड़ने और इनक्यूबेटर में वापस हिलनेवाला पर 7 मिनट के लिए जगह है.
- प्रत्येक शेष कदम के लिए, धीरे 10 बार टाइट्रेट ऊतक के टुकड़े को तोड़ने. एक बार ऊतक टुकड़े बसा है, सतह पर तैरनेवाला आकर्षित बंद है और यह एक अलग 50 शंक्वाकार मिलीलीटर में इकट्ठा. ऊतक के टुकड़े के लिए collagenase के 7 मिलीलीटर जोड़ें और फिर से 7 मिनट के लिए पचाने में है. सतह पर तैरनेवाला ट्यूब करने के लिए, एक अलग सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ पाचन से सतह पर तैरनेवाला के प्रत्येक अतिरिक्त के बाद रोक समाधान के 10 एमएल जोड़ें.
- दोहराएँ जब तक collagenase के सभी इस्तेमाल किया गया है (कुल 7 कदम).
- अंतिम पाचन कदम के बाद, सेल समाधान और 70μm सेल चलनी के माध्यम से ताजा शंक्वाकार में फिल्टर के साथ शंक्वाकार ले.
- कोशिकाओं 100g में स्पिन नीचे और 5 मिनट के लिए एक hemocytometer का उपयोग गिना जा DMEM के 20 एमएल में resuspend, और बर्फ पर कोशिकाओं की जगह.
- Trypan ब्लू समाधान (75 μl Trypan ब्लू, 125 μl पीबीएस) में कोशिकाओं के 50 μl प्लेस hemocytometer में गिनती के लिए 10 μl रखने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण. लाइव कोशिकाओं को स्पष्ट कर रहे हैं जबकि मृत कोशिकाओं नीले हैं. लगभग 80-90% की व्यवहार्यता के साथ, पिल्ला चूहे के अनुसार लगभग 3 लाख कोशिकाओं की अपेक्षा करें.
5. कास्टिंग आतंच जेल constructs आतंच जैल (अग्रिम में अच्छी तरह से किया) बनाने के लिए तैयार -
समाधान इस खंड में बनाया: फाइब्रिनोजेन शेयर समाधान, थ्रोम्बिन स्टॉक समाधान, Pluronics समाधान, myocardial निर्माण मीडिया.
- 20 मिमी HEPES बफर में HEPES में 0.9% में एक 33 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन का जायजा समाधान तैयार करने के लिए खारा धीरे धीरे मिश्रण फाइब्रिनोजेन द्वारा कई घंटे से अधिक खारा 37 ° buffered सी. समाधान रातोंरात 2-8 पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें डिग्री सेल्सियस 37 सी. सेंटीग्रेड के समाधान गर्म समाधान बाँझ लगातार फिल्टर की एक श्रृंखला के माध्यम से फ़िल्टर्ड: 40 सुक्ष्ममापी सेल strainers, 0.45 सुक्ष्ममापी बोतल गिलास पूर्व फिल्टर के साथ शीर्ष फिल्टर, और 0.2 सुक्ष्ममापी बोतल गिलास पूर्व फिल्टर के साथ शीर्ष फिल्टर. समाधान 1 एमएल और 3 एमएल aliquots में aliquoted है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
- Μl 500 और 250 μl aliquots और स्थिर में 0.9% खारा और बाँझ विआयनीकृत जल, बाँझ फिल्टर के 2 एमएल के 18 एमएल के लिए एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर विभाज्य, के माध्यम से थ्रोम्बिन के 500 यू जोड़कर एक 25 यू / एमएल थ्रोम्बिन का जायजा समाधान तैयार -80 डिग्री सेल्सियस
- एक 5% w / ध् Pluronics समाधान एफ 127 विआयनीकृत पानी के 700 एमएल के लिए F-127 Pluronics के 50 ग्राम भंग करके तैयार करें. समाधान मात्रा लाओ अतिरिक्त विआयनीकृत जल के साथ 1L. 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ बाँझ फिल्टर. Pluronics समाधान तीन गुना से पहले की जगह अगर प्रत्येक उपयोग के बाद बाँझ फ़िल्टर्ड किया जा सकता है है इस्तेमाल किया.
- दौरे का निर्माण मीडिया 10% के घोड़े सीरम, 2% की भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 6 DMEM में मिलीग्राम / एमएल-aminocaproic एसिड जोड़कर तैयार करें. 50 μg / ascorbic एसिड के मिलीग्राम और 25 सुक्ष्ममापी HEPES में μg / इंसुलिन की मिलीलीटर 2 तुरंत खिलाने से पहले जोड़ा जाना चाहिए.
- खराद का धुरा एक साथ एक teflon छड़, एक teflon आस्तीन, एक इंजेक्शन प्रयोजनों के लिए हटा निशान के साथ दो teflon वाशर, और दो रबर O-अंगूठी (चित्रा 2a देखें) डाल द्वारा इकट्ठे. उपयोग से पहले आटोक्लेव.
- मोल्ड और 3CC सिरिंज plungers के रूप में इस्तेमाल किया जा casings के बाहरी भाग के लिए 6cc सिरिंज casings ले लो, और उन्हें बंद काटने luer ताला समाप्त होता है और वाष्पदावी विसंक्रण (चित्रा 2a देखें) द्वारा तैयार.
6. कास्टिंग आतंच जेल constructs - आतंच जैल बनाने के लिए तैयार (सही आतंच जेल constructs करने से पहले )
इस खंड में प्रयोग किया जाता समाधान: Pluronics समाधान
- बाँझ फिल्टर 5% Pluronics एफ 127 0.2 उपयोग करने से पहले फिल्टर सुक्ष्ममापी के साथ समाधान. 1 हुड में एल बीकर में 5% समाधान Pluronics प्लेस में mandrels सिरिंज casings. पूरा कोटिंग सुनिश्चित करने के हुड में 2-3 घंटे के लिए Pluronics समाधान में भिगोने भागों छोड़ो. Pluronics समाधान mandrels कोट और mandrels के लिए पालन आतंच जेल से रोकता है.
- 2-3 घंटे ऊष्मायन के बाद, 5% Pluronics समाधान बोतल में वापस डाल, बाँझ पर्दे हुड की सतह पर नीचे जगह और बाँझ दस्ताने पहनने के लिए नए नए साँचे निर्माण.
- 6 सीसी सिरिंज casings में निर्माण mandrels प्लेस, एक सवार के रूप में 3CC सिरिंज का उपयोग करने के लिए O-छल्ले और Teflon वाशर के बीच एक तंग सील सुनिश्चित.
7. कास्टिंग आतंच जेल इंजेक्शन मोल्डिंग के माध्यम से constructs
समाधान इस खंड में बनाया: एफ समाधान, टी समाधान, सेल समाधान.
- आतंच जेल के 1 एमएल (3.3 मिलीग्राम / एमएल अंतिम फाइब्रिनोजेन एकाग्रता, 25 यू / एमएल अंतिम थ्रोम्बिन एकाग्रता) बनाने के लिए, एक चोटीदार ट्यूब में F 20 मिमी HEPES बफर में 558 μl फाइब्रिनोजेन शेयर के 112 μl जोड़कर समाधान बनाने 0.9% नमकीन घोल. एक अलग शंक्वाकार ट्यूब में, थ्रोम्बिन शेयर के 17 μl, और 2 एन Ca के 1.3 μl जोड़कर एक टी समाधान बनाने + + DMEM के 135 μl का हल. देखें तालिका 1.
- एक तिहाई शंक्वाकार ट्यूब में, नीचे कताई कोशिकाओं और कोशिकाओं resuspending मात्रा में निर्माण में इतना है कि सेल की एकाग्रता 29,4 मिलियन कोशिकाओं / एमएल या 6 बार इच्छित कक्षों की अंतिम एकाग्रता की एकाग्रता है एक सेल समाधान तैयार
- जब आप आतंच जेल निर्माण, प्रस्तुत करने का एक 18G 1 आधा इंच लंबी सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज कलाकारों के लिए तैयार हैं. एक 21G 1 इंच सुई के रूप में अच्छी तरह से तैयार है.
- सेल समाधान आतंच समाधान एफ समाधान के एक 04:01:01 के अनुपात में बनाया टी समाधान:. जेल के एक एमएल बनाने के लिए, एक साफ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब, सेल समाधान के 167 μL, और अंत में टी समाधान के 167 μl जोड़ने द्वारा पीछा में एफ समाधान की 667 μL जोड़ें. पिपेट समाधान एक साथ मिश्रण बुलबुले परिचय नहीं सावधान किया जा रहा है. एक बार समाधान मिश्रित कर रहे हैं, प्रतिक्रिया शुरू कर दिया है और constructs के इंजेक्शन तुरंत किया जाना चाहिए.
- 18G सुई के साथ पहले से तैयार सिरिंज ले लो और आतंच समाधान आकर्षित. ध्यान रखना सिरिंज सुई में हो रहा से बुलबुले को रोकने नहीं पलटना. एक 21G सुई के साथ 18G सुई बदलें. सिरिंज धीरे ठोकर बाहर हवा बुलबुले बल.
- डाट और आवरण के बीच Teflon O-अंगूठी में नाली के बाद मोल्ड में सिरिंज डालें और मोल्ड में समाधान इंजेक्षन. शीर्ष पर नाली के साथ ढालना को पूरा भरने बीमा झुकाएँ. सिरिंज निकालें और शेष molds के भरने के लिए जारी रखने के. बस जेल समाधान के लिए एक ही समय में कई molds को भरने के लिए बनाया जा सकता है. हालांकि, क्योंकि समाधान जल्दी से जैल, यह आम तौर पर 6 से किसी दिए गए समय पर इंजेक्शन constructs की संख्या को सीमित करने के लिए एक अच्छा विचार है.
- 37 पर तीन के समूहों और इनक्यूबेटर या ओवन में जगह में Parafilm में molds ° सी. लपेटें जैल 20 मिनट के लिए नए नए साँचे में सेते करने के लिए जेल समय भाजन करना करने की अनुमति दें.
- प्रत्येक संस्कृति जार (Nalgene जार सीधे साइड) का निर्माण प्रति दौरे निर्माण माध्यम से 21 एमएल के साथ भरें. बाँझ 3 सीसी के निर्माण के साथ DMEM के साथ एक बड़ा पेट्री डिश में खराद का धुरा बल सवार के रूप में आवरण सिरिंज का उपयोग करें. तब नमूना जार में का निर्माण जगह है. प्रत्येक 16 ऑउंस जार 6 constructs करने के लिए पकड़ है, जबकि प्रत्येक 4 ऑउंस जार 2 पकड़ कर सकते हैं.
- जार पर टोपी भाड़ और उन्हें इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण. इनक्यूबेटर अंदर, जार पर टोपी ढीला गैस आदान - प्रदान के लिए अनुमति.
- 24 घंटे के बाद, एक बाँझ दंत ले ले और धक्का सफेद teflon O-अंगूठी से दूर रिंग मोल्ड के सिरों पर निर्माण की वर्दी संरेखण सुनिश्चित प्रतिनिधि परिणामों में (चित्र 2 देखें) का निर्माण.
8. विश्लेषण तकनीक (संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद) - संकुचन बल परीक्षण
समाधान: इस खंड में प्रयुक्त DMEM, myocardial निर्माण मीडिया.
- नेतृत्व उत्तेजक औधधि से स्नान में इलेक्ट्रोड पर तारों के लिए आ रहा पर मगरमच्छ क्लिप दबाना. डाटा अधिग्रहण बोर्ड, पल्स जनरेटर, और बल transducer ऊपर शक्ति. बल transducer 5g सेटिंग के लिए बंद किया जाना चाहिए और चुना. एक कस्टम LabVIEW प्रोग्राम है कि दिखाता है और बल transducer से डेटा बचाता खोलें. प्रत्येक नमूना के लिए डेटा फ़ोल्डर में एक नया, खाली पाठ फ़ाइल बनाएँ.
- 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में DMEM प्लेस और समय की अनुमति के लिए यह constructs परीक्षण से पहले गर्म करने के लिए. एक बार गरम, जगह 37 डिग्री सेल्सियस DMEM बल माप प्रणाली के माध्यम स्नान (चित्रा 3A देखें) में.
- धीरे चिमटी के साथ Teflon समर्थन से निर्माण अंगूठी स्लाइडिंग द्वारा नमूना जार से का निर्माण निकालें और बल माप प्रणाली के माध्यम स्नान में तय धातु पोस्ट से अधिक का निर्माण जगह है. चिमटी के साथ का निर्माण पकड़ नहीं करो! बल्कि, चिमटी का उपयोग करने के लिए धक्का और लिफ्ट खराद का धुरा समर्थन के बंद का निर्माण.
- Transducer हाथ से अधिक का निर्माण के दूसरे छोर प्लेस और जब तक transducer 0.50V पढ़ता कस (लगभग 1.0 बल ग्राम या तनाव की 10 millinewtons)
- संकुचन बल में दर्ज किया जा डेटा के लिए पाठ फ़ाइल का चयन करें.
- कार्डियक उत्तेजक औधधि (S88X # मॉडल, घास टेक्नोलॉजीज), नाड़ी वोल्टेज 20V (8 वी / सेमी), 6ms अवधि, और 1 हर्ट्ज की एक दर सेट.
- प्रारंभ बटन "पर / बंद आउटपुट" दबाने से बिजली पेसिंग
- रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें जब तक तरंग नियमित रूप से हो जाता है.
- बल माप प्रणाली मध्यम स्नान से ध्यान का निर्माण को हटाने और यह संस्कृति माध्यम में वापस जगह है. फिर बल माप प्रणाली के माध्यम स्नान से DMEM हटाने और ताजा, गर्म DMEM के साथ प्रतिस्थापित करने के लिए addit विश्लेषणional नमूने.
- कट का निर्माण और यह इतना उतारना है कि आप का निर्माण की लंबाई चौड़ाई के उपाय कर सकते हैं
- कट वर्गों में निर्माण करने के लिए व्यवहार्यता, ऊतक विज्ञान, या पश्चिमी धब्बा माप सहित अतिरिक्त विश्लेषण माप के लिए इस्तेमाल किया जा.
9. विश्लेषण तकनीक (संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद) - व्यवहार्यता के लिए लाइव मृत परख (Invitrogen परख / लाइव मृत के साथ) 14:
समाधान: इस खंड में प्रयुक्त EthD 1 स्टॉक समाधान, calcein AM स्टॉक समाधान पीबीएस
- पीबीएस में 3x 5 मिनट washes के साथ नमूने कुल्ला.
- 2 मिमी EthD-1 शेयर बाँझ पीबीएस और भंवर के 10 एमएल समाधान के 20 μl जोड़ें मिश्रण पूरी तरह सुनिश्चित है.
- 4 मिमी के 5 μl calcein EthD-1 समाधान के लिए शेयर stolution AM जोड़ें. फिर, भंवर मिश्रण पूरी तरह से सुनिश्चित करने के लिए.
- निर्माण करने के लिए कवर ऊपर के समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ें.
- सेते कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कवर (रंगों की photobleaching रोकने के).
- रंजक निकालें और गर्म पीबीएस के साथ की जगह. निरीक्षण और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ छवियों को रिकार्ड. Calcein 494 एनएम प्रकाश द्वारा उत्साहित है और 517 एनएम के प्रकाश का उत्सर्जन, जबकि ethidium homodimer एक 528 एनएम के प्रकाश के द्वारा और 617 एनएम के प्रकाश का उत्सर्जन. नमूना परिणाम के लिए चित्रा 4 देखें.
10. विश्लेषण तकनीक (संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद) - महत्वपूर्ण myocyte प्रोटीन के लिए immunohistochemistry :
समाधान: इस खंड में प्रयुक्त Pbs, पीबीएस में 4% paraformadehyde, 5% पीबीएस में गधा सीरम, Pbs, 0.1 एनजी / एमएल पीबीएस में 33258 Hoechst में एंटीबॉडी.
- पीबीएस में 3x 5 मिनट washes के साथ नमूने कुल्ला.
- 4 में 2-3 घंटे के लिए पीबीएस समाधान में 4%, paraformaldehyde के साथ ठीक डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस में 3x 5 मिनट washes के साथ नमूने कुल्ला.
- नमूना अब sectioned और दाग पसंद के प्रोटोकॉल के अनुसार एम्बेडेड जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के शेष भाग confocal माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के लिए पूरी निर्माण धुंधला शामिल हैं. ध्यान दें कि ऊष्मायन बार sectioned ऊतक के लिए है कि तुलना में अब कर रहे हैं के रूप में वहाँ के एंटीबॉडी के लिए और अधिक समय का निर्माण करने के लिए में फैलाना की जरूरत है. इसके अलावा, शेष चरणों के सभी कमरे के तापमान पर आयोजित की जाती हैं.
- 30 मिनट कोशिका झिल्ली permeabilize के लिए नमूने के लिए 0.1% पीबीएस में ट्राइटन एक्स जोड़ें.
- पीबीएस में 3x 10 मिनट washes के साथ नमूने कुल्ला.
- नमूने के माध्यमिक एंटीबॉडी के किसी भी गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक 1 आधा घंटे के लिए नमूने के लिए 5% पीबीएस में गधा सीरम जोड़ें.
- 43 Connexin (01:50 कमजोर पड़ने) और मायोसिन भारी चेन (1:100 मन्दन) पीबीएस में 3 घंटे के लिए नमूने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. आदेश में दोनों प्रोटीन लेबल करने के लिए लगातार आप यकीन है कि प्राथमिक एंटीबॉडी अलग मेजबान (यानी खरगोश और माउस) से कर रहे हैं बनाना चाहिए.
- पीबीएस में 3x 10 मिनट washes के साथ नमूने कुल्ला.
- 3 घंटे के लिए पीबीएस में उचित fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें.
- पीबीएस में 3x 10 मिनट washes के साथ नमूने कुल्ला
- बस से पहले इमेजिंग confocal खुर्दबीन पर नमूने, 15 मिनट के लिए 0.1 एनजी / पीबीएस में मिलीलीटर Hoechst 33258 जोड़ने.
- पीबीएस में 3x 10 मिनट washes के साथ नमूने कुल्ला.
- इमेजिंग एक confocal खुर्दबीन के साथ कोशिकाओं (देखें उदाहरण के परिणाम के लिए चित्रा 4) के द्वारा MHC और Cx43 के नमूने अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें.
11. प्रतिनिधि परिणाम / परिणाम:
cardiomyocyte आतंच निर्माण शुरू मोल्ड (चित्रा 2B) की पूरी चौड़ाई को शामिल किया गया. कोई बुलबुले के निर्माण में मौजूद है और यह पूरी लंबाई भर में समान लग रहे चाहिए. संवर्धन के दो सप्ताह के के बाद, प्रारंभिक चौड़ाई (चित्रा 2C) के 1 / 4 लगभग निर्माण अनुबंध.
जब का निर्माण हमारे कस्टम संकुचन बल डिवाइस (चित्रा 3A) में विद्युत पुस्तक है, चिकोटी बल डेटा के रूप में चित्रा 3B में दिखाया गया है उत्पन्न किया जा सकता है. तरंग MATLAB (Mathworks) में अलग से विश्लेषण बल, संकुचन की दर, और छूट की दर निर्धारित कर सकते हैं. चिकोटी बलों की लगभग 1.3 MN 6 की उम्मीद कर रहे हैं.
निर्माण के सेल व्यवहार्यता का निर्माण का निर्माण में ऑक्सीजन का प्रसार सीमाओं के कारण की गहराई पर निर्भर है. निर्माण, 4A चित्रा की सतह पर, उच्च सेल व्यवहार्यता मनाया जाता है. Confocal माइक्रोस्कोपी, 4B चित्रा के साथ, संरचना का निर्माण के गठबंधन मायोसिन भारी चेन, MHC की वजह से मनाया जाता है, संकुचन, लाल रंग में दिखाया के लिए महत्वपूर्ण है. Connexin 43, हरे रंग में दिखाया गया है, सेलुलर myocytes के बीच युग्मन के लिए आवश्यक है.
चित्रा 1: encapsulation प्रक्रिया का अवलोकन
चित्रा 2: ए) आतंच जैल बनाने के लिए अलग और संयुक्त मोल्ड भागों . Froमीटर छोड़ दिया सही करने के लिए: दो Teflon वाशर, दो सिलिकॉन O-छल्ले, एक Teflon रॉड, एक Teflon ट्यूब, एक पूरा खराद का धुरा, खराद का धुरा के लिए बाहरी आवरण है, और गोताख़ोर). बी) मोल्ड पर तुरंत बाहरी आवरण से इंजेक्शन (0 दिन) के बाद निर्माण. सी) मोल्ड पर जमा का निर्माण (लाल तीर) संस्कृति के 13 दिनों के बाद,.
चित्रा 3: ए) रिकॉर्डिंग चिकोटी बल के लिए कस्टम संकुचन बल माप प्रणाली. एक पोस्ट के साथ एक बल transducer संकुचन बल उपायों और एक कंप्यूटर में परिणाम outputs के है. स्नान दो तारों के साथ कार्बन इलेक्ट्रोड युक्त एक बिजली उत्तेजक औधधि जो का निर्माण paces के जोड़ता है. जगह में दो पदों का निर्माण पकड़ो. बी) नमूना चिकोटी बल तरंग डेटा 0.5 हर्ट्ज पर बिजली की उत्तेजना के साथ उत्पन्न.
चित्रा 4: एक) निर्माण, 13 दिन (पैमाने बार = 400 सुक्ष्ममापी) के लाइव / मृत परख. ग्रीन जीवित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है और लाल मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है. बी) मायोसिन भारी चेन (लाल), 43 Connexin (हरा) और Hoescht परमाणु दाग (नीला) (पैमाने बार = 10 सुक्ष्ममापी) के Confocal छवि.
| एफ समाधान | टी समाधान | सेल समाधान | |||
| फाइब्रिनोजन | 112 μl | थ्रोम्बिन | 17 μl | DMEM में कक्ष | 170 μl |
| HEPES | 558μl | Ca + + | 1.3 μl | ||
| DMEM | 152 μl | ||||
| कुल | 670 μl | कुल | 170 μl | कुल | 170 μl |
जेल के 1 एमएल के लिए टेबल 1. आतंच जेल समाधान, मात्रा .
नोट: = फाइब्रिनोजेन 20 मिमी HEPES में 33 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन खारा buffered
HEPES = 20 मिमी HEPES खारा buffered
थ्रोम्बिन = 25 यू / एमएल 0.81% NaCl समाधान में समाधान
Ca + + = 2 एन कैल्शियम क्लोराइड समाधान
Discussion
आतंच जैल में एक सुसंगत और व्यवहार्य myocardial प्रणाली के इन विट्रो मॉडल में तीन आयामी परिणामों में नवजात चूहे cardiomyocytes के encapsulation. आतंच एक पसंदीदा biomaterial है क्योंकि जब कोशिकाओं फँस कर रहे हैं, वे metabolically सक्रिय और compacting, remodeling और है कि देशी हृदय ऊतक 12 के साथ संगत है एक बाह्य मैट्रिक्स पुनः बनाने में सक्षम हैं. क्योंकि हम cardiomyocytes इस माहौल में खुद को संरेखित करने के लिए अनुमति देते हैं, उनकी कार्यक्षमता अधिक हृदय बड़ा संकुचन बल में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में isotropic 6 ऊतकों की तुलना में मांसपेशियों की विशेषता है. संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए, यह आवश्यक है एक सामग्री है कि दोनों व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को बढ़ावा के भीतर कोशिकाओं encapsulate. प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत आतंच नेटवर्क के लिए एक तीन आयामी microenvironment में हृदय सेल व्यवहार पर नियंत्रण बनाने के लिए एक कुशल और सटीक अर्थ प्रदर्शित.
कुछ संभावित मुद्दों और इन constructs के सृजन और संस्कृति के दौरान उत्पन्न हो सकती है. एक संभावित मुद्दा encapsulation से पहले सेल व्यवहार्यता के रखरखाव, जो काफी का निर्माण की कार्यक्षमता को प्रभावित करेगा है. प्रयास अलगाव और आतंच जेल के भीतर कोशिकाओं के encapsulation के बीच के समय को कम करने से अलगाव के बाद कोशिका मृत्यु की सीमा के लिए किया जाना चाहिए. Constructs मीडिया प्रदान की जानी चाहिए हर दूसरे दिन एक सख्त समय पर. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है के लिए इस्तेमाल समाधान के सभी में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए. यदि फाइब्रिनोजेन, थ्रोम्बिन और कोशिकाओं के मिश्रण एक विषम वातावरण पैदा करता है, कोशिकाओं की क्षमता को ईसीएम फिर से तैयार करना, यंत्रवत् जोड़े और अनुबंध संभावित बाधित है. यह भी महत्वपूर्ण है constructs के इंजेक्शन के दौरान हवाई बुलबुले के गठन को रोकने के क्रम में इंजीनियर के ऊतकों की निरंतरता में गड़बड़ी को रोकने के. इस मुद्दे को कम करने का एक तरीका अधिक जेल से सिरिंज में का निर्माण बनाने के लिए और धीरे धीरे इंजेक्षन की जरूरत है आकर्षित है. अन्त में, एक बार आतंच मैट्रिक्स सेट है और 24 घंटे के लिए संस्कृति के माध्यम में किया गया है, यह आवश्यक है का निर्माण रिंग मोल्ड के पक्ष से अलग आतंच जेल के सेल आधारित संघनन को बढ़ावा देने के. आचारण के मध्य में निर्माण को ध्यान में रखते हुए गैस और पोषक तत्वों की विनिमय की सुविधा. रिंग मोल्ड के पक्ष के पालन में भी वांछित सेलुलर संरेखण को बाधित कर सकते हैं.
यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि होश में शिरच्छेद इस प्रोटोकॉल में euthanization की विधि है, जो दोनों स्वास्थ्य और पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन के राष्ट्रीय संस्थानों से दिशा निर्देशों के तहत एक स्वीकार्य तरीका है के रूप में प्रयोग किया जाता है है. हालांकि, कुछ संस्थाओं संवेदनाहारी नवजात चूहों के लिए कत्ल के बाद उपयोग की सलाह देते हैं. हम होश में कत्ल को चुना है क्योंकि यह excised हृदय के ऊतकों / कोशिकाओं के लिए hypoxic शर्तों के तहत समय की न्यूनतम राशि सुनिश्चित करता है. Hypoxia के अपेक्षाकृत छोटे मात्रा ischemia और संभावित myocyte मृत्यु है, जो काफी इस प्रोटोकॉल के परिणामों को प्रभावित कर सकता myocyte नेतृत्व कर सकते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (अवार्ड # R00HL093358 LDB) - यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | PBS |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | PBS |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | PBS |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | Isolation |
| hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Isolation |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | Isolation |
| large scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | Isolation |
| micro-scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | Isolation |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10008-13 | Isolation |
| scalpel blade | Fisher Scientific | 08-918-5A | Isolation |
| Absorbent bench underpad | VWR international | 56617-014 | Isolation |
| sterile drape | Fisher Scientific | GM42526 | Isolation |
| autoclave bag | Fisher Scientific | 01-812-54 | Isolation |
| gauze pad | Fisher Scientific | 13-761-52 | Isolation |
| betadine | Purdue Products L.P. | 67618-150-01 | Isolation |
| sterile gloves | Fisher Scientific | 19-020 | Isolation |
| sterile transfer pipette | Fisher Scientific | 9962 | Isolation |
| collagenase | Worthington Biochemical | CLS2 | Isolation |
| Teflon rod 1/4 inch diameter | McMaster-Carr | 8546K11 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 8547K31 | Mold part |
| Silicone O-Ring 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 9396K204 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 5/16 inch OD | McMaster-Carr | 52355K14 | Mold part |
| Kendall monoject syringes 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Mold part |
| BD syringe 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Mold part |
| Bovine Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630 | Construct |
| Bovine Thrombin | Sigma-Aldrich | T7513 | Construct |
| 1 M HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Construct |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Construct |
| DMEM | Invitrogen | 10569 | Construct |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Construct |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | Construct |
| 0.2 micron filter | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Construct |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Construct |
| 0.45 micron bottle top filter | Corning | 430627 | Construct |
| glass pre-filter | EMD Millipore | AP2007500 | Construct |
| 18G 1 1/2 inch long needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Construct |
| 21G 1 inch needle | Fisher Scientific | 14-826C | Construct |
| construct jars | Fisher Scientific | 2116 | Construct |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | Media |
| horse serum | Sigma-Aldrich | H1138 | Media |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000 | Media |
| aminocaproic acid | Acros Organics | 103305000 | Media |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Media |
| insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Media |
| Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histology |
| Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella, Inc. | 27050 | Histology |
| 2-methylbutane | Fisher Scientific | 03551-4 | Histology |
| Mouse MYH1/2/4/6 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32732 | Histology |
| Rabbit Connexin 43 primary antibody | Cell Signaling Technology | 3512 | Histology |
| Dylight 549-conjugated donkey anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | Histology |
| Dylight 488-conjugated Donke anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-485-152 | Histology |
| Live/dead assay | Invitrogen | L-3224 | Analysis |
References
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