Summary
Cette méthode permet la caractérisation des bactéries étendu co-culture avec EpiAirways, des tissus humains primaires épithéliales respiratoires grandi à l'interface air-liquide, une biologiquement pertinentes
Abstract
Haemophilus influenzae non typables (NTHi) sont humains adaptés bactéries Gram-négatives qui peuvent causer des infections récurrentes et chroniques de la muqueuse respiratoire 1, 2. Pour étudier les mécanismes par lesquels ces organismes survivent et à l'intérieur des tissus des voies respiratoires, un modèle dans lequel réussite à long terme de co-culture de bactéries et de cellules humaines peuvent être réalisées est nécessaire. Nous utilisons des primaires respiratoire humain tissus épithéliaux soulevées à l'interface air-liquide, le modèle EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Ce sont des non-immortalisés, bien différencié, 3-dimensionnelle des tissus qui contiennent des jonctions serrées, cellules ciliées et non ciliées, des cellules caliciformes qui produisent la mucine, et conserver la capacité de produire des cytokines en réponse à l'infection.
Cette biologiquement pertinentes modèle in vitro de la voie aérienne supérieure humaine peut être utilisée dans un certain nombre de façons, l'objectif global de cette méthode consiste à effectuer à long terme de co-culture de tissus EpiAirway avec NTHi et quantifier les bactéries associées aux cellules et intériorisé au fil du temps . De même, la production de mucine et le profil des cytokines de l'infection co-cultures peuvent être déterminées. Cette approche améliore les méthodes existantes dans ce nombreux protocoles actuels utilisent des cultures monocouches ou submergés Transwell de cellules humaines, qui ne sont pas capables de soutenir les infections bactériennes sur de longues périodes 3. Par exemple, si un organisme peut se répliquer dans les médias sus-jacent, ce qui peut entraîner des niveaux inacceptables de la cytotoxicité et la perte de cellules de l'hôte, en arrêtant l'expérience. Le modèle permet de caractériser EpiAirway long terme interactions hôte-pathogène. En outre, depuis la source de la EpiAirway est normal humaine trachéo-bronchique cellules plutôt que d'une ligne immortalisé, chacun est une excellente représentation de tissus humains réels des voies respiratoires supérieures, tant dans sa structure et dans la fonction 4.
Pour cette méthode, les tissus sont EpiAirway sevrés de composés anti-microbiens et anti-fongique pour 2 jours avant la livraison, et toutes les procédures sont exécutées sous antibiotique sans conditions. Cela nécessite des considérations spéciales, puisque les bactéries et les principaux tissus humains sont utilisés dans la même armoire de biosécurité, et sont co-cultivées pendant des périodes prolongées.
Protocol
1. Préparer le cabinet de biosécurité pour les tissus EpiAirway
- Le port d'un sarrau de laboratoire dédié, avec des cheveux attachés en arrière et de gants, démarrer le flux laminaire. Après 5 minutes, déplacez tous les outils dans l'armoire (pipettes, des astuces, des tubes de centrifugation, etc) d'un côté, par pulvérisation à l'intérieur du cabinet de biosécurité et l'écharpe à l'éthanol 70% et essuyer avec des serviettes en papier propre. Vaporiser l'intérieur nettoyé à nouveau avec 70% d'éthanol et laisser sécher. Déplacer les outils pour le côté propre et répétez la procédure d'éthanol.
- Utilisez des aérosols embouts de pipette barrière et pipeteurs dédié dans l'armoire. Pour utiliser emballées individuellement stériles Pipettes sérologiques, passer l'extrémité est obstruée par le biais du flux laminaire, casser, et faites glisser la pipette dans l'armoire, en écartant l'extérieur de l'emballage.
- Les inserts EpiAirway doivent être manipulés avec des pinces stériles. Placer 6 pouces fine pointe courbée dissection forceps dans des sachets de stérilisation auto-obturant et autoclave. Préparer suffit pas d'avoir au moins six par jour prêt à l'emploi.
2. Déballage des tissus EpiAirway
- Pulvériser la surface de travail dans l'armoire de la biosécurité à l'éthanol 70% et essuyer avec des serviettes en papier propre. Vaporiser à nouveau et laissez sécher la surface avant de l'utiliser. Ouvrez la boîte de EpiAirway et jeter le styromousse et le matériel d'emballage.
- Les médias EpiAirway d'entretien sans antibiotique, AIR-100-MM ABF (MM), est la propriété de MatTek et est envoyé dans le kit avec les inserts. Dans le cabinet de biosécurité, l'étiquette six stérile de 50 ml avec des tubes à centrifuger le type de média et la date, et desserrer les bouchons. Vaporiser la bouteille médias avec 70% d'éthanol et d'ouvrir l'intérieur de l'armoire. Aliquote de 25 ml de MM dans chaque tube en utilisant une nouvelle pipette stérile sérologiques pour chaque tube, serrez les bouchons, et conserver à 4 ° C. Utilisez une autre partie aliquote de MM chaque jour.
- Répétez 2.2 ci-dessus en utilisant une nouvelle bouteille de 1 X Dulbecco tampon phosphate salin (D-PBS) avec le calcium et le magnésium. Répétez à nouveau l'aide du D-PBS sans calcium et le magnésium. Stockez tous aliquotes à 4 ° C.
- Les inserts EpiAirway AIR-100 arrivent dans une plaque de 24 puits à 4 ° C sur des supports solides contenant d'agarose, et doivent être placés dans des plaques 6 puits à l'emploi. Étiquetez chaque assiette avec la date et la description à l'aide d'un marqueur résistant à l'éthanol. Placer 1 millilitre de 4 ° C MM EpiAirway dans chaque puits. Retirer la plaque de transport de son emballage, de pulvérisation avec de l'éthanol à 70%, et les placer dans l'enceinte de biosécurité. Retirez la bande et ouvrez la plaque. En utilisant des pinces autoclavés, enlever la gaze humide sur les inserts EpiAirway.
- Ramassez un insert avec une pince autoclave utilisant un mouvement de torsion afin d'aider à le libérer de l'agarose, et le placer dans un puits d'une plaque à 6 puits. Certains d'agarose peuvent adhérer à l'insert, d'autant que la température de la plaque de transport augmente la température ambiante. Utilisez un coton-tige stérile pour retirer soigneusement l'agarose de l'insert. Évitez de toucher la membrane, et vérifier qu'aucune bulle d'air sont piégées sous les inserts. Placer la plaque dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Attendre au moins 24 heures pour les tissus de s'équilibrer dans l'incubateur avant de commencer les co-cultures.
3. Entretien des tissus EpiAirway
- En utilisant des pinces autoclavés, ramasser un insert et délicatement la pipette 200 microlitres de pré-chauffé D-PBS avec du calcium et de magnésium sur le tissu et le rock de l'insert. Inclinez l'insert à un angle et placez votre astuce pipette stérile P1000 contre l'anneau en plastique qui maintient la membrane au fond de l'insert. Ne pas toucher le tissu. Aspirer le D-PBS rincer et placer dans un cryovial étiqueté stérile. Les échantillons peuvent être congelés à -20 ° C et analysés pour la mucine et / ou l'expression des cytokines à une date ultérieure.
- Changer le MM basale quotidiennement par aspiration et le remplacer par 1 millilitre de MM frais. Utiliser un embout de pipette nouvelle barrière pour chaque puits. Traiter les médias utilisés avec l'eau de Javel à 10% durant la nuit et le jeter.
4. L'inoculation de tissus EpiAirway
- Streak une culture fraîche de Haemophilus influenzae non typables (NTHi) du stock de glycérol gelé sur gélose chocolat. Cultivez la nuit dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2.
- Le lendemain, resuspendre colonies isolées de NTHi en pré-chauffée D-PBS avec du calcium et de magnésium pour une DO (600 nm) d'environ 0,7. Vortex vigoureusement avant de mesurer la densité optique. La relation de la densité optique d'unités formant colonie par ml (UFC / ml) de NTHi est que une DO (600 nm) de 0,2 équivaut à environ 1,0 x 10 8 UFC / ml. Par conséquent, une DO (600 nm) de 0,7 est d'environ 3,5 x 10 8 UFC / ml. Cet algorithme doit être validée pour chaque souche NTHi avant l'inoculation.
- Les tissus EpiAirway AIR-100 sont cultivées sur des inserts d'une surface de 0,6 cm 2 et une membrane 0,4 micron. Les tissus sont composés de ~ 8,0 x 10 ~ 5 à 1,0 x 10 6 </ Sup> Les cellules. Par conséquent, une inoculation de 1,0 x 10 7 UFC correspond à une multiplicité d'infection d'environ 10 - 12. Pour inoculer, rincer chaque insert EpiAirway comme dans 3.1, puis ajouter 28 microlitres de la suspension bactérienne préparée en 4.2 à la surface apicale de chaque insert EpiAirway dans l'armoire de la biosécurité. Ne pas inoculer le MM basale. Retour chaque plaque à l'incubateur.
5. La quantification de l'inoculum NTHi
- Préparer un tampon phosphate salin (PBS) avec 0,1% de gélatine (PBS-G), autoclave pour stériliser. Étiquette stérile de 1,5 ml tubes Eppendorf avec les dilutions 1:10 désiré sur la base des DO (600 nm) de l'inoculum et 900 microlitres de l'aliquote de PBS stérile-G dans chaque tube.
- Déterminer le nombre de gélose chocolat nécessaire d'énumérer les NTHi inoculés. Placez ces plaques dans un incubateur à air à l'envers avec la partie inférieure de la plaque posée sur la moitié de la partie supérieure pendant une heure. Cela permettra à la fois à la plaque chaude à 37 ° C et la surface à sécher, ce qui facilite la chute de placage de NTHi.
- Démarrez le dilutions 1:10 de l'inoculum en ajoutant 100 microlitres de la suspension bactérienne de 4,2 au premier tube. Vortex chaque dilution vigoureusement pendant 5 secondes avant de prendre la suivante. Baisse de 10 aliquotes microlitre sur les plaques pré-chauffé et asséchée en surface de gélose chocolat, en utilisant la moitié de la plaque pour chaque dilution. Cinq à six portions de 10 microlitre peuvent tenir sur une moitié de chaque plaque de 100 mm, sans courir ensemble. Une fois sec, placez à l'envers dans une humidifié 37 ° C incubateur à CO 2 pendant la nuit.
- Le lendemain, de déterminer les UFC / ml en comptant les dilutions qui ont de 15 à 30 colonies distinctes dans chaque goutte et en calculant de nouveau à votre inoculum viable réelle de NTHi.
6. À long terme de co-culture avec NTHi
- Toutes les 24 heures, se laver les inserts comme dans 3.1, la piscine du lavage de chaque tissu qui a été inoculé avec la même souche de bactéries et de les congeler à -20 ° C dans un cryovial étiquetés pour analyse future. Ces échantillons peuvent être analysés pour la présence de mucine par dot blots ou pour l'expression de cytokines par ELISA. Alternativement, les tissus peuvent être récoltées pour l'ARNm et qPCR peut être effectuée sur des gènes d'intérêt. Changer le MM basale quotidienne comme dans 3.2. Continuez pour la durée de la co-culture.
7. La récolte des tissus EpiAirway
- Préparer une solution fraîche à 1% de saponine dans D-PBS sans calcium et de magnésium, filtre-stériliser et chaude à 37 ° C.
- Chauffer un tube de 50 ml de MM et un autre de la D-PBS sans calcium et de magnésium à 37 ° C.
- Préparer les tubes de dilution en 5.1, ainsi que d'un vide stérile de 1,5 ml par tube Eppendorf insérer, étiqueté avec le numéro d'insérer et de la souche NTHi.
- Le EpiAirways peuvent être récoltées pour soit totale associée aux cellules des bactéries, qui comprend à la fois les organismes adhérents et intériorisé, ou pour les bactéries intériorisées seulement.
- Déterminer le nombre de gélose chocolat nécessaires pour déposer la plaque associée aux cellules ou envahi NTHi, l'étiquette et sec pendant une heure dans un incubateur à air comme dans 5.2.
- Pour la récolte totale associée aux cellules des bactéries, rincer la surface apicale de la EpiAirways trois fois avec 200 microlitres de D-PBS sans calcium ni magnésium, puis inclinez l'insert et rincer toute MM restant de la membrane basale. Le premier lavage peut être congelé pour une analyse ultérieure; jetez les lavages suivants.
- Placer l'insert lavés dans une nouvelle 6-même plaque sans MM, et la pipette 250 microlitres de la solution stérile saponine à 1%, passant de 7,1 sur la surface apicale de chaque tissu. Retour à l'incubateur pendant 10 minutes.
- Retirer de l'incubateur, et en utilisant une pipette stérile, P1000, frottez les tissus de la membrane en utilisant un back-et-vient, suivie par un mouvement circulaire pour enlever le tissu sur les bords de l'insert. L'utilisation d'un gros calibre pointe de pipette stérile P1000, place de la suspension dans le tube vide intitulée préparées en 7.3. Ajouter 250 microlitres de D-PBS sans calcium ni magnésium sur la surface apicale de l'insert.
- Examiner l'insert en utilisant une inversé à contraste de phase microscope afin de déterminer s'il ya un tissu restant à être récoltés. Si nécessaire, frotter à nouveau avec une autre pointe de la pipette stérile, P1000, puis ajoutez cette suspension dans le tube de 7,8 en utilisant une pointe de gros calibre pipette stérile P1000. Porter le volume total du tube à l'aide de 1 millilitre de D-PBS sans calcium ni magnésium.
- Vigoureusement tourbillon de la suspension cellulaire à grande vitesse pendant une minute. En utilisant une seringue de 1 ml stérile munie d'une aiguille de calibre 26, aspirer la suspension dans la seringue dans l'aiguille. Lentement passent la suspension à travers l'aiguille 3 fois, en prenant soin de ne pas créer des bulles. Vortex à nouveau vigoureusement pendant une minute.
- En utilisant une pointe de gros calibre pipette, placer 100 microlitres de la suspension dans le tube de dilution d'abord préparé en 7.3. Vortex vigueur pendant cinq secondes, puis faire dilutions 1:10. Drop-plaques les dilutions désiré sur les plaques de surface séchées gélose chocolat.
- Pour récolter les bactéries ne intériorisé, se laver chaque insert 3 fois avec 200 microlitres de D-PBS sans calcium ni magnésium. Retenir et congeler le premier lavage. Ajouter au sulfate de gentamicine préchauffé MM à une concentration finale de 100 microgrammes / ml. Préparer 1,5 ml de milieu par insert à être récoltés. Remplacer le MM basale avec la gentamicine MM contenant, et ajouter 300 microlitres de la gentamicine contenant mm sur la surface apicale. Placer la plaque arrière dans l'incubateur à CO 2 pendant une heure.
- Retirez la gentamicine MM contenant de la surface apicale et laver la surface apicale et la membrane basale de l'insert intensivement avec préchauffé D-PBS sans calcium et magnésium. Procéder comme dans 7.7 à 7.11.
8. Les résultats représentatifs:
Microscopie électronique à balayage de (A.) EpiAirway tissus infectés et (B.) des tissus après 5 jours de co-culture avec NTHi sont présentés dans la figure 1. Long terme de co-culture avec NTHi n'entraîne pas de dommages significatifs à l'apex tissus, en soulignant l'utilité du modèle EpiAirway. Un graphique illustrant le nombre de bactéries intériorisées quantifiés au fil du temps l'intérieur des tissus est montré dans la figure 2. Les deux résultats sont très reproductibles, ce qui rend les tissus EpiAirway une approche cohérente et biologiquement pertinent modèle in vitro de la voie aérienne supérieure humaine dans laquelle l'étude NTHi hôte-pathogène interactions.
Figure 1. Microscopie électronique à balayage des tissus EpiAirway. A. tissus témoins non infectés. Tissu B. après cinq jours de co-culture avec NTHi. Aucun dommage significatif à la surface apicale est observée dans les tissus infectés.
Figure 2. Nombre de NTHi intériorisés au fil du temps au cours EpiAirway co-culture. Strain R2866 a été inoculé à environ 1,0 x 10 7 UFC / insert (jour 0), puis récoltés pour les bactéries intériorisées à chaque point indiqué. Les barres représentent n = 3 répétitions dans au moins double. Les barres d'erreur sont SD.
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Discussion
Cette méthode permet l'étude de long terme interactions hôte-pathogène dans un contexte biologiquement pertinentes de primaires humains tissus respiratoires à l'interface air-liquide. Ici nous avons utilisé NTHi que l'organisme infectant, mais l'interaction de toute bactérie qui n'introduit pas de cytotoxicité inacceptable au fil du temps peuvent être quantifiés avec cette méthode. Le modèle EpiAirway peut également être utilisé pour l'étude des virus, des drogues ou des produits chimiques qui influent sur la partie supérieure des voies respiratoires humaines 5, 6, 7, 8. Nous avons maintenu les tissus infectés depuis plus de 40 jours, et les tissus infectés par NTHi pendant au moins 10 jours. Nous prévoyons que les tissus infectés pourrait être maintenu pendant bien plus longtemps, si désiré.
Les limites de cette méthode sont similaires à celle de n'importe quel modèle in vitro, y compris l'incapacité de reconstituer un système immunitaire compétent dans ces tissus. Bien lave quotidienne des tissus sont effectuées pour imiter la normale de la clairance mucociliaire, en établissant un débouché naturel pour la mucine produite dans ces tissus serait plus souhaitable 9. En outre, le contact avec NTHi est connu pour induire l'expression de mucine dans les cellules épithéliales respiratoires humaines, qui aggrave le problème 10. D'autre part, les lavages quotidiens EpiAirway peuvent être enregistrés et analysés pour des protéines ou des activités enzymatiques d'intérêt, ajoutant une dimension importante de la méthode et en augmentant son utilité.
Une étape clé de la performance réussie de cette méthode est la rupture mécanique des tissus avant d'abandonner le placage du NTHi (étape 7.10). Parce que le EpiAirways sont fortement différenciés et composé de multiples types de cellules, les tissus ne sont pas aussi faciles à se désintégrer en une monocouche de cellules, même après un traitement saponine. En outre, NTHi sont notoirement sensibles aux composés qui aident à la désagrégation des tissus. Par conséquent, nous avons constaté que le passage de la suspension cellulaire à travers une aiguille de calibre 26 améliore grandement notre capacité à générer une quantification cohérente et reproductible des bactéries internalisées ou associé aux cellules.
Une fois que cette technique est maîtrisée, elle peut également être utilisé pour étudier la capacité relative des souches mutantes de bactéries de survivre par rapport à leurs parents, de type sauvage, ce qui permet à l'enquêteur de caractériser les effets des mutations génétiques spécifiques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Patrick Hayden (MatTek) pour des discussions utiles, et Robert Smith et Perry Libby de Géorgie Health Sciences University pour leurs compétences EM. Cette étude a été financée par subventions NIDCD DC010187 à la BDCP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
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