Summary
Vi beskriver isolering av neonatal cardiomyocytes och utarbetandet av cellerna för inkapsling i fibrin hydrogel konstruktioner för tissue engineering. Vi beskriver metoder för att analysera vävnadstekniska hjärtmuskeln efter den kultur perioden inklusive aktiv kraft som genereras på elektrisk stimulering och cellviabiliteten och immunohistological färgning.
Abstract
Odling celler i ett tredimensionellt hydrogel miljön är en viktig teknik för att utveckla konstruktioner för tissue engineering samt studera cellulära svaren under olika odlingsförhållanden in vitro. Den tredimensionella miljön närmare härmar vad de celler observera in vivo till följd av tillämpningen av mekaniska och kemiska stimuli i alla dimensioner 1. Tredimensionella hydrogeler kan antingen göras från syntetiska polymerer, såsom PEG-DA 2 och PLGA 3 eller flera naturligt förekommande proteiner som kollagen 4, hyaluronsyra 5 eller fibrin 6,7. Hydrogeler skapas från fibrin, ett naturligt förekommande blodkoagulering protein, kan polymeriseras och bildar ett nät som är en del av kroppens naturliga sårläkningen processer 8. Fibrin är cell-nedbrytbart och potentiellt autologa 9, vilket gör det till en idealisk temporär klätterställning för tissue engineering.
Här beskriver vi i detalj isoleringen av neonatal cardiomyocytes från tre dagar gamla råttungar och utarbetandet av cellerna för inkapsling i fibrin hydrogel konstruktioner för tissue engineering. Neonatal myocyter är en vanlig cell källa för in vitro-studier i hjärtvävnad bildning och teknik 4. Fibrin gel skapas genom att blanda fibrinogen med enzymet trombin. Trombin klyver fibrinpeptider Fpa och FPB från fibrinogen, avslöjar bindningsställen som samverkar med andra monomerer 10. Dessa interaktioner orsaka monomerer att själv montera in i fibrerna som utgör hydrogelen mesh. Eftersom tidpunkten för denna enzymatiska reaktionen kan justeras genom att ändra förhållandet mellan trombin till fibrinogen, eller förhållandet mellan kalcium till trombin, kan en injektion mögel konstruerar med en rad olika geometrier 11,12. Vidare kan vi generera anpassning av den resulterande vävnaden av hur vi begränsa gelen under kultur 13.
Efter odling de tekniska hjärtvävnad konstruktioner i två veckor under statiska förhållanden, har hjärt-cellerna börjat bygga om bygga och kan generera en sammandragning styrka under elektriska stimuleringen villkor 6. Som en del av detta protokoll, beskriver vi också metoder för att analysera vävnadstekniska hjärtmuskeln efter den kultur perioden inklusive funktionell analys av den aktiva kraft som genereras av hjärtmuskeln bygga på elektrisk stimulering, liksom metoder för att fastställa slutlig cellviabiliteten (Live-Dead assay) och immunohistological färgning för att undersöka uttrycket och morfologi av typiska proteiner viktiga för kontraktion (myosin heavy chain eller MHC) och cellulära koppling (connexin 43 eller Cx43) mellan myocyter.
Protocol
1. Neonatal cardiomyocyte isolering - beredning (dagen innan)
Lösningar som skapats i detta avsnitt: PBS-glukoslösning, sluta medier.
- Förbered en PBS-glukos lösning genom att tillsätta 5 ml penicillin-streptomycin (100 enheter / ml och 100 mikrogram / ml) och 1,98 g glukos till 250 ml 1x steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och ta lösningen volymen till 500 ml med ytterligare sterila 1x PBS.
- Förbered stoppa media genom att tillsätta 25 ml FBS och 5 ml penicillin-streptomycin (samma koncentration som ovan) till 250 ml steril Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) och ta volymen till 500 ml med steril DMEM innan steril filtrering genom ett 0,2 mikron filter.
- Sterilisera kirurgiska instrument som behövs för isolering genom autoklavering: en hemostat, # 5 pincett, stora saxar, mikro-sax och en skalpell handtag (# 4).
2. Neonatal cardiomyocyte isolering - förberedelse (dagen för skörd)
Var noga med att behålla steriliteten
Lösningar som används i detta avsnitt: PBS-glukoslösning, Betadine
- För varje kull, ta de två sterila 100 mm petriskålar, placera dem i huva och fylla med ~ 10 ml iskallt PBS-glukos. Dessa ska sedan placeras i en ishink fylld med is i den sterila kulturen huven.
- Placera en 250 ml bägare med 30-40 mL av Betadine i huven.
- Tillsätt 50 ml / kull med PBS-glukos i en flaska, tätning och placera i en 37 ° C vattenbad.
- För varje person, plats ett absorberande bänk underpad på motorhuven arbetsyta och lägg en steril duk på toppen var noga med att inte röra vid området mitt arbete steril duk. Dumpa de kirurgiska instrument och en 4 x 4 kompress på steril duk utan att vidröra instrument. Öppna en steril # 20 skalpell blad och dumpa på drapera, återigen till att du inte kontakt med icke-sterila handskar.
- Ta valpar från dammen och placera i ogenomskinliga behållare, placera ungarna i huven
- Ta på sterila handskar
- Vik gasväv i fjärdedelar, klämma med hemostat och placera i Betadine bägare.
- Sätt skalpell blad på skalpell handtag och ställ åt sidan.
3. Neonatal cardiomyocyte isolering - hjärta dissektion
Lösningar som används i detta avsnitt: Betadine, PBS-glukoslösning
- Plocka upp valpen i din icke-dominanta hand genom att nypa huden mellan skulderbladen mellan tummen och pekfingret. Med hjälp av stora saxar, halshugga valpen i ett snitt. Var noga med att skära från baksidan av valpen framåt, att se till att ryggraden är helt avskurna.
- Tvätta valpens bröstkorg med Betadine indränkt gasbinda. Säkra valpen genom att klämma skulderbladen ihop. Utför partiell torakotomi att exponera hjärtat. Öka applicerat tryck, vilket tvingar hjärtat förbi räfflor för scalpular dissekering.
- Kör skalpell blad bakom hjärtat att kapa de stora fartygen och ta bort hjärtat. Placera hjärtat i petriskål med PBS-glukos som ligger på is.
- Upprepa steg 1-3 för varje valp i kullen.
4. Neonatal cardiomyocyte isolering - myocyte isolering
Lösningar skapas / används i detta avsnitt: PBS-glukoslösning, kollagenas lösning, helhetslösning
- När hjärtan har isolerats, ta bort eventuella blod-och bindväven genom att skölja i iskallt PBS glukoslösning, ta bort den övre 1 / 3 av hjärtat att isolera bara ventrikulära vävnad och placera i en ny petriskål med iskall PBS glukos, beredd tidigare.
- Försiktigt finhacka hjärtan i ~ 1 kubik mm med hjälp av mikro-sax och pincett.
- Ta en steril överföringspipett, skär av toppen med sax, så att mynningen av pipetten är ~ 3 mm i diameter. Använd pipetten för att överföra vävnad bitar och alla av lösningen i en 50 ml koniska och lägg på is.
- Väg upp 15 tusen enheter per kull valpar av typ II kollagenas (enheter / mg är beroende av partiet) och placera i flaskan med 37 ° C värms PBS-glukos beredd tidigare för att skapa kollagenas lösning. Blanda väl och sterila filtret i en separat flaska. Sätt tillbaka in i 37 ° C vattenbad. Placera stopp lösningen i 37 ° C vattenbad också.
- Låt det malda vävnaden att lösa till botten av centrifugröret. Avlägsna supernatanten tills den totala volymen är ~ 10 ml. Tillsätt 7 ml kollagenas lösning till centrifugrör.
- Sätt koniska röret med vävnaden bitar och kollagenas i ett provrörsställ på en skakapparat inuti en 37 ° C inkubator eller ugn. Vrid skakapparat på ungefär 60 rpm och stäng dörren. Ställ in en timer för 7 minuter. Var noga med att placera kollagenas back i vattenbad för att hålla den varm.
- När timern går ut, ta med den koniska tillbaka in i huven. Också föra den varma kollagenas och stoppa lösning i huven. Försiktigt titrera vävnaden bitar 5-7 gånger för att bryta upp dem. Efter titrering, låt bitarna att lösa till botten (2-3 minuter). Sug bort så mycket av supernatanten som möjligt är mycket noga med att inte suga upp vävnaden bitar. Efteråt, tillsätt 7 ml kollagenas lösning på vävnaden bitar och lägg tillbaka in i inkubatorn på skakapparaten i 7 minuter.
- För varje återstående steg försiktigt titrerar man 10 gånger för att bryta upp vävnaden bitar. När vävnaden bitarna lösa, rita supernatanten av och samla det i ett separat 50 ml koniska. Tillsätt 7 ml kollagenas till vävnaden bitar och smälta igen i 7 minuter. Till supernatanten röret, tillsätt 10 ml stopp lösning med en annan serologisk pipett efter varje tillsats av supernatanten från matsmältningen.
- Upprepa tills alla kollagenas har använts (7 steg totalt).
- Efter den sista matsmältningen steget, ta koniska med cellen lösningen och filtrera genom 70μm cellen sil till frisk koniska.
- Spin celler nedåt på 100g i 5 minuter och återsuspendera i 20 ml DMEM ska räknas med hjälp av en hemocytometer och placera cellerna på is.
- Placera 50 l av celler till en Trypan Blå lösning (75 l Trypan Blå, 125 l PBS), blanda väl innan du placerar 10 ìl i hemocytometer för räkning. Levande celler är tydligt samtidigt som döda celler är blå. Räkna med cirka 3 miljoner celler per hos råttungar, med en bärkraft på ca 80-90%.
5. Gjutning fibrin gel konstruktioner - förberedelser för att skapa fibrin geler (gjort i god tid)
Lösningar som skapats i detta avsnitt: lösning fibrinogen lager, trombin stamlösning, Pluronics lösning, hjärtinfarkt konstruera media.
- Förbered en 33 mg / ml stamlösning av fibrinogen i 20 mM HEPES buffert i 0,9% koksaltlösning genom att långsamt blanda fibrinogen i HEPES saltlösning under flera timmar vid 37 ° C. Låt lösningen sig under natten vid 2-8 ° C. Värm lösningen till 37 ° C. Lösningen är steril filtreras genom en serie av på varandra följande filter: 40 ìm cell silar, 0,45 ìm flaska topp filter med glas förfilter och 0,2 ìm korken filter med glas förfilter. Lösningen är konstaterat i 1 ml och 3 ml alikvoter och lagras vid -20 ° C.
- Förbered en 25 U / ml stamlösning av trombin genom att tillsätta 500 U trombin till 18 ml 0,9% koksaltlösning och 2 ml sterilt avjoniserat vatten, sterilt filtrera genom en 0,2 ìm filter, uppmätt till 500 l och 250 l alikvoter och fryser i -80 ° C.
- Förbered en 5% w / v Pluronics F-127-lösning, genom att lösa 50 g Pluronics F-127 till 700 mL avjoniserat vatten. Lösningen volym upp till 1L med ytterligare avjoniserat vatten. Sterila filter med 0,2 ìm filter. Den Pluronics lösning kan användas upp till tre gånger innan du byter om sterila filtreras efter varje användning.
- Förbered hjärtinfarkt konstruera medierna genom att tillsätta 10% häst serum, 2% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, och 6 mg / ml-Aminokapronsyra i DMEM. 50 mikrogram / ml askorbinsyra och 2 mikrogram / ml insulin i 25 mikroM HEPES måste läggas omedelbart före utfodring.
- Montera dorn genom att sätta samman en teflonstav, en teflon ärmen, två teflon brickor med ett hack bort för injektion ändamål och två O-ringar (se figur 2a). Autoklav före användning.
- Ta 6cc spruta höljen till den yttre delen av formen och 3CC tarmar spruta för att användas som kolvar, och förbereda dem genom att skära bort luer-lock ändar och autoklavering (se figur 2a).
6. Gjutning fibrin gel konstruktioner - förberedelser för att skapa fibrin geler (till höger innan fibrinet gel konstruktioner)
Lösningar som används i detta avsnitt: Pluronics lösning
- Sterila filtrera 5% Pluronics F-127-lösning med en 0,2 ìm filter före användning. Placera dorn och höljen sprutan i 5% Pluronics lösning i en 1 L bägare i huven. Låt delarna blötläggning i Pluronics lösningen för 2-3 timmar i huven för att garantera fullständig beläggning. Den Pluronics lösningen rockar dorn och förhindrar fibrin gelen från att fastna i dorn.
- Efter 2-3 timmars inkubation, häll 5% Pluronics tillbaka lösning i flaskan, lägg steril draperier ner på ytan av huven och slitage sterila handskar för att bygga formar.
- Placera konstruerade dorn i 6 höljen cc spruta, med hjälp av 3CC sprutan som en kolv för att säkerställa en tät tätning mellan o-ringar och teflon brickor.
7. Gjutning fibrin gel konstruerar via formsprutning
Lösningar som skapats i detta avsnitt: F lösning, T-lösning, cell lösning.
- För att göra 1 mL fibrin gel (3,3 mg / ml slutlig fibrinogen koncentration, 25 U / mL slutlig trombin koncentration), skapa F lösning i en konisk tub, genom att tillsätta 112 l av fibrinogen beståndet till 558 l 20 mm HEPES buffert i 0,9% saltlösning. I en separat koniskt rör, skapar en T-lösning genom att tillsätta 17 ìl av trombin lager och 1,3 l 2 N Ca + +-lösning till 135 ìl DMEM. Se tabell 1.
- I en tredje koniskt rör, förbereda en cell lösning genom att snurra ner celler och resuspending cellerna i en volym så att koncentrationen av cellen är 29.400.000 celler / ml eller 6 gånger koncentrationen av den önskade slutliga koncentrationen av celler i konstruera
- När du är redo att kasta fibrin gelen konstruera, prep en 1 ml spruta med en 18G 1 ½ cm lång nål. Har en 21G 1 tums nål redo också.
- Den fibrin lösningen skapas vid en 04:01:01 förhållandet F lösning: T-lösning: cell-lösning. För att göra en ml gel, lägg till 667 mikroliter av F lösningen i en ren 50 ml centrifugrör, följt av 167 mikroliter av cell-lösning, och slutligen lägga till 167 l av T lösning. Pipettera att blanda lösningen tillsammans försiktigt så att inte införa bubblor. När lösningarna blandas, har reaktionen startat och injektion av konstruktioner bör göras omedelbart.
- Ta den tidigare beredda sprutan med 18G nålen och drag upp fibrin lösning. Se till att inte vända på sprutan för att förhindra att bubblor från att komma in nålen. Byt 18G nål med en 21G nål. Knacka försiktigt på sprutan för att tvinga ut luftbubblor.
- Sätt in sprutan i formen mellan proppen och höljet efter spåret i teflon O-ringen och injicera lösningen i formen. Luta mögel med spåret på toppen för att försäkra komplett fyllning. Ta bort sprutan och fortsätta att fylla resterande formar. Nog gellösning kan skapas för att fylla flera formar samtidigt. Men eftersom lösningen geler snabbt är det oftast en bra idé att begränsa antalet konstruktioner injiceras vid en viss tidpunkt till 6.
- Linda formar i Parafilm i grupper om tre och plats i inkubatorn eller ugnen vid 37 ° C. Låt den geler att inkubera i formarna i 20 minuter så att gelen tid att polymerisera.
- Fyll varje kultur burk (Nalgene rak sida burk) med 21 ml av hjärtinfarkt bygga medelstora per konstruktion. Använd sterila 3 cc spruta hölje som kolven för att tvinga dornen med konstruera i en stor petriskål med DMEM. Placera sedan bygga i provet burken. Varje 16 oz burk kan rymma upp till 6 konstruktioner, medan varje 4 oz burk kan rymma 2.
- Skruva fast lock på burkarna och överföra dem till inkubatorn. Inne i inkubatorn, lossa lock på burkarna för att möjliggöra för gas utbyte.
- Efter 24 timmar, ta en steril tand plocka och tryck konstruera från den vita teflon O-ringar på ändarna av ringen mögel att säkerställa en enhetlig anpassning av konstruktionen (se figur 2 i representativa resultat).
8. Analys tekniker (efter 2 veckor i kultur) - kontraktionskraften testning
Lösningar som används i detta avsnitt: DMEM, hjärtinfarkt konstruera media.
- Kläm fast krokodilklämmor på bly som kommer från stimulatorn till ledningarna på elektroderna i badet. Slå på datainsamling styrelse, pulsgivare och kraftgivare. Den kraftgivare bör byta till 5g inställning och nollställas. Öppna en egen LabView program som visar och sparar data från den kraftgivare. Skapa en ny tom textfil i mappen Data för varje prov.
- Placera DMEM i 37 ° C vattenbad och ge tid för den att värma upp innan testa konstruktioner. När värmde, placera 37 ° C DMEM på medellång bad av den kraft mätningen (se figur 3A).
- Ta bort konstruera från provet burken genom att dra den konstruera ringen från Teflon stöd med pincett och placera bygga över den fasta metallen inlägget i kraft mätsystem medelstora bad. Inte grepp konstruera med pincett! Snarare använder pincett för att trycka och lyfta bygga bort av dorn stöd.
- Placera den andra änden av konstruktionen över givaren armen och dra åt tills givaren läser 0.50V, (ungefär 1,0 gram kraft eller 10 millinewtons av spänning)
- Markera textfilen för de data kontraktion kraft skall registreras in.
- På hjärt-stimulator (Modell # S88X, Gräs Technologies), som pulsen spänningen till 20V (8 V / cm), 6 ms varaktighet och med en hastighet av 1 Hz.
- Starta den elektriska stimuleringen genom att trycka på "output on / off"-knappen
- Starta inspelningen tills vågformen blir korrekta.
- Ta försiktigt bort konstruera ur kraft mätsystem medelstora bad och läggas ner i odlingsmedium. Ta sedan bort DMEM ur kraft mätsystem medelstora bad och ersätta med nya, varma DMEM att analysera additional prover.
- Skär konstruera och rulla den så att du kan mäta längd och bredd av konstruktionen
- Skär bygga i sektioner som ska användas för ytterligare analys mätningar inklusive livskraft, histologi, eller västra mätningar blot.
9. Analys tekniker (efter 2 veckor i kultur) - Live-Dead-analys av lönsamheten (med Invitrogen Live / Dead Assay) 14:
Lösningar som används i detta avsnitt: EthD-1 stamlösning, kalcein AM stamlösning PBS
- Skölj prover med 3x 5 minuters tvättar i PBS.
- Tillsätt 20 l av 2 mm EthD-1 stamlösning till 10 ml av steril PBS och vortexa att säkerställa omsorgsfull blandning.
- Tillsätt 5 ìl av 4 mm kalcein AM lager stolution till EthD-1 lösning. Återigen, för att vortexa säkerställa omsorgsfull blandning.
- Tillsätt tillräckligt med volym av ovanstående lösning för att täcka bygga.
- Inkubera omfattas (för att förhindra fotoblekning av färgämnen) i 30 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort färgämnen och ersätta med varma PBS. Observera och registrera bilder med ett fluorescerande mikroskop. Kalcein är entusiastisk 494 nm ljus och avger 517 nm ljus, medan Ethidium homodimer-1 är med 528 nm ljus och avger 617 nm ljus. Se Figur 4 för provresultat.
10. Analys tekniker (efter 2 veckor i kultur) - immunohistokemi för viktiga myocyte proteiner:
Lösningar som används i detta avsnitt: PBS, 4% paraformadehyde i PBS, 5% åsna serum i PBS, antikroppar i PBS, 0,1 ng / ml Hoechst 33.258 i PBS.
- Skölj prover med 3x 5 minuters tvättar i PBS.
- Fäst med 4% paraformaldehyd i PBS lösning, i 2-3 timmar vid 4 ° C
- Skölj prover med 3x 5 minuters tvättar i PBS.
- Provet kan nu bäddas, sektioneras och fläckade enligt protokollet val. Resterande del av detta protokoll täcker hela konstruera färgning för avbildning med konfokalmikroskopi. Observera att inkubationstiderna är längre än för sektioneras vävnad som det måste finnas mer tid för antikroppar mot diffundera in i konstruktionen. Dessutom är alla de återstående stegen utförs vid rumstemperatur.
- Tillsätt 0,1% Triton-X i PBS med proverna i 30 minuter för permeabilize cellmembranen.
- Skölj prov med 3x 10 minuter tvättar i PBS.
- Tillsätt 5% åsna serum i PBS till prover för 1 ½ timme att blockera icke-specifik bindning av sekundär antikropp med proverna.
- Lägg connexin 43 (01:50 utspädning) och myosin heavy chain (1:100 utspädning) primära antikroppar i PBS till prover för 3 timmar. För att märka både proteiner efter varandra ska du se till att den primära antikroppar från olika värdar (dvs kanin och mus).
- Skölj prov med 3x 10 minuter tvättar i PBS.
- Tillsätt lämplig fluorescerande sekundära antikroppar i PBS i 3 timmar.
- Skölj prov med 3x 10 minuter tvättar i PBS
- Strax före avbildning prover på konfokalmikroskop, lägga 0,1 ng / ml Hoechst 33.258 i PBS i 15 minuter.
- Skölj prov med 3x 10 minuter tvättar i PBS.
- Analysera proverna uttryck av MHC och Cx43 genom avbildning av celler med ett konfokalmikroskop (se figur 4 till exempel resultat).
11. Representativa resultat / resultat:
Den cardiomyocyte fibrin konstruera täcker initialt hela bredden av mögel (Figur 2B). Inga bubblor bör finnas i konstruktionen och det ska se enhetligt över hela längden. Efter två veckors odling, att konstruera kontrakt till ca 1 / 4 av den ursprungliga bredd (figur 2C).
När konstruktion är elektriskt tempo i våra egna kontraktionskraften enhet (Figur 3A), kan rycka kraft data tas fram enligt figur 3B. Vågformen kan analyseras separat i MATLAB (The MathWorks) för att bestämma kraft, graden av sammandragning, och graden av avslappning. Twitch krafter på cirka 1,3 mN väntas 6.
Cellviabiliteten av konstruktionen är beroende av djupet av konstruktionen, på grund av diffusion begränsningar av syre in i konstruktionen. På ytan av konstruktionen, figur 4A, är hög cellviabiliteten observerats. Med konfokalmikroskopi, figur 4B, är anpassad struktur konstruera observerade på grund av myosin heavy chain, MHC, är viktigt för kontraktion, visas i rött. Connexin 43, som visas i grönt, är nödvändigt för cellulära koppling mellan myocyter.
Figur 1: Översikt över inkapsling processen
Figur 2: a) separata och kombinerade mögel delar för att skapa fibrin geler. From vänster till höger: två Teflon brickor, två silikon o-ringar, en teflonstav, en Teflon slang, en färdig dorn, ytterhöljet för dornen, och kolven). B) Konstruera om mögel omedelbart efter kastas ut ur ytterhöljet (dag 0). C) Packad bygga på mögel (röd pil), efter 13 dagar av kultur.
Figur 3: A) Anpassat kontraktionskraften mätsystem för inspelning rycka kraft. En kraftgivare med ett inlägg åtgärder kontraktionskraften och utgångar resultaten i en dator. Ett bad med två kolelektroder med kablar ansluts till en elektrisk stimulator som steg konstruktionen. De två inlägg håller bygga på plats. B) Exempel rycka kraft vågformsdata genereras med elektrisk stimulering vid 0,5 Hz.
Figur 4: A) Live / Dead analys av konstruktion, dag 13 (skala bar = 400 mikrometer). Grönt representerar levande celler och röda representerar den döda celler. B) Confocal Bild av myosin heavy chain (röd), connexin 43 (grön) och Hoescht nukleära färg (blå) (skala bar = 10 mikrometer).
| F-lösning | T-lösning | Cell Solution | |||
| Fibrinogen | 112 l | Trombin | 17 l | Celler i DMEM | 170 l |
| HEPES | 558μl | Ca + + | 1,3 l | ||
| DMEM | 152 l | ||||
| Totalt | 670 l | Totalt | 170 l | Totalt | 170 l |
Tabell 1. Fibrin gel lösningar kvantiteter för 1 ml gel.
OBS: Fibrinogen = 33 mg / ml fibrinogen i 20 mM HEPES saltlösning
HEPES = 20 mm HEPES saltlösning
Trombin = 25 U / ml lösning i 0,81% NaCl-lösning
Ca + + = 2 N kalciumkloridlösningen
Discussion
För inkapsling av nyfödda råttor cardiomyocytes i fibrin geler resulterar i en konsekvent och livskraftig tredimensionella in vitro modell av hjärtinfarkt systemet. Fibrin är att föredra biomaterial eftersom när cellerna är anhållna, de är metaboliskt aktiva och kan komprimering, ombildningar och återskapar en extracellulär matrix som är förenlig med infödda hjärtvävnad 12. Eftersom vi låta cardiomyocytes att anpassa sig i denna miljö är deras funktionalitet mer typisk för hjärtmuskeln vilket resulterar i större sammandragning kraft jämfört med isotrop vävnader 6. För potentiella terapeutiska tillämpningar är det nödvändigt att kapsla in celler i ett material som främjar både lönsamheten och funktionalitet. De protokoll som presenteras här visar en effektiv och korrekt sätt för att skapa en fibrin nätverk för att styra hjärt cellens beteende i en tredimensionell mikromiljö.
Några potentiella problem kan uppstå under skapandet och kulturen i dessa konstruktioner. Ett potentiellt problem är att upprätthålla cellviabiliteten före inkapsling, som avsevärt kommer att påverka funktionaliteten av konstruktionen. Ansträngningar bör göras för att begränsa celldöd efter den isolering genom att minska tiden mellan isolering och inkapsling av celler i fibrin gel. Konstruerar bör ges media varannan dag på ett strikt schema. Dessutom är det viktigt att säkerställa homogenitet i alla de använda lösningar. Om blandningen av fibrinogen, trombin och celler producerar en heterogen miljö, möjligheten för celler att bygga om ECM är mekaniskt par och kontrakt eventuellt blockeras. Det är också viktigt att förhindra uppkomsten av luftbubblor under injektionen av konstruktioner för att förhindra störningar i kontinuiteten i vävnadstekniska. Ett sätt att lindra detta problem är dra mer gel än vad som behövs för att göra konstruera i sprutan och injicera långsamt. Slutligen, när fibrin matris har satt och har varit i odlingsmedium i 24 timmar är det viktigt att lösgöra bygga från sidorna av ringen mögel att främja cellbaserade packning av fibrin gel. Håll bygga i mitten av formen underlättar gaser och näringsämnen utbyte. Anslutning till sidorna av ringen mögel kan också störa den önskade cellulär anpassning.
Det är viktigt att notera att medvetet halshuggning används som metod för euthanization i detta protokoll, som är en acceptabel metod enligt riktlinjerna från både National Institutes of Health och American Veterinary Medical Association. Men vissa institutioner rekommenderar narkos använda följt av halshuggning för neonatala råttor. Vi har valt medvetna halshuggning för att både minimalt med tid under hypoxiska förhållanden för exciderad hjärtvävnad / celler. Relativt små mängder av syrebrist kan leda till myocyte ischemi och potentiellt myocyte död, som väsentligt kan påverka resultaten av detta protokoll.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health - National Heart, Lung and Blood Institute (Award # R00HL093358 till LDB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | PBS |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | PBS |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | PBS |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | Isolation |
| hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Isolation |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | Isolation |
| large scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | Isolation |
| micro-scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | Isolation |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10008-13 | Isolation |
| scalpel blade | Fisher Scientific | 08-918-5A | Isolation |
| Absorbent bench underpad | VWR international | 56617-014 | Isolation |
| sterile drape | Fisher Scientific | GM42526 | Isolation |
| autoclave bag | Fisher Scientific | 01-812-54 | Isolation |
| gauze pad | Fisher Scientific | 13-761-52 | Isolation |
| betadine | Purdue Products L.P. | 67618-150-01 | Isolation |
| sterile gloves | Fisher Scientific | 19-020 | Isolation |
| sterile transfer pipette | Fisher Scientific | 9962 | Isolation |
| collagenase | Worthington Biochemical | CLS2 | Isolation |
| Teflon rod 1/4 inch diameter | McMaster-Carr | 8546K11 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 8547K31 | Mold part |
| Silicone O-Ring 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 9396K204 | Mold part |
| Teflon tube 1/4 inch ID, 5/16 inch OD | McMaster-Carr | 52355K14 | Mold part |
| Kendall monoject syringes 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Mold part |
| BD syringe 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Mold part |
| Bovine Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630 | Construct |
| Bovine Thrombin | Sigma-Aldrich | T7513 | Construct |
| 1 M HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Construct |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Construct |
| DMEM | Invitrogen | 10569 | Construct |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Construct |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | Construct |
| 0.2 micron filter | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Construct |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Construct |
| 0.45 micron bottle top filter | Corning | 430627 | Construct |
| glass pre-filter | EMD Millipore | AP2007500 | Construct |
| 18G 1 1/2 inch long needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Construct |
| 21G 1 inch needle | Fisher Scientific | 14-826C | Construct |
| construct jars | Fisher Scientific | 2116 | Construct |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | Media |
| horse serum | Sigma-Aldrich | H1138 | Media |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000 | Media |
| aminocaproic acid | Acros Organics | 103305000 | Media |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Media |
| insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Media |
| Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histology |
| Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella, Inc. | 27050 | Histology |
| 2-methylbutane | Fisher Scientific | 03551-4 | Histology |
| Mouse MYH1/2/4/6 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32732 | Histology |
| Rabbit Connexin 43 primary antibody | Cell Signaling Technology | 3512 | Histology |
| Dylight 549-conjugated donkey anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | Histology |
| Dylight 488-conjugated Donke anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-485-152 | Histology |
| Live/dead assay | Invitrogen | L-3224 | Analysis |
References
- Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype. Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).
- Guarnieri, D. Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters. Acta. 6, 2532-2539 (2010).
- Krebs, Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering. Acta. 5, 2847-2859 (2009).
- Zimmermann, W. -H. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature. 12, 452-458 (2006).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis. Tissue engineering. 15, (2009).
- Black, L. D. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).
- Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).
- Jockenhoevel, S. Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).
- Ryan, E. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Williams, C. Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs. Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).
- Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. A fibrin-based arterial media equivalent. Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.
- Invitrogen. >LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells. , Invitrogen. (2005).
