Summary
هذا الأسلوب يسمح توصيف البكتيرية تمديد التعاون مع EpiAirways الثقافة البشرية والجهاز التنفسي الأولية الأنسجة الطلائية نمت في واجهة الهواء السائل ، وهو ذات الصلة بيولوجيا
Abstract
Nontypeable المستدمية النزلية (NTHi) هي تكييف الإنسان الجراثيم سلبية الغرام التي يمكن أن تسبب التهابات متكررة ومزمنة في الأغشية المخاطية التنفسية 1 ، 2. لدراسة الآليات التي من خلالها هذه الكائنات على البقاء على قيد الحياة وداخل أنسجة الجهاز التنفسي ، وهذا نموذج التي يمكن أن يؤديها بنجاح على المدى الطويل المشترك ثقافة البكتيريا والخلايا البشرية هو مطلوب. نستخدم الإنسان التنفسي الأنسجة الطلائية الأولية التي أثيرت في واجهة الهواء السائل ، نموذج EpiAirway (ماتيك ، آشلاند ، MA). هذه هي غير خلدت جيدا ومتباينة ، 3 الابعاد الأنسجة التي تحتوي على منعطفات ضيقة ، وخلايا مهدبة وnonciliated ، والخلايا التي تنتج القدح الميوسين ، والابقاء على القدرة على إنتاج السيتوكينات في الاستجابة للعدوى.
ويمكن استخدام هذا النموذج ذات الصلة بيولوجيا في المختبر من مجرى الهواء العلوي الإنسان في عدد من الطرق ، والهدف العام من هذا الأسلوب هو لأداء على المدى الطويل المشترك ثقافة الأنسجة EpiAirway مع NTHi وquantitate الخلية المرتبطة البكتيريا والمنضوية مع مرور الوقت . كذلك ، يمكن تحديد الإنتاج والميوسين ملف خلوى من المصابين المشترك الثقافات. يحسن هذا النهج على الأساليب الموجودة في العديد من البروتوكولات التي تستخدم الحالية مغمورة أحادي الطبقة أو Transwell الثقافات من الخلايا البشرية ، وهي ليست قادرة على دعم الالتهابات البكتيرية على مدى فترات طويلة 3. على سبيل المثال ، إذا كان الكائن الحي يمكن أن تتكرر في وسائل الإعلام الفوقية ، وهذا يمكن أن يؤدي إلى مستويات غير مقبولة من السمسة وفقدان الخلايا المضيفة والقت القبض على التجربة. نموذج EpiAirway يسمح توصيف التفاعلات المضيف الممرض على المدى الطويل. علاوة على ذلك ، منذ المصدر للEpiAirway أمر طبيعي الإنسان الرغامى خلايا الشعب الهوائية بدلا من خط خلده ، كل واحدة على تمثيل ممتاز من الإنسان التنفسي العلوي الفعلية أنسجة المسالك ، سواء من حيث الهيكل وظيفة 4.
لهذا الأسلوب ، الأنسجة EpiAirway مفطوم الخروج من المركبات المضادة للميكروبات ومكافحة الفطريات لمدة 2 أيام قبل التسليم ، ويتم تنفيذ كافة الإجراءات في إطار المضادات الحيوية خالية من الشروط. هذا يتطلب اعتبارات خاصة ، حيث يتم استخدام كل من البكتيريا والأنسجة البشرية الأساسية للسلامة الأحيائية في الحكومة نفسها ، وشارك في تربيتها لفترات طويلة.
Protocol
1. تستعد الحكومة للسلامة الأحيائية لأنسجة EpiAirway
- يرتدي معطف المختبر المكرسة ، مع ربط الشعر الى الوراء وعلى القفازات ، وبدء تدفق الصفحي. بعد 5 دقائق ، ونقل أي الأدوات في خزانة (pipettors ، نصائح ، وأنابيب أجهزة الطرد المركزي ، وغيرها) الى جانب واحد ، رش الداخلية لمجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وشاح مع الايثانول 70 ٪ والقضاء عليها مع مناشف ورقية نظيفة. رش الداخلية تنظيفها مرة أخرى مع الايثانول 70 ٪ وتترك لتجف. تحريك الأدوات إلى الجانب نظيفة وتكرار الإجراء الايثانول.
- استخدام الهباء نصائح ماصة الحاجز وpipettors مكرسة في مجلس الوزراء. لاستخدام فردي الملفوفة ماصات المصلية العقيمة ، وتمرير نهاية توصيله من خلال التدفق الصفحي ، وكسر مفتوح ، وحرك ماصة في مجلس الوزراء ، ورميه خارج التعبئة والتغليف.
- يجب التعامل مع يدرج EpiAirway ملقط معقم. مكان 6 بوصة غرامة الطرف المنحني تشريح الملقط في الحقائب التعقيم الختم الذاتي والأوتوكلاف. يعد يكفي أن يكون ستة على الاقل في اليوم الواحد جاهز للاستخدام.
2. تفريغ الأنسجة EpiAirway
- رش سطح العمل في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع الايثانول 70 ٪ والقضاء عليها مع مناشف ورقية نظيفة. رذاذ مرة أخرى والسماح ليجف السطح قبل الاستخدام. فتح مربع EpiAirway وتجاهل الستايروفوم ومواد التعبئة والتغليف.
- وسائل الإعلام EpiAirway صيانة خالية من المضادات الحيوية ، AIR MM - 100 - ABF (MM) ، هي ملكية خاصة لماتيك ويتم إرسالها في المجموعة مع إدراج. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية ، والتسمية six العقيمة الطرد المركزي 50 مل الأنابيب مع نوع وسائل الاعلام والتاريخ ، وتخفيف مباراة دولية. رش زجاجة سائل الاعلام مع الايثانول 70 ٪ وفتح داخل مجلس الوزراء. قسامة 25 مل من شهر في كل أنبوب جديد باستخدام ماصة معقمة المصلية لكل أنبوب ، وتشديد القبعات ، وتخزينها في 4 درجة مئوية. استخدام قسامة جديدة من MM كل يوم.
- كرر 2.2 أعلاه باستخدام زجاجة جديدة من 1 X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D - PBS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم. أكرر مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني من دون مد الكالسيوم والمغنيسيوم. تخزين كافة aliquots في 4 درجات مئوية.
- يدرج EpiAirway AIR - 100 تصل الى 24 لوحة جيدا في 4 درجات مئوية على وسائل الإعلام التي تحتوي على agarose الصلبة ، ويجب أن توضع في 6 لوحات لاستخدامها بشكل جيد. تسمية كل لوحة مع التاريخ ووصف استخدام الايثانول علامة المقاوم. مكان 1 ملليلتر من 4 درجات مئوية في شهر EpiAirway كل بئر. إزالة لوحة النقل من عبوته ، رذاذ مع الايثانول 70 ٪ ، ومكان في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. إزالة الشريط وفتح لوحة. باستخدام الملقط تعقيمها ، إزالة الشاش الرطب على إدراج EpiAirway.
- التقاط أي إدراج تعقيمها باستخدام ملقط مع حركة التواء للمساعدة في الافراج عن أنه من agarose ، والمكان الى جانب لوحة 6 - جيدا. قد يكون بعض agarose التمسك إدراج ، خصوصا أن درجة الحرارة في الارتفاع لوحة النقل المحيطة. استخدام مسحة القطن المعقم لإزالة بعناية agarose من إدراجه. تجنب لمس الغشاء ، وتأكد من أن أي محاصرون فقاعات الهواء تحت إدراج. وضع لوحة في ترطيب حاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
- سماح 24 ساعة على الأقل لأنسجة للتوازن في الحاضنة قبل بدء التعاون الثقافات.
3. صيانة الأنسجة EpiAirway
- باستخدام الملقط تعقيمها ، التقاط أي إدراج وماصة بلطف 200 microliters من قبل تحسنت D - PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم على النسيج والصخور إدراج. إمالة إدراج بزاوية ومكانك ماصة معقمة P1000 طرف ضد عصابة من البلاستيك الذي يحتوي على غشاء في الجزء السفلي من إدراجه. لا تلمس الأنسجة. نضح مد PBS شطف ومكان في cryovial معقمة وصفت. ويمكن تجميد العينات في -20 درجة مئوية ، ويعاير لالميوسين و / أو التعبير خلوى في وقت لاحق.
- تغيير MM القاعدية يوميا من قبل الشفط واستبدالها 1 ملليلتر من MM الطازجة. استخدام غيض ماصة حاجزا جديدا لكل بئر. علاج الوسائط المستخدمة مع التبييض 10 ٪ بين عشية وضحاها وتجاهل.
4. تلقيح الأنسجة EpiAirway
- مسحة من ثقافة جديدة من المستدمية النزلية nontypeable (NTHi) من المخزون الجلسرين المجمدة على أجار الشوكولاتة. تنمو بين عشية وضحاها في ترطيب حاضنة 5 ٪ CO 2.
- في اليوم التالي ، واحدة من المستعمرات resuspend NTHi في مرحلة ما قبل حرارة D - PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لOD (600 نانومتر) من 0.7 تقريبا. دوامة بقوة قبل لقياس الكثافة الضوئية. العلاقة بين الكثافة الضوئية لتشكيل وحدات مستعمرة لكل مليلتر (CFU / مل) من NTHi هو أن التطوير التنظيمي (600 نانومتر) من 0.2 يساوي تقريبا 1.0 × 10 8 كفو / مل. ولذلك ، والتطوير التنظيمي (600 نانومتر) من حوالي 0.7 3.5 × 10 8 كفو / مل. وينبغي التحقق من صحة هذه الخوارزمية لكل سلالة NTHi قبل التلقيح.
- الأنسجة EpiAirway تزرع AIR - 100 على إدراج مع مساحة قدرها 0.6 سم 2 وغشاء ميكرون 0.4. تتكون أنسجة ~ 8.0 × 10 5 إلى 1.0 × 10 ~ 6 </ سوب الخلايا>. ولذلك ، وتلقيح 1،0 س CFU 7 10 يناظر تعدد إصابة نحو 10 -- 12. لتطعيم ، وشطف كل إدراج EpiAirway كما في 3.1 ، ثم إضافة 28 microliters لتعليق بكتيرية في المعدة 4.2 إلى السطح القمي كل إدراج EpiAirway في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. لا تحصين MM القاعدية. عودة كل لوحة إلى الحاضنة.
5. الكمي لقيحة NTHi
- يعد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل مع 0.1 ٪ الجيلاتين الأوتوكلاف ، (PBS - G) لتعقيم. تسمية أنابيب 1.5 مل العقيمة إيبندورف مع التخفيفات 01:10 المنشود القائم على التطوير التنظيمي (600 نانومتر) من 900 microliters قيحة وقسامة من G - PBS العقيمة في كل أنبوب.
- تحديد عدد من لوحات أجار الشوكولا المطلوبة لتعداد NTHi تلقيح. وضع هذه اللوحات في حاضنة الهواء رأسا على عقب مع الجزء السفلي من لوحة يستريح على نصف العلوي لمدة ساعة. هذا سيسمح لوحة لكلا الدافئة إلى 37 درجة مئوية وعلى السطح ليجف ، وتسهيل الانقطاع عن تصفيح NTHi.
- بدء التخفيفات المتسلسلة 1:10 من اللقاح عن طريق إضافة 100 microliters لتعليق البكتيرية من 4.2 إلى الأنبوب الأول. دوامة كل التخفيف بقوة لمدة 5 ثوان قبل اتخاذ المقبل. انخفاض aliquots ميكروليتر 10 على لوحات أجار الشوكولاتة قبل حرارة السطح والمجففة ، وذلك باستخدام نصف لوحة لكل التخفيف. يمكن aliquots ميكروليتر خمس الى ست 10 احتواءه على نصف كل لوحة 100 ملم دون تشغيل معا. عندما تجف ، والمكان رأسا على عقب في ترطيب 37 درجة مئوية CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي ، وتحديد كفو / مل عن طريق حساب التخفيفات التي 15-30 المستعمرات متميزة في كل قطرة وحساب العودة إلى اللقاح الخاص قابلة للحياة الفعلية NTHi.
6. على المدى الطويل المشترك مع ثقافة NTHi
- كل 24 ساعة ، ويغسل ويدرج في 3.1 وحمام سباحة ثم غسل كل الأنسجة التي تم تلقيح مع نفس السلالة من البكتيريا وتجميد عند -20 درجة مئوية في cryovial المسمى لتحليل المستقبل. يمكن أن يعاير هذه العينات عن وجود البقع التي الميوسين نقطة أو للتعبير عن السيتوكينات التي إليسا. بدلا من ذلك ، يمكن للأنسجة التي تحصد مرنا ويمكن أن يؤديها qPCR على الجينات في المصالح. تغيير MM القاعدية اليومية كما هو الحال في 3.2. يستمر لمدة من الثقافة المشتركة.
7. حصاد الأنسجة EpiAirway
- يعد حل الطازجة 1 ٪ من سابونين في برنامج تلفزيوني من دون مد الكالسيوم والمغنيسيوم ، فلتر تعقيم ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
- الحارة أنبوب 50 مل من MM وآخر من دون مد PBS الكالسيوم والمغنيسيوم إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد أنابيب التخفيف كما في 5.1 ، فضلا عن واحدة فارغة عقيمة 1.5 مل في أنبوب إيبندورف إدراج المسمى مع عدد إدراج وسلالة NTHi.
- ويمكن حصاد EpiAirways إما البكتيريا الخلية المرتبطة الإجمالي الذي يشمل كلا من الكائنات ملتصقة والمنضوية ، أو المنضوية للبكتيريا فقط.
- تحديد عدد من لوحات أجار الشوكولاته اللازمة لإسقاط لوحة الخلية المرتبطة بغزو أو NTHi ، والتسمية وجافة لمدة ساعة واحدة في حاضنة الهواء كما هو الحال في 5.2.
- لحصاد مجموع الخلايا المرتبطة البكتيريا ، وشطف السطح من قمية EpiAirways ثلاث مرات مع 200 microliters مد برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم أو المغنسيوم ، والميل ثم إدراج وشطف أي MM المتبقية من الغشاء القاعدي. يمكن تجميد غسل الأول لتحليلها لاحقا ؛ تجاهل يغسل التالية.
- مكان إدراج غسلها في لوحة 6 - جيدا طازج بدون ملم ، وmicroliters ماصة 250 من محلول معقم سابونين 1 ٪ من 7.1 على سطح قمية كل الأنسجة. العودة إلى الحاضنة لمدة 10 دقيقة.
- إزالة من الحاضنة ، واستخدام غيض ماصة معقمة P1000 ، فرك أنسجة من الغشاء باستخدام الظهير وإيابا الحركة ، تليها حركة دائرية لإزالة الأنسجة من حواف إدراج. استخدام واسع يحمل ماصة معقمة غيض P1000 ، ضع تعليق في الأنبوب الفارغ المسمى أعد في 7.3. إضافة 250 microliters مد برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم أو المغنسيوم على سطح قمية للإدراج.
- دراسة إدراج باستخدام مقلوب على النقيض من المرحلة الميكروسكوب لتحديد ما إذا كان هناك أي نوع من الأنسجة المتبقية ليكون المقطوع. إذا لزم الأمر ، فرك مرة أخرى مع طرف آخر ماصة معقمة P1000 ، ثم يضاف إلى هذا التعليق الأنبوب من 7.8 باستخدام واسع يحمل ماصة معقمة P1000 الحافة. جعل إجمالي حجم الأنبوب إلى 1 ملليلتر باستخدام برنامج تلفزيوني من دون مد الكالسيوم أو المغنسيوم.
- دوامة بقوة تعليق خلية في سرعة قصوى لدقيقة واحدة. باستخدام المحاقن المعقمة 1 مل مزودة إبرة قياس 26 ، نضح تعليق من خلال حقنة في الإبرة. يمر ببطء من خلال تعليق 3 مرات الإبرة ، مع الحرص على عدم خلق فقاعات. الدوامة مرة أخرى بقوة لمدة دقيقة واحدة.
- تلميح باستخدام ماصة واسعة تتحمل ، 100 microliters مكان للتعليق في أنبوب تخفيف first أعد في 7.3. دوامة بقوة لمدة خمس ثوان ، ثم جعل التخفيفات 01:10 التسلسلي. المنسدلة في لوحة التخفيفات المطلوب على لوحات الشوكولاته آغار سطح المجفف.
- لحصاد البكتيريا المنضوية فقط ، وغسل كل إدراج 3 مرات مع 200 microliters مد برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم أو المغنسيوم. الاحتفاظ بها وتجميد غسل الأولى. إضافة كبريتات الجنتاميسين لتدفئته قبل شهر إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل. إعداد 1.5 مل من وسائل الإعلام في إدراج للحصاد. استبدال MM MM القاعدية مع الجنتاميسين المحتوية ، وإضافة 300 microliters الجنتاميسين MM المحتوية على سطح القمي. مكان لوحة العودة إلى الحاضنة CO 2 لمدة ساعة.
- إزالة MM جنتاميسين المحتوية على السطح من قمية ويغسل السطح القمي والأغشية القاعدية من إدراج نطاق واسع مع ما قبل تحسنت D - PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. المضي قدما كما هو الحال في 7،7-7،11.
8. ممثل النتائج :
وترد المسح micrographs الإلكترون من (A.) EpiAirway الأنسجة غير المصابة والأنسجة (باء) بعد ثقافة مشتركة لمدة 5 أيام مع NTHi في الشكل 1. المدى الطويل المشترك مع ثقافة NTHi لا ينجم عنه ضرر كبير للقمية الأنسجة ، مما يؤكد فائدة نموذج EpiAirway. ويظهر رسم بياني يصور عدد من البكتيريا المنضوية كميا على مر الزمن داخل الأنسجة في الشكل 2. كلا النتائج هي تكرار للغاية ، مما يجعل الأنسجة EpiAirway متناسقة وملائمة من الناحية البيولوجية في المختبر من طراز مجرى الهواء العلوي الإنسان الذي لدراسة NTHi المضيف الممرض التفاعلات.
الشكل 1. مسح المجهر الإلكتروني للأنسجة EpiAirway. ألف نسيج السيطرة المعافين. باء الأنسجة بعد خمسة أيام من الثقافة بالتعاون مع NTHi. ويلاحظ أي ضرر كبير على السطح القمي في الأنسجة المصابة.
المنضوية الشكل 2. NTHi عدد بمرور الوقت خلال ثقافة EpiAirway المشترك. تم تلقيح سلالة R2866 عند حوالي 1.0 × 10 7 إدراج / CFU (يوم 0) ، ثم حصادها للبكتيريا المنضوية في كل نقطة زمنية محدد. أشرطة تمثل ن = 3 مكررات على الأقل في مكررة. أشرطة الخطأ SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب يسمح للتحقيق في التفاعلات المضيف الممرض على المدى الطويل في خلفية ذات الصلة بيولوجيا من الأنسجة الابتدائية التنفسي للإنسان في واجهة الهواء السائل. هنا استخدمنا NTHi كما يصيب الكائن ، ولكن يمكن كميا أي تفاعل البكتيريا التي لا يدخل السمسة غير مقبولة على مر الزمن مع هذا الأسلوب. يمكن أيضا أن تستخدم النموذج EpiAirway لدراسة الفيروسات ، والمخدرات ، أو المواد الكيميائية التي تؤثر على مجرى الهواء العلوي الانسان 5 و 6 و 7 و 8. لقد حافظنا على أنسجة مصابة لأكثر من 40 يوما ، والأنسجة المصابة NTHi لا يقل عن 10 يوما. نتوقع أن من الممكن الحفاظ على الأنسجة المصابة لفترة أطول بكثير ، اذا شئت.
القيود المفروضة على هذه الطريقة هي مماثلة لتلك التي في أي نموذج في المختبر ، بما في ذلك عدم القدرة على إعادة تشكيل نظام المناعة المختصة في هذه الأنسجة. وعلى الرغم من أن يتم تنفيذ يغسل اليومية للأنسجة لتقليد إزالة mucociliary الطبيعي ، وإنشاء منفذ طبيعي لالميوسين المنتجة في هذه الأنسجة تكون أكثر من المرغوب فيه 9. كذلك ، اتصل مع NTHi هو معروف للحث على التعبير الميوسين في الخلايا البشرية الظهارية التنفسية ، مما أدى إلى تفاقم مشكلة 10. من ناحية أخرى ، يمكن حفظ يغسل EpiAirway اليومية ويعاير للبروتينات أو الأنشطة الأنزيمية من الفائدة ، مضيفا بعدا هاما إلى أسلوب وزيادة فائدتها.
خطوة واحدة رئيسية في الأداء الناجح لهذا الأسلوب هو اضطراب الميكانيكية للأنسجة قبل الانقطاع عن الطلاء على NTHi (الخطوة 7.10). لأن درجة كبيرة من التباين في EpiAirways ويتألف من عدة أنواع الخلايا والأنسجة ليست سهلة كما أن تتفكك باعتبارها الخلية أحادي الطبقة ، وحتى بعد العلاج سابونين. بالإضافة إلى ذلك ، NTHi حساسة المعروف أن المركبات التي تساعد في تصنيف الأنسجة. لذلك ، وجدنا أن يمر التعليق الخلية من خلال إبرة قياس 26 يحسن إلى حد كبير على قدرتنا على توليد الكمي متسقة ومتكررة من البكتيريا المنضوية أو خلية مرتبطة.
بمجرد يتقن هذا الأسلوب ، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لتحقيق القدرة النسبية للسلالات بكتيرية متحولة إلى البقاء على قيد الحياة بالمقارنة مع الآباء من النوع البري ، مما يسمح للمحقق لوصف آثار طفرات جينية محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر باتريك هايدن (ماتيك) لإجراء مناقشات مفيدة ، وروبرت سميث وبيري ليبي للعلوم الصحية للجامعة جورجيا EM المهارات الخاصة بهم. وقد تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة NIDCD DC010187 إلى DAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
