Summary
Este método permite a caracterização de bactérias estendida co-cultura com EpiAirways primário, o tecido epitelial respiratório humano cresceu na interface ar-líquido, uma biologicamente relevantes
Abstract
Haemophilus influenzae não tipáveis (NTHi) são adaptadas aos humanos bactérias Gram-negativas que podem causar infecções recorrentes e crônica da mucosa respiratória 1, 2. Para estudar os mecanismos pelos quais estes organismos sobrevivem e no interior dos tecidos respiratórios, um modelo no qual sucesso a longo prazo co-cultura de bactérias e células humanas pode ser realizado é necessária. Usamos principal respiratório humano tecidos epiteliais elevado à interface ar-líquido, o modelo EpiAirway (Mattek, Ashland, MA). Estes não são imortalizados, bem diferenciado, 3-dimensional tecidos que contêm tight junctions, células ciliadas e nonciliated, células caliciformes que produzem mucina, e manter a capacidade de produzir citocinas em resposta à infecção.
Este biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos, pode ser usado em uma série de maneiras, o objetivo geral deste método é a realização de longo prazo co-cultura de tecidos EpiAirway com NTHi e quantificar células associadas bactérias e internalizado ao longo do tempo . Assim, a produção de mucina e do perfil de citocinas dos infectados co-culturas pode ser determinada. Esta abordagem melhora a métodos existentes, em que muitos protocolos atuais usam culturas submersas monocamada ou Transwell de células humanas, que não são capazes de suportar as infecções bacterianas durante longos períodos 3. Por exemplo, se um organismo pode replicar na mídia sobrejacente, isso pode resultar em níveis inaceitáveis de citotoxicidade e perda de células do hospedeiro, prendendo o experimento. O modelo EpiAirway permite a caracterização de longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno. Além disso, desde a origem para a EpiAirway é humano normal tráqueo-brônquica células, em vez de uma linha imortalizada, cada um é uma excelente representação do real tecidos do trato respiratório superior humano, tanto na estrutura como na função 4.
Para este método, os tecidos são desmamados EpiAirway off de compostos anti-microbial e anti-fúngicos por 2 dias antes da entrega, e todos os procedimentos são realizados sob condições livre de antibióticos. Isto requer considerações especiais, já que ambas as bactérias e primário tecidos humanos são usados na cabine de segurança biológica mesmo, e são co-cultivadas por longos períodos.
Protocol
1. Preparando o gabinete de biossegurança para os tecidos EpiAirway
- Vestindo um casaco de laboratório dedicado, com o cabelo amarrado para trás e luvas, iniciar o fluxo laminar. Após 5 minutos, mover todas as ferramentas no armário (pipetadores, dicas, tubos de centrífuga, etc) para um lado, pulverizar o interior do armário de biossegurança ea faixa com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pulverizar o interior limpo novamente com etanol 70% e deixar secar. Mover as ferramentas para o lado limpo e repita o procedimento de etanol.
- Use dicas barreira de aerossol pipeta e pipetadores no gabinete. Para utilizar individualmente embrulhados estéril pipetas sorológicas, passar o fim conectado através do fluxo laminar, quebrar, e deslize a pipeta no gabinete, descartando a parte externa da embalagem.
- As pastilhas EpiAirway devem ser manipulados com pinças esterilizadas. Lugar de 6 polegadas ponta fina curva dissecar forceps em bolsas auto-selante de esterilização e autoclave. Prepare o suficiente para ter, pelo menos, seis dias por pronto para uso.
2. Desembalar os tecidos EpiAirway
- Pulverizar a superfície de trabalho no gabinete de biossegurança com etanol 70% e limpar com toalhas de papel limpo. Pintar novamente e deixe a superfície secar antes de usar. Abrir a caixa de EpiAirway e descartar o isopor e material de embalagem.
- O EpiAirway mídia livre de antibióticos, manutenção AIR-100-MM ABF (MM), é propriedade da Mattek e é enviado no kit com as inserções. No armário de biossegurança, etiqueta seis tubos de centrífuga estéreis 50 ml com o tipo de mídia e data, e afrouxar as tampas. Pulverizar a garrafa de mídia com etanol 70% e abrir dentro do armário. Alíquota de 25 ml de MM em cada tubo utilizando uma pipeta estéril nova sorológicos para cada tubo, aperte as tampas, e armazenar a 4 ° C. Use uma nova porção da MM a cada dia.
- Repita 2.2 usando uma garrafa fresca de 1 X Dulbecco tampão fosfato (D-PBS) com cálcio e magnésio. Repita novamente usando D-PBS sem cálcio e magnésio. Armazenar todas as alíquotas a 4 ° C.
- As pastilhas EpiAirway AIR-100 chegar em uma placa de 24 poços a 4 ° C em meios contendo sólidos agarose, e deve ser colocado em 6 bem-placas para uso. Etiquetar cada placa com a data ea descrição usando um marcador de etanol-resistente. Mililitro coloque 1 de 4 MM EpiAirway ° C em cada poço. Remova a placa de transporte de sua embalagem, spray com etanol 70%, e colocar no gabinete de biossegurança. Remova a fita e abra a placa. Utilizando uma pinça esterilizada, retire a gaze umedecida sobre as inserções EpiAirway.
- Pegue uma inserção com uma pinça autoclavado usando um movimento de torção para ajudar na liberá-lo do agarose, e coloque em um poço de uma placa de 6 poços. Alguns agarose podem aderir ao inserir, particularmente quando a temperatura da placa de transporte aumenta a temperatura ambiente. Use um cotonete estéril para remover cuidadosamente a agarose a partir da inserção. Evite tocar a membrana, e verifique se não existem bolhas de ar ficam presos embaixo da inserts. Coloque a placa em um umidificado 37 ° C incubadora com 5% de CO 2.
- Permitir que pelo menos 24 horas para os tecidos para equilibrar na incubadora antes de iniciar co-culturas.
3. Manutenção dos tecidos EpiAirway
- Utilizando uma pinça esterilizada, pegar uma inserção e gentilmente pipeta 200 microlitros de pré-aquecido D-PBS com cálcio e magnésio para o tecido e rock a inserção. Incline a inserir em um ângulo e coloque a ponta da pipeta estéril P1000 contra o anel de plástico que contém a membrana na parte inferior da pastilha. Não toque no tecido. Aspirar o D-PBS lavar e colocar em um cryovial rotulados estéril. As amostras podem ser congeladas a -20 ° C e analisadas para mucina e / ou expressão de citocinas em uma data posterior.
- Mudar o MM basal diariamente por aspiração e substituir por um mililitro de MM fresco. Use uma ponteira de pipeta nova barreira para cada poço. Tratar o material usado com água sanitária a 10% durante a noite e de descarte.
4. Inoculação de tecidos EpiAirway
- Expelido de uma cultura fresca de Haemophilus influenzae não tipáveis (NTHi) do estoque de glicerol congelados em ágar chocolate. Crescer durante a noite em um umidificado 5% incubadora de CO 2.
- No dia seguinte, ressuspender colônias única de NTHi em pré-aquecido D-PBS com cálcio e magnésio para um OD (600 nm) de aproximadamente 0,7. Vortex vigorosamente antes de medir a densidade óptica. A relação da densidade óptica de unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC / ml) de NTHi é que um OD (600 nm) de 0,2 é aproximadamente igual 1,0 x 10 8 UFC / ml. Portanto, um OD (600 nm) de 0,7 é cerca de 3,5 x 10 8 UFC / ml. Este algoritmo deve ser validado para cada cepa NTHi antes da inoculação.
- Os tecidos EpiAirway AIR-100 são cultivadas em inserções com uma superfície de 0,6 cm 2 e 0,4 micron uma membrana. Os tecidos são compostos de aproximadamente 8,0 x 10 5 a ~ 1,0 x 10 6 </ Sup células>. Portanto, uma inoculação de 1,0 x 10 7 UFC corresponde a uma multiplicidade de infecção de cerca de 10 - 12. Para inocular, lavar cada inserção EpiAirway como no 3.1, em seguida, adicionar 28 microlitros da suspensão bacteriana preparada em 4.2 para a superfície apical de cada inserção EpiAirway no gabinete de biossegurança. Não inocular o MM basal. Retorno de cada placa para a incubadora.
5. Quantificação do inóculo NTHi
- Preparar um tampão fosfato solução (PBS) com 0,1% de gelatina (PBS-G) autoclave, para esterilizar. Rótulo estéril de 1,5 ml tubos Eppendorf com as diluições 1:10 desejado baseado no OD (600 nm) do inóculo e alíquota 900 microlitros da PBS estéril-G em cada tubo.
- Determinar o número de placas de chocolate agar necessário para enumerar os NTHi inoculados. Colocar essas placas em uma incubadora de ar de cabeça para baixo com a parte inferior da placa de descanso na metade da parte superior de uma hora. Isso permitirá que a placa para tanto quente a 37 ° C e secar a superfície, facilitando a queda de placas de NTHi.
- Iniciar a diluições em série 1:10 do inóculo adicionando 100 microlitros da suspensão bacteriana de 4,2 para o primeiro tubo. Vortex cada diluição vigorosamente durante 5 segundos antes de fazer o próximo. Queda de 10 alíquotas microlitro sobre os pratos de agar pré-aquecido e superfície seca chocolate, usando a metade da placa para cada diluição. Cinco a seis alíquotas de 10 microlitros pode caber em uma metade de cada placa de 100 mm sem correr juntos. Ao local seco, de cabeça para baixo em um 37 ° C umidificado incubadora de CO 2 durante a noite.
- No dia seguinte, determinar o UFC / ml, contando as diluições que têm 15-30 colônias distintas em cada gota e cálculo de volta ao seu real inóculo viável de NTHi.
6. Longo prazo co-cultura com NTHi
- A cada 24 horas, lavar as inserções como em 3.1, então o pool de lavagens de cada tecido que tenha sido inoculados com a mesma cepa de bactérias e congelar a -20 ° C em um cryovial rotulados para análise futura. Essas amostras podem ser analisadas para a presença de mucina por dot blots ou para a expressão de citocinas por ELISA. Alternativamente, os tecidos podem ser colhidas para mRNA e qPCR pode ser executada em genes de interesse. Mudar o MM basal diária como em 3.2. Continue para a duração da co-cultura.
7. Colheita de tecidos EpiAirway
- Prepare uma nova solução de 1% de saponina em D-PBS sem cálcio e magnésio, filtro de esterilizar e quente a 37 ° C.
- Aquecer um tubo de 50 ml de MM e outro de D-PBS sem cálcio e magnésio a 37 ° C.
- Prepare os tubos de diluição como em 5.1, bem como um vazio estéril de 1,5 ml por tubo Eppendorf de inserção, marcado com o número de inserção e tensão NTHi.
- O EpiAirways podem ser colhidas para qualquer total de associados a células de bactérias, que inclui tanto os organismos aderentes e internalizada, ou para as bactérias internalizadas apenas.
- Determinar o número de placas de ágar chocolate necessária para soltar placa da célula associada ou invadido NTHi, rotular e secar por uma hora em uma incubadora de ar como em 5.2.
- A colheita total associados a células de bactérias, lavar a superfície apical da EpiAirways três vezes com 200 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio, em seguida, incline a inserção e enxaguar qualquer MM remanescentes da membrana basal. A primeira lavagem pode ser congelado para posterior análise; descartar as lavagens seguintes.
- Coloque a inserção lavados em uma placa de 6-bem fresca sem MM, e pipetar 250 microlitros da solução de 1% estéril saponina de 7,1 sobre a superfície apical de cada tecido. Voltar para a incubadora por 10 minutos.
- Remover da incubadora, e usando uma ponteira de pipeta estéril P1000, esfrega os tecidos da membrana usando um back-e-vem, seguido por um movimento circular para remover o tecido das bordas da pastilha. Usando um grande furo ponteira estéril P1000, coloque a suspensão no tubo vazio marcado preparadas em 7.3. Adicione 250 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio na superfície apical da inserção.
- Examinar a inserção utilizando um microscópio de contraste de fase invertido para determinar se há qualquer tecido remanescente a ser colhida. Se necessário, esfregue novamente com outra ponta da pipeta estéril P1000, em seguida, adicione esta suspensão para o tubo de 7,8 usando um grande furo ponteira estéril P1000. Trazer o volume total do tubo para 1 mililitro usando D-PBS sem cálcio ou magnésio.
- Vortex vigorosamente a suspensão de células em alta velocidade por um minuto. Usando uma seringa estéril 1 ml com agulha calibre 26, aspirar a suspensão para a seringa através da agulha. Lentamente passa a suspensão através da agulha 3 vezes, tomando cuidado para não criar bolhas. Vortex vigorosamente de novo durante um minuto.
- Usando um grande furo ponta da pipeta, coloque 100 microlitros da suspensão para dentro do tubo de diluição preparado pela primeira vez em 7.3. Vortex vigorosamente durante cinco segundos, em seguida, fazer diluições em série 1:10. Queda da placa-as diluições desejadas sobre a superfície seca placas de ágar-chocolate.
- Para colher as bactérias internalizadas apenas, lave cada inserção 3 vezes com 200 microlitros de D-PBS sem cálcio ou magnésio. Reter e congelar a primeira lavagem. Adicionar sulfato de gentamicina para pré-aquecido MM a uma concentração final de 100 microgramas / ml. Prepare 1,5 ml de mídia por inserir a ser colhida. Substituir o MM basal com o MM contendo gentamicina, e adicionar 300 microlitros de gentamicina contendo MM na superfície apical. Coloque a placa de volta para a incubadora de CO 2 por uma hora.
- Remover o MM gentamicina contendo a partir da superfície apical e lavar a superfície apical ea membrana basal da inserção extensivamente com pré-aquecido D-PBS sem cálcio e magnésio. Proceder como no 7,7-7,11.
8. Resultados representativos:
Eletromicrografias de varredura da (A.) tecido EpiAirway não infectados e (B.) tecido após a 5 dias de co-cultura com NTHi são mostrados na Figura 1. Longo prazo co-cultura com NTHi não resulta em danos significativos à apical tecidos, ressaltando a utilidade do modelo EpiAirway. Um gráfico mostrando o número de bactérias internalizadas quantificados ao longo do tempo dentro de tecidos é mostrado na Figura 2. Ambos os resultados são bastante reprodutível, tornando os tecidos EpiAirway uma consistente e biologicamente relevantes modelo in vitro das vias aéreas superiores humanos para estudar NTHi Hospedeiro-Patógeno interações.
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura de tecidos EpiAirway. A. tecido controle não infectado. B. Tissue após cinco dias de co-cultura com NTHi. Sem danos significativos à superfície apical é observada nos tecidos infectados.
Figura 2. Número de NTHi internalizadas ao longo do tempo durante EpiAirway co-cultura. Strain R2866 foi inoculado em aproximadamente 1,0 x 10 7 UFC / insert (Dia 0), então colhidas para as bactérias internalizadas em cada momento indicado. Barras representam n = 3 repetições em pelo menos duplicado. Barras de erro são SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método permite a investigação de longo prazo interações patógeno-hospedeiro em um fundo biologicamente relevantes do ensino primário humana tecidos respiratórios na interface ar-líquido. Aqui nós temos utilizado NTHi como o organismo infectante, mas a interação de qualquer bactéria que não apresenta citotoxicidade inaceitáveis ao longo do tempo pode ser quantificado com este método. O modelo EpiAirway também pode ser usado para o estudo de vírus, drogas ou produtos químicos que afetam as vias aéreas superiores humanos, 5, 6, 7, 8. Mantivemos tecidos não infectados por mais de 40 dias, e os tecidos infectados com NTHi por pelo menos 10 dias. Esperamos que os tecidos infectados poderia ser mantida por muito mais tempo, se desejar.
As limitações deste método são semelhantes ao de qualquer modelo in vitro, incluindo a incapacidade de reconstituir um sistema imunológico competente nestes tecidos. Embora lavagens diárias de os tecidos são realizadas para imitar a depuração mucociliar normais, estabelecendo uma saída natural para a mucina produzida nestes tecidos seria mais desejável 9. Além disso, o contato com NTHi é conhecido por induzir a expressão de mucina em humanos células epiteliais respiratórias, agravando o problema 10. Por outro lado, o lava EpiAirway diária podem ser salvas e ensaiadas para proteínas ou atividades enzimáticas de interesse, acrescentando uma dimensão importante para o método e aumentar a sua utilidade.
Um passo fundamental no desempenho de sucesso deste método é a ruptura mecânica dos tecidos antes de drop-plating do NTHi (passo 7.10). Porque o EpiAirways são altamente diferenciadas e composto por vários tipos de células, os tecidos não são tão fáceis de se desintegrar como uma monocamada de células, mesmo após o tratamento saponina. Além disso, NTHi são notoriamente sensíveis aos compostos que auxiliam na desagregação dos tecidos. Portanto, nós descobrimos que passar a suspensão de células através de uma agulha de calibre 26 melhora muito a nossa capacidade de gerar quantificação consistente e reproduzível de bactérias internalizadas ou associados a células.
Uma vez que esta técnica é dominada, ela também pode ser utilizada para investigar a capacidade relativa de cepas de bactérias mutantes para sobreviver quando comparados com os do tipo selvagem pais, permitindo que o investigador para caracterizar os efeitos das mutações genéticas específicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Patrick Hayden (Mattek) para discussões úteis, e Robert Smith e Libby Perry da Geórgia Health Sciences University por suas habilidades de EM. Este estudo foi financiado pela NIDCD conceder DC010187 de DAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
