Summary
אנו מתארים את הבידוד של cardiomyocytes בילוד והכנת התאים אנקפסולציה ב בונה הפיברין הידרוג'ל של הנדסת רקמות. אנו מתארים שיטות לניתוח רקמות מהונדסות שריר הלב לאחר תקופת התרבות כולל כוח פעיל שנוצר על גירוי חשמלי ואת הכדאיות התא מכתים immunohistological.
Abstract
תאים culturing בסביבה תלת מימדית הידרוג'ל היא טכניקה חשובה לפיתוח בונה עבור הנדסת רקמות, כמו גם ללמוד התגובות הסלולר בתנאים תרבות שונים במבחנה. סביבת תלת מימדי יותר מקרוב מחקה את מה התאים להתבונן in vivo בשל היישום של גירויים מכניים וכימיים בכל הממדים 1. תלת ממדי הידרוג יכול להיות עשוי פולימרים סינתטיים כמו PEG-DA 2 ו 3 PLGA או מספר המתרחשים באופן טבעי חלבונים כגון קולגן 4, חומצה היאלורונית 5 או 6,7 הפיברין. הידרוג שנוצרו פיברין, חלבון טבעי קרישת דם, יכול לפלמר להקים רשת שהיא חלק ריפוי הפצע הטבעית של הגוף תהליכים 8. הפיברין הוא תא מתכלה ו עצמיים פוטנציאל 9, מה שהופך אותו פיגום זמני אידיאלי עבור הנדסת רקמות.
כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הבידוד של cardiomyocytes בילוד משלושה הישן יום גורים עכברוש והכנת התאים אנקפסולציה ב בונה הפיברין הידרוג'ל של הנדסת רקמות. Myocytes ילודים הם מקור התא הנפוצות עבור במבחנה להיווצרות רקמת לב והנדסה 4. הפיברין ג'ל נוצר על ידי ערבוב עם פיברינוגן האנזים תרומבין. טרומבין cleaves fibrinopeptides FPA ו FpB של פיברינוגן, חושפים אתרי הקישור כי אינטראקציה עם מונומרים אחרים 10. אינטראקציות אלה גורמים מונומרים כדי עצמית להרכיב לתוך הסיבים היוצרים את רשת הידרוג'ל. בגלל העיתוי של תגובה אנזימטית זה יכול להיות מותאם על ידי שינוי יחס של תרומבין כדי פיברינוגן, או היחס בין סידן תרומבין, זריקה אחת יכולה לעצב את המבנים עם מספר גאומטריות שונות 11,12. יתר על כן אנו יכולים ליצור מערך של הרקמה וכתוצאה מכך על ידי האופן שבו אנו להגביל את הג'ל במהלך התרבות 13.
לאחר culturing המבנים מהונדסים ברקמת הלב במשך שבועיים בתנאים סטטי, התאים לב החלו לשפץ לבנות יכול ליצור כוח התכווצות בתנאים צעדה חשמליים 6. במסגרת פרוטוקול זה, אנו גם מתארים את שיטות לניתוח רקמות מהונדסות שריר הלב לאחר תקופת התרבות כולל ניתוח פונקציונלי של הכוח שנוצר על ידי פעילות שריר הלב לבנות על גירוי חשמלי, כמו גם שיטות לקביעת כדאיות התא הסופי (Live-המלח assay) ו מכתים immunohistological לבחון את הביטוי של חלבונים מורפולוגיה טיפוסית חשוב התכווצות (שרשרת כבדה שרירן או MHC) ו צימוד הסלולר (Connexin 43 או Cx43) בין myocytes.
Protocol
1. בידוד cardiomyocyte ילודים - הכנה (יום לפני)
פתרונות שנוצר בסעיף זה: PBS-גלוקוז הפתרון, להפסיק התקשורת.
- הכן פתרון PBS-גלוקוז ע"י הוספת 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (100 יחידות / מ"ל ו - 100 מיקרוגרם / מ"ל בהתאמה) ו 1.98 גרם של גלוקוז אל פוספט 1x 250 מ"ל סטרילי בופר סליין (PBS) ולהביא פתרון בנפח 500 מ"ל עם נוספים סטרילי 1x PBS.
- הכן להפסיק התקשורת על ידי הוספת 25 מ"ל FBS ו - 5 מ"ל של סטרפטומיצין, פניצילין (ריכוז כנ"ל) עד בינוני השתנה 250 מ"ל סטרילי Dulbecco של הנשר (DMEM) ולהביא את נפח 500 מ"ל עם DMEM סטרילי לפני סינון סטרילי דרך 0.2 מיקרון המסנן.
- לעקר כלי ניתוח הדרושים בידוד ידי מעוקר: hemostat, # 5 מלקחיים, מספריים גדולים, מיקרו מספריים, וידית אזמל (# 4).
2. בידוד cardiomyocyte ילודים - הכנה (יום קציר)
הקפד לשמור על סטריליות
פתרונות השתמשו בסעיף זה: PBS-גלוקוז, בבטאדין פתרון
- במשך כל המלטה, לקחת את שני סטרילי 100 מ"מ בצלחות פטרי, למקם אותם מכסה המנוע להתמלא מ"ל 10 ~ של גלוקוז-PBS קר כקרח. אז אלו צריכים להיות ממוקמים בתוך דלי קרח מלא קרח מכסה את התרבות סטרילית.
- מניחים כוס 250 מ"ל עם 30-40 מ"ל של בבטאדין לתוך מכסה המנוע.
- הוסף 50 מ"ל / המלטה של גלוקוז-PBS לתוך בקבוק חותם, ואת המקום לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- עבור כל אדם, מקום ספסל סופג underpad על משטח העבודה מכסה המנוע במקום לעטוף סטרילי על גבי נזהר שלא לגעת לעבוד במרכז שטח של הווילון הסטרילי. דאמפ מכשירי ניתוח וכן 4 X 4 תחבושת על וילון הסטרילי בלי לגעת במכשירים. פתח להב # 20 אזמל סטרילי dump על וילון, שוב נזהר שלא לגעת עם הלא סטרילית כפפות.
- קח את הגורים מן הסכר ואת המקום לתוך מיכל אטום, גורים מקום לתוך מכסה המנוע
- שים כפפות סטריליות
- מקפלים את גזה לתוך רבעים, מלחציים עם hemostat ומקום לתוך כוס בבטאדין.
- שים את להב סכין המנתחים בידית אזמל ומניחים בצד.
3. בידוד cardiomyocyte ילודים - דיסקציה לב
פתרונות השתמשו בסעיף זה, בבטאדין PBS-גלוקוז פתרון
- תרימי את הגור ביד הלא דומיננטית על ידי העור צובט בין השכמות בין האגודל לאצבע המורה. בעזרת מספריים גדולים, לערוף את הגור בחיתוך אחד. הקפידו לחתוך מהחלק האחורי של קדימה הגור, כדי להבטיח את עמוד השדרה הוא ניתק לחלוטין.
- החזה ספוגית הגור של עם גזה בבטאדין ספוג. אבטח את הגור על ידי צובט השכמות יחד. ביצוע פתיחת בית החזה כדי לחשוף את חלקי הלב. הגדלת הלחץ המופעל, ובכך לאלץ את הלב בעבר צלעות לנתיחה scalpular.
- הפעל את הלהב אזמל מאחורי הלב לנתק את כלי נהדר ולהסיר את הלב. מניחים את הלב בצלחת פטרי המכילה גלוקוז-PBS כי הוא על הקרח.
- חזור על שלבים 1-3 עבור כל גור בבלגן.
4. בידוד cardiomyocyte ילודים - בידוד myocyte
פתרונות נוצר / השתמשו בסעיף זה: PBS-גלוקוז, פתרון פתרון collagenase, להפסיק פתרון
- לאחר לבבות היו מבודדים, להסיר את כל שרידי דם ורקמות החיבור על ידי שטיפה ב קר כקרח פתרון PBS גלוקוז, להסיר את החלק העליון 1 / 3 של הלב על מנת לבודד רק את רקמת חדרית מקום לתוך צלחת פטרי עם טרי קר כקרח גלוקוז PBS, שהוכן קודם לכן.
- בזהירות לקצץ את ליבם אל ~ 1 מ"מ מעוקב באמצעות מיקרו מספריים מלקחיים.
- קחו להעביר פיפטה סטרילית, לחתוך את קצה באמצעות מספריים, כך הפה של פיפטה הוא ~ 3 מ"מ קוטר. השתמש פיפטה להעביר את פיסות רקמה וכל הפתרון לתוך 50 מ"ל חרוטי ומניחים על קרח.
- לשקול את 15,000 יחידות בכל המלטה של גורים מסוג II collagenase (יחידות / מ"ג תלוי במגרש) ומקום לבקבוק של 37 ° C-PBS חימם גלוקוז מוכן קודם לכן ליצור פתרון collagenase. מערבבים היטב, לסנן לתוך בקבוק סטרילי נפרד. המקום חזרה לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מניחים את פתרון להפסיק לתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים גם כן.
- אפשר רקמות טחון ליישב לתחתית הצינור צנטריפוגות. הסר את supernatant עד נפח הכולל הוא ~ 10 מ"ל. הוסף 7 מ"ל של תמיסת collagenase אל הצינור צנטריפוגות.
- הכניסו את צינור חרוטי עם פיסות רקמות collagenase לתוך מתלה צינור על שייקר ההקפה בתוך 37 ° C חממה או בתנור. הפעל את שייקר מסלולית על בכ 60 סל"ד ולסגור את הדלת. הגדרת טיימר במשך 7 דקות. הקפידו למקם את BAC collagenasek לאמבטיה מים כדי לשמור אותו חם.
- כאשר השעון מצלצל, להחזיר את חרוטי לתוך מכסה המנוע. כמו כן להביא את collagenase חם להפסיק פתרון לתוך מכסה המנוע. לכיל בעדינות את חתיכות רקמה 5-7 פעמים כדי לשבור אותם. לאחר טיטרציה, לאפשר חתיכות כדי ליישב לתחתית (2-3 דקות). לשאוב משם כמה שיותר supernatant ככל האפשר נזהר מאוד לא למצוץ את פיסות רקמה. לאחר מכן, להוסיף 7 מ"ל של תמיסת collagenase את פיסות רקמות מקום בחזרה לתוך החממה על שייקר במשך 7 דקות.
- לכל שלב הנותרים, בעדינות לכיל 10 פעמים לשבור את פיסות רקמה. לאחר פיסות הרקמה להתיישב, לצייר את supernatant את ולאסוף אותו מ"ל 50 חרוטי נפרד. הוסף 7 מ"ל של collagenase את פיסות רקמות לעכל שוב במשך 7 דקות. כדי הצינור supernatant, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת להפסיק עם טפטפת סרולוגיות שונות לאחר כל הוספה של supernatant מ העיכול.
- חזור על הפעולה עד שכל collagenase נעשה שימוש (7 צעדים בסך הכל).
- לאחר שלב העיכול הסופי, לקחת את חרוט עם פתרון התא ולסנן דרך מסננת לתוך תא 70μm חרוטי טריים.
- ספין התאים לעבר 100 גרם במשך 5 דקות ו resuspend ב 20 מ"ל של DMEM להימנות באמצעות hemocytometer, והמקום התאים על הקרח.
- מקום 50 μl של תאים לתוך פתרון Trypan כחול (75 μl Trypan כחול, 125 μl PBS), ומערבבים היטב לפני הצבת 10 μl ב hemocytometer עבור לספור. תאים חיים הם ברורים תוך התאים המתים כחולות. צפו כ -3 מיליון תאים לכל חולדה סיירים, עם יכולת הקיום של כ 80-90%.
5. יציקה הפיברין בונה ג'ל - הכנה ליצירת הפיברין ג'לים (כל הכבוד מראש)
פתרונות שנוצר בסעיף זה: המניה פיברינוגן פתרון, פתרון תרומבין המניות, Pluronics פתרון, מדיה לבנות שריר הלב.
- הכן 33 מ"ג / מ"ל פתרון המניות של פיברינוגן במאגר 20 מ"מ HEPES ב 0.9% מלוחים ידי פיברינוגן ערבוב לאט לתוך HEPES שנאגרו מלוחים לאורך מספר שעות ב 37 ° C. אפשר פתרון ליישב בין לילה ב 2-8 ° C. חם הפתרון 37 ° C. הפתרון הוא סינון סטרילי דרך סדרה של מסננים ברציפות: תא 40 מיקרומטר מסננות, בקבוק 0.45 מיקרומטר מסננים העליונה עם זכוכית טרום מסננים, בקבוק 0.2 מיקרומטר מסננים העליונה עם זכוכית טרום מסננים. הפתרון הוא aliquoted לתוך מ"ל 1 ו -3 aliquots מ"ל ומאוחסנים ב -20 ° C.
- הכן 25 U / mL פתרון המניות של תרומבין על ידי הוספת 500 U של תרומבין על 18 מ"ל של תמיסת מלח 0.9% ו - 2 מ"ל של מים deionized סטרילי, מסנן סטרילי דרך aliquot, 0.2 מיקרומטר לסנן לתוך μl 500 ו - 250 μl aliquots ולהקפיא בבית -80 ° C.
- הכינו 5% w / v Pluronics F-127 פתרון, על ידי המסת 50 גרם של Pluronics F-127 עד 700 מ"ל מים deionized. תביאו נפח פתרון עד 1 ליטר מים deionized נוספים. סינון סטרילי עם מסנן 0.2 מיקרומטר. הפתרון Pluronics יכול לשמש עד שלוש פעמים לפני החלפת אם סטרילי מסונן לאחר כל שימוש.
- הכן לבבי לבנות מדיה ידי הוספת סוס בסרום של 10%, 2% בסרום שור עוברית, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, 6 מ"ג / מ"ל, aminocaproic חומצה לתוך DMEM. 50 מיקרוגרם / מ"ל של חומצה אסקורבית ו 2 מיקרוגרם / מ"ל של אינסולין 25 מיקרומטר HEPES צורך להוסיף מיד לפני האכלה.
- להרכיב mandrel ידי הצבת אחד ביחד מוט טפלון, אחת שרוול טפלון, שתי דיסקיות טפלון עם חריץ הוסרו לצורך הזרקה, ושני גומי טבעות אטימה (ראה איור 2 א). החיטוי לפני השימוש.
- קח תרמילי מזרק 6cc עבור החלק החיצוני של התבנית ואת תרמילי מזרק 3cc לשמש בוכנות, ולהכינם ידי ניתוק luer נעילת מסתיים מעוקר (ראה איור 2 א).
6. יציקה הפיברין בונה ג'ל - לקראת יצירת ג'לים הפיברין (מימין לפני ביצוע בונה ג'ל הפיברין)
פתרונות השתמשו בסעיף זה: פתרון Pluronics
- סינון סטרילי Pluronics 5% F-127 פתרון עם 0.2 מיקרומטר לסנן לפני השימוש. המקום mandrels ואת תרמילי מזרק לתוך פתרון Pluronics 5% 1 כוס L בשכונה. השאירו את החלקים השריה בתמיסה Pluronics עבור 2-3 שעות למכסה המנוע, כדי להבטיח ציפוי להשלים. הפתרון Pluronics המעילים mandrels ומונע את הג'ל הפיברין מתוך דבקות mandrels.
- לאחר דגירה 2-3 שעות, לשפוך את הפתרון של 5% Pluronics בחזרה לתוך הבקבוק, מקום סטרילי וילונות מטה על פני השטח של מכסה המנוע ללבוש כפפות סטריליות לבנות את תבניות.
- מניחים את mandrels נבנה לתוך מזרק 6 תרמילי סמ"ק, באמצעות מזרק 3cc כמו הבוכנה כדי להבטיח חותם הדוק בין O-טבעות דיסקיות טפלון.
7. יציקה הפיברין ג'ל בונה באמצעות הזרקה
פתרונות שנוצר בסעיף זה: פתרון F, T פתרון, פתרון התא.
- כדי להפוך 1 מ"ל של ג'ל הפיברין (3.3 מ"ג / מ"ל ריכוז פיברינוגן הסופי, 25 U / mL הריכוז הסופי תרומבין), ליצור F פתרון צינור חרוטי, על ידי הוספת 112 μl של המניה ל פיברינוגן 558 μl של הצפת 20 מ"מ HEPES ב תמיסת מלח 0.9%. בתוך צינור חרוטי נפרד, ליצור פתרון T על ידי הוספת 17 μl של המניה תרומבין, ו 1.3 μl של 2 N Ca + + פתרון μl 135 של DMEM. ראה לוח 1.
- בתוך צינור חרוטי שלישי, להכין פתרון התא על ידי ספינינג את התאים resuspending התאים נפח, כך הריכוז של התא הוא 29,400,000 תאים / מ"ל או 6 פעמים ריכוז ריכוז הסופית הרצויה של תאים לבנות את
- כאשר אתה מוכן להטיל את הג'ל הפיברין לבנות, הכנה מזרק 1 מ"ל עם מחט 18G ½ 1 ס"מ ארוך. האם מחט 21G 1 אינץ מוכן גם כן.
- הפתרון הפיברין נוצר על יחס 04:01:01 של פתרון פריץ: פתרון T: פתרון התא. כדי לעשות אחד מ"ל של ג'ל, להוסיף 667 μL של פתרון F לתוך צינור צנטריפוגות נקי של 50 מ"ל, ואחריו μL 167 הפתרון הנייד, ולבסוף להוסיף 167 μl של פתרון טי. פיפטה לערבב פתרון יחד נזהרים שלא להציג בועות. ברגע פתרונות מעורבבים, התגובה החלה את הזריקה של בונה את צריכה להיעשות באופן מיידי.
- קח את המזרק מוכן בעבר עם מחט 18G ו להכין פתרון הפיברין. יש להיזהר שלא להפוך את המזרק כדי למנוע בועות להגיע אל המחט. החלפת מחט 18G עם מחט 21G. הקש על המזרק בעדינות כדי להוציא בועות אוויר.
- הכנס מזרק לתוך תבנית בין הפקק לבין מעטפת הבאים החריץ של טפלון O-Ring ו להזריק את הפתרון לתוך התבנית. הטו את התבנית עם החריץ על גבי כדי להבטיח מילוי מלא. הסר את המזרק ולהמשיך למלא תבניות הנותרים. הפתרון ג'ל מספיק ניתן ליצור למלא תבניות מספר באותו זמן. עם זאת, כי הפתרון ג'ל מהר, זה בדרך כלל מומלץ להגביל את מספר המבנים מוזרק בכל זמן נתון עד 6.
- עטפו את תבניות ב Parafilm בקבוצות של שלושה ומקום בחממה או בתנור על 37 ° C. אפשר הג'לים כדי לדגור על תבניות במשך 20 דקות כדי לאפשר זמן ג'ל כדי לפלמר.
- ממלאים כל צנצנת תרבות (Nalgene ישר בצד צנצנת) עם 21 מ"ל של מדיום לבנות שריר הלב לכל לבנות. השתמש במזרק סטרילי 3 סמ"ק מעטפת כמו הבוכנה לכוח mandrel עם הקמת לתוך צלחת פטרי גדולה עם DMEM. אז במקום לבנות לצנצנת הדגימה. כל צנצנת 16 גרם יכול להחזיק עד 6 בונה, בעוד כל צנצנת 4 גרם יכול להחזיק 2.
- בורג כמוסות על הצנצנות ולהעבירם החממה. בתוך האינקובטור, לשחרר את כובעי על הצנצנות כדי לאפשר חילוף הגזים.
- לאחר 24 שעות, לקחת לאסוף שיניים סטרילית לדחוף את לבנות הרחק טפלון לבן O-טבעות על קצות עובש את הטבעת על מנת להבטיח יישור אחיד של לבנות (ראה תרשים 2 בתוצאות נציג).
8. ניתוח טכניקות (לאחר 2 שבועות בתרבות) - כוח בדיקות התכווצות
פתרונות השתמשו בסעיף זה: DMEM, לבבי לבנות התקשורת.
- קלאמפ קליפים תנין על להוביל את המגיע ממריץ אל חוטי על האלקטרודות באמבטיה. כוח מעלה הלוח רכישת נתונים, גנרטור הדופק, ואת מתמר כוח. מתמר כוח צריך להיות מופעל להגדרה 5g ו מאופס. פתח תוכנית אישית LabVIEW המציג ושומר את הנתונים מתמר כוח. יצירת קובץ חדש, טקסט ריק בתיקייה נתונים עבור כל דגימה.
- המקום DMEM לתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים ולאפשר זמן לזה להתחמם לפני בדיקת בונה. חימם פעם, מקום 37 ° C DMEM לאמבטיה בינוני של מערכת מדידה כוח (ראה איור 3A).
- הסר את לבנות מצנצנת המדגם על ידי הזזה בעדינות את הטבעת לבנות מתמיכה טפלון עם פינצטה והמקום לבנות על הפוסט מתכת קבוע בתוך אמבט למדידת כוח במערכת בינוני. אין אחיזה לבנות עם פינצטה! במקום זאת, להשתמש בפינצטה כדי לדחוף ולהרים את לבנות את התמיכה mandrel.
- מניחים את הקצה השני של לבנות את הזרוע מעל מתמר והדק עד מתמר קורא 0.50V, (כ 1.0 גרם בכוח או 10 millinewtons מתח)
- בחר את קובץ הטקסט עבור חיל נתונים התכווצות שיירשמו אל.
- ביום ממריץ הלב (דגם # S88X, טכנולוגיות דשא), להגדיר את הדופק כדי מתח 20V (8 V / cm), משך 6ms, ושיעור של 1 הרץ.
- הפעל את צעדה חשמלי על ידי לחיצה על "פלט on / off" כפתור
- התחל הקלטה עד waveform הופך קבוע.
- הסר בזהירות את לבנות מן אמבט למדידת כוח במערכת בינוני ולמקם אותו בחזרה בינוני תרבות. ואז להסיר את DMEM מן האמבט מערכת מדידה כוח בינוני להחליף עם טרי, חם DMEM לנתח additדגימות לאומיים.
- חותכים את לבנות ולפרוש אותו, כך שאתה יכול למדוד את אורך ורוחב של לבנות את
- חותכים את לבנות למקטעים כדי לשמש למדידות נוספות כולל ניתוח כדאיות, היסטולוגיה, או מדידות כתם המערבי.
9. ניתוח טכניקות (לאחר 2 שבועות בתרבות) - Live-המלח Assay עבור הכדאיות (עם Assay Live / Dead Invitrogen) 14:
פתרונות השתמשו בסעיף זה: EthD-1 פתרון המניות, calcein AM מניות פתרון PBS
- לשטוף עם דגימות שוטף 5 דקות 3x ב PBS.
- הוסף 20 μl של 2 מ"מ EthD-1 פתרון המניות של 10 מ"ל סטרילי PBS ו מערבולת כדי להבטיח ערבוב יסודי.
- הוסף μl 5 מ"מ 4 calcein AM stolution מניות לפתרון EthD-1. שוב, מערבולת כדי להבטיח ערבוב יסודי.
- הוספת נפח מספיק של הפתרון לעיל כדי לכסות את לבנות.
- דגירה מכוסה (כדי למנוע photobleaching של צבעים) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את צובעת ולהחליף PBS חם. לצפות ולהקליט תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Calcein הוא נרגש על ידי אור 494 ננומטר ופולט אור 517 ננומטר, בעוד ethidium homodimer-1 הוא על ידי האור 528 ננומטר ופולט אור 617 ננומטר. ראה איור 4 תוצאות המדגם.
10. ניתוח טכניקות (לאחר 2 שבועות בתרבות) - אימונוהיסטוכימיה עבור חלבונים myocyte חשובים:
פתרונות השתמשו בסעיף זה: PBS, paraformadehyde 4% ב-PBS, סרום חמור 5% ב-PBS, נוגדנים PBS, 0.1 ng / mL Hoechst 33258 ב PBS.
- לשטוף עם דגימות שוטף 5 דקות 3x ב PBS.
- תקן עם paraformaldehyde 4% פתרון PBS, במשך 2-3 שעות 4 ° C
- לשטוף עם דגימות שוטף 5 דקות 3x ב PBS.
- המדגם יכול להיות מוטבע, מחולק ומוכתמת לפי הפרוטוקול של בחירה. החלק הנותר של פרוטוקול זה מכסה מכתים לבנות עבור כל הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal. שים לב כי פעמים הדגירה הם יותר כי רקמת מחולק כמו שיש צריך להיות יותר זמן הנוגדנים לנטרל לתוך לבנות. בנוסף, כל השלבים הנותרים מתנהלים בטמפרטורת החדר.
- הוסף 0.1% Triton-X ב PBS על דגימות במשך 30 דקות כדי permeabilize את ממברנות התאים.
- שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS.
- הוסף בסרום חמור של 5% PBS על דגימות 1 שעות וחצי כדי לחסום כל מחייב הלא ספציפית של הנוגדן משני המדגמים.
- הוסף Connexin 43 (01:50 דילול) ואת שרשרת שרירן כבד (1:100 דילול) נוגדנים העיקרי PBS על דגימות במשך 3 שעות. כדי תווית הן חלבונים ברציפות עליך לוודא כי נוגדנים העיקריים הם מהמארחים שונים (כלומר ארנב ועכבר).
- שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS.
- הוסף את הנוגדנים המתאימים משני שכותרתו fluorescently ב PBS במשך 3 שעות.
- שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS
- רגע לפני הדמיה דגימות על מיקרוסקופ confocal, להוסיף 0.1 ng / ml Hoechst 33258 ב PBS במשך 15 דקות.
- שוטפים את דגימות עם שוטף 10 דקות 3x ב PBS.
- ניתוח ביטוי דגימות של MHC ו Cx43 ידי התאים דימות באמצעות מיקרוסקופ confocal (ראה תרשים 4 לתוצאה למשל).
11. נציג / תוצאות תוצאות:
Cardiomyocyte הפיברין לבנות תחילה מכסה את כל רוחב של עובש (2B איור). בועות לא צריך להתקיים לבנות ואת זה צריך להיראות אחיד לאורך כל אורכו. אחרי שבועיים של culturing, חוזה לבניית כ 1 / 4 של רוחב הראשוני (איור 2C).
כאשר היא לבנות בקצב חשמלית ב אישית למכשיר שלנו בכוח התכווצות (איור 3A), חיל נתונים עווית יכול להיווצר כפי שמוצג באיור 3 ב. Waveform ניתן לנתח בנפרד MATLAB (MathWorks) כדי לקבוע את הכוח, שיעור התכווצות, ושיעור הרפיה. כוחות עווית של כ 1.3 MN צפויים 6.
הכדאיות של הקמת תא תלוי בעומק לבנות, בשל מגבלות דיפוזיה של חמצן לתוך לבנות. על פני השטח של לבנות, תרשים 4 א, כדאיות התא גבוה הוא ציין. עם מיקרוסקופיה confocal, איור 4B, המבנה מיושר של לבנות את הוא ציין בשל שרשרת שרירן כבד, MHC, חשוב התכווצות, באדום. Connexin 43, המוצג ירוק, הוא הכרחי עבור צימוד בין myocytes הסלולר.
איור 1: סקירה כללית של תהליך אנקפסולציה
איור 2: א) חלקים עובש נפרדת בשילוב ליצירת ג'ל הפיברין. הלוך ושובמ 'משמאל לימין: שני מנקי טפלון, שני סיליקון O-טבעות, מוט טפלון, צינור טפלון, mandrel הושלמה, מעטפת חיצונית עבור mandrel, ואת הבוכנה). ב) בנה על עובש מיד לאחר פליטה מן מעטפת החיצונית (יום 0). ג) לבנות דחוסות על עובש (חץ אדום), לאחר 13 ימים של תרבות.
איור 3: א) צמצום כוח מותאם אישית מדידה מערכת כוח עווית ההקלטה. מתמר כוח עם לכתוב מודד את כוח התכווצות ופלט את התוצאות למחשב. אמבט המכיל שתי אלקטרודות פחמן עם חוטים מתחבר גירוי חשמלי אשר צעדים לבנות. שתי ההודעות להחזיק לבנות במקום. ב) עווית לדוגמא כוח waveform נתונים שנוצר עם גירוי חשמלי ב 0.5 הרץ.
איור 4: assay) Live / Dead של לבנות, יום 13 (בר בקנה מידה = 400 מיקרומטר). הירוק מייצג את תאים חיים אדום מייצג את התאים המתים. ב) תמונה Confocal שרשרת שרירן כבד (אדום), Connexin 43 (ירוק) Hoescht גרעיני כתם (כחול) (בר בקנה מידה = 10 מיקרומטר).
| F פתרון | T פתרון | תא פתרון | |||
| פיברינוגן | 112 μl | טרומבין | 17 μl | תאים DMEM | Μl 170 |
| HEPES | 558μl | Ca + + | Μl 1.3 | ||
| DMEM | 152 μl | ||||
| סך הכל | 670 μl | סך הכל | Μl 170 | סך הכל | Μl 170 |
1. טבלת הפיברין פתרונות ג'ל, כמויות של 1 מ"ל של ג'ל.
הערה: פיברינוגן = 33 מ"ג / מ"ל פיברינוגן ב 20 mM HEPES שנאגרו מלוחים
HEPES = 20 mM HEPES שנאגרו מלוחים
טרומבין = 25 U / mL פתרון פתרון 0.81% NaCl
Ca + + N = 2 סידן כלוריד פתרון
Discussion
אנקפסולציה של עכברוש cardiomyocytes בילוד בתוצאות הפיברין ג'לים ב עקבית ובת קיימא תלת מימדי במודל מבחנה של מערכת שריר הלב. הפיברין הוא ביולוגי העדיפו כי כאשר תאים בפח, הם פעילים מבחינה מטבולית ומסוגלים הדחיסה, שיפוץ מחדש תאי מטריקס העולה בקנה אחד עם רקמת לב יליד 12. מכיוון שאנו מאפשרים cardiomyocytes כדי ליישר את עצמם בסביבה זו, הפונקציונליות שלהם אופיינית יותר של שריר הלב וכתוצאה מכך צמצום כוח גדול יותר בהשוואה לרקמות איזוטרופיים 6. עבור לפוטנציאל הריפוי, יש צורך לתמצת תאים בתוך חומר שמקדם הן כדאיות ופונקציונליות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים אמצעי יעיל ומדויק ליצירת רשת הפיברין לשלוט בהתנהגות התא לב ב microenvironment תלת ממדי.
כמה בעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר במהלך היצירה והתרבות של המבנים הללו. נושא אחד הוא פוטנציאל החזקת כדאיות התא לפני אנקפסולציה, אשר השפיעו באופן משמעותי על הפונקציונליות של לבנות. מאמץ צריך להיעשות כדי להגביל מוות של תאים בעקבות הבידוד ידי צמצום הזמן בין בידוד לבין אנקפסולציה של תאים בתוך הג'ל הפיברין. בונה יש לספק תקשורת בכל יום אחר בלוח זמנים קפדני. בנוסף, חשוב לוודא הומוגניות בתוך כל הפתרונות בשימוש. אם תערובת של פיברינוגן, תרומבין ותאי מייצרת בסביבה הטרוגנית, היכולת של התאים לשפץ את ECM, מכנית הזוג חוזה חסום פוטנציאלי. חשוב גם כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר במהלך הזריקה של מבנים על מנת למנוע הפרעות ברצף של הרקמה מהונדסים. אחת הדרכים להקל על בעיה זו היא למשוך ג'ל יותר נדרש כדי להפוך את לבנות לתוך המזרק ולהזריק לאט. לבסוף, לאחר מטריקס הפיברין קבע ומאז בינוני התרבות במשך 24 שעות, חיוני לנתק את לבנות מן הצדדים של עובש את הטבעת על מנת לקדם את הדחיסה מבוססי תאים של הג'ל הפיברין. שמירה על מבנה באמצע התבנית מקלה גז חילופי מזין. דבקות הצדדים של עובש את הטבעת עשויה גם לשבש את מערך הסלולר הרצוי.
חשוב לציין כי עריפת ראש מודע משמש שיטת euthanization בפרוטוקול זה, אשר מהווה שיטה מקובלת לפי הנחיות משני המכונים הלאומיים לבריאות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית. עם זאת, מוסדות מסוימים ממליצים להשתמש הרדמה ואחריו עריפת ראש לחולדות הילוד. בחרנו עריפת ראש מודע כי זה מבטיח את כמות מזערית של זמן, בתנאים של חוסר חמצן ברקמות הלב / תאים נכרת. כמויות קטנות יחסית של חוסר חמצן עלולה להוביל myocyte איסכמיה ומוות myocyte פוטנציאל, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות של פרוטוקול זה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים - הלאומי ללב, ריאות ודם המכון (פרס # R00HL093358 כדי LDB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | PBS |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | PBS |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | PBS |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | Isolation |
| hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Isolation |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | Isolation |
| large scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | Isolation |
| micro-scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | Isolation |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10008-13 | Isolation |
| scalpel blade | Fisher Scientific | 08-918-5A | Isolation |
| Absorbent bench underpad | VWR international | 56617-014 | Isolation |
| sterile drape | Fisher Scientific | GM42526 | Isolation |
| autoclave bag | Fisher Scientific | 01-812-54 | Isolation |
| gauze pad | Fisher Scientific | 13-761-52 | Isolation |
| betadine | Purdue Products L.P. | 67618-150-01 | Isolation |
| sterile gloves | Fisher Scientific | 19-020 | Isolation |
| sterile transfer pipette | Fisher Scientific | 9962 | Isolation |
| collagenase | Worthington Biochemical | CLS2 | Isolation |
| Teflon rod 1/4 inch diameter | McMaster-Carr | 8546K11 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 8547K31 | Mold part |
| Silicone O-Ring 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 9396K204 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 5/16 inch OD | McMaster-Carr | 52355K14 | Mold part |
| Kendall monoject syringes 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Mold part |
| BD syringe 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Mold part |
| Bovine Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630 | Construct |
| Bovine Thrombin | Sigma-Aldrich | T7513 | Construct |
| 1 M HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Construct |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Construct |
| DMEM | Invitrogen | 10569 | Construct |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Construct |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | Construct |
| 0.2 micron filter | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Construct |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Construct |
| 0.45 micron bottle top filter | Corning | 430627 | Construct |
| glass pre-filter | EMD Millipore | AP2007500 | Construct |
| 18G 1 1/2 inch long needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Construct |
| 21G 1 inch needle | Fisher Scientific | 14-826C | Construct |
| construct jars | Fisher Scientific | 2116 | Construct |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | Media |
| horse serum | Sigma-Aldrich | H1138 | Media |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000 | Media |
| aminocaproic acid | Acros Organics | 103305000 | Media |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Media |
| insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Media |
| Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histology |
| Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella, Inc. | 27050 | Histology |
| 2-methylbutane | Fisher Scientific | 03551-4 | Histology |
| Mouse MYH1/2/4/6 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32732 | Histology |
| Rabbit Connexin 43 primary antibody | Cell Signaling Technology | 3512 | Histology |
| Dylight 549-conjugated donkey anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | Histology |
| Dylight 488-conjugated Donke anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-485-152 | Histology |
| Live/dead assay | Invitrogen | L-3224 | Analysis |
References
- Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype. Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).
- Guarnieri, D. Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters. Acta. 6, 2532-2539 (2010).
- Krebs, Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering. Acta. 5, 2847-2859 (2009).
- Zimmermann, W. -H. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature. 12, 452-458 (2006).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis. Tissue engineering. 15, (2009).
- Black, L. D. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).
- Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).
- Jockenhoevel, S. Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).
- Ryan, E. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Williams, C. Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs. Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).
- Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. A fibrin-based arterial media equivalent. Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.
- Invitrogen. >LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells. , Invitrogen. (2005).
