Summary
Denna metod gör det möjligt karakterisering av utökad bakteriell co-kultur med EpiAirways, primära humana respiratoriska epitelvävnad vuxit på luft-vätska gränssnitt, ett biologiskt relevanta
Abstract
Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) är mänskliga anpassade gramnegativa bakterier som kan orsaka återkommande och kroniska infektioner i luftvägarna slemhinnan 1, 2. Att studera de mekanismer genom vilka dessa organismer lever på och inuti luftvägarna vävnader, en modell där framgångsrik långsiktig samverkan kultur av bakterier och mänskliga celler kan utföras krävs. Vi använder primärt mänskliga andningsskydd epitelvävnader höjas till luft-vätska gränssnitt, EpiAirway modellen (Mattek, Ashland, MA). Dessa är icke-förevigats, väl differentierade, 3-dimensionell vävnader som innehåller tight junctions, cilierade och nonciliated celler, bägare celler som producerar mucin, och behålla förmågan att producera cytokiner som svar på infektion.
Detta biologiskt relevanta in vitro-modell av det mänskliga övre luftvägarna kan användas på flera sätt, det övergripande målet med denna metod är att göra långsiktiga co-kultur EpiAirway vävnader med NTHi och kvantifiera cell-associerade och internaliserade bakterier över tiden . Som väl kan mucin produktion och cytokin profil infekterade co-kulturer bestämmas. Detta tillvägagångssätt förbättrar befintliga metoder i att många nuvarande protokoll använder nedsänkt monolayer eller Transwell kulturer av mänskliga celler, som inte kan stödja bakteriella infektioner under längre perioder 3. Till exempel, om en organism kan replikera i den överliggande media, kan det leda till oacceptabla nivåer av cytotoxicitet och förlust av värdceller, arrestera experimentet. Den EpiAirway modellen kan karakterisering av långsiktiga värd-patogen interaktioner. Vidare, eftersom källan för EpiAirway är normalt mänskligt tracheo-bronkial celler snarare än ett förevigat linje, varje en utmärkt representation av verkliga mänskliga övre luftvägarna vävnad, både i struktur och funktion 4.
För denna metod, EpiAirway vävnaderna är avvanda bort av antibakteriella och anti-svamp föreningar för 2 dagar före leverans, och alla försök utförs under antibiotika-fria förhållanden. Detta kräver särskilda överväganden, eftersom både bakterier och primära mänskliga vävnader som används i samma biosäkerhet skåp, och co-odlade under längre perioder.
Protocol
1. Förbereda biosäkerhet skåpet för EpiAirway vävnader
- Iklädd en dedikerad labbrock, med hår bundna tillbaka och handskar på, starta laminära flödet. Efter 5 minuter, flytta alla verktyg i skåpet (pipetter, tips, centrifugrör, etc.) åt sidan, spraya biosäkerhet skåp inredning och båge med 70% etanol och torka av med ren hushållspapper. Spraya rengöras inredningen igen med 70% etanol och låt torka. Flytta verktyg till rena sidan och upprepa etanol proceduren.
- Använd aerosol tips barriär pipett och engagerade pipetter i skåpet. För att använda individuellt förpackade sterila serologiska pipetter, passera inkopplad ändan genom laminärt flöde, bryta, och skjut pipetten i skåpet och kasta förpackningen utanför.
- Den EpiAirway insatser måste hanteras med steril pincett. Placera 6-tums fin spets böjda dissekera pincetten i självtätande sterilisering påsar och autoklav. Förbered nog att ha minst sex per dag klar för användning.
2. Packa upp EpiAirway vävnader
- Spraya arbetet ytan i biosäkerhet skåpet med 70% etanol och torka av med ren hushållspapper. Spraya igen och låt ytan torka före användning. Öppna EpiAirway rutan och kasta frigolit och förpackningsmaterial.
- Den EpiAirway antibiotika-fria underhåll medier, AIR-100-MM ABF (MM), ägs av Mattek och skickas i kit med skären. I biosäkerhet skåp, etikett sex sterila 50 rör ml centrifugrör med media typ och datum, och lossa locken. Spray media flaskan med 70% etanol och öppna skåpet. Alikvotera 25 ml av MM i varje rör med en ny steril serologisk pipett för varje rör, dra åt lock och förvara vid 4 ° C. Använd en ny portion av MM varje dag.
- Upprepa 2.2 ovan med hjälp av en ny flaska 1 X Dulbecco är fosfatbuffrad koksaltlösning (D-PBS) med kalcium och magnesium. Upprepa igen med D-PBS utan kalcium och magnesium. Förvara alla alikvoter vid 4 ° C.
- Den EpiAirway skär AIR-100 kommer i en 24-brunnar vid 4 ° C på fasta medier som innehåller agaros, och måste placeras i 6-brunnars plattor för användning. Etikett varje platta tillsammans med datum och beskrivning genom en etanol-resistent markör. Plats 1 milliliter 4 ° C EpiAirway mm i varje brunn. Ta bort transport plattan ur förpackningen, spruta med 70% etanol, och plats i biosäkerhet skåpet. Ta bort tejpen och öppna plattan. Använda autoklaveras pincett, ta bort den fuktiga gasväv över EpiAirway skär.
- Plocka upp en insats med autoklaveras pincett med en vridande rörelse för att hjälp för att lösa ut den från agaros, och placera i en brunn i en 6-brunnar. Vissa agaros kan ansluta sig till insatsen, särskilt som temperaturen på transporter plattan ökar till omgivande. Använd en steril bomullspinne att försiktigt ta bort agarosen från insatsen. Undvik att röra vid membranet, och kontrollera att inga luftbubblor fastnar under insatser. Placera plattan i en fuktig 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- Låt minst 24 timmar för de vävnader till jämvikt i inkubatorn innan co-kulturer.
3. Underhåll av EpiAirway vävnader
- Använda autoklaveras pincett, plocka upp en in och försiktigt pipettera 200 mikroliter av förvärmda D-PBS med kalcium och magnesium på vävnaden och rock insatsen. Luta in i vinkel och lägg steril spets P1000 pipett mot den plastringen som håller membranet på botten av insatsen. Rör inte vävnaden. Sug D-PBS skölj och lägg i ett märkt steril cryovial. Prover kan frysas vid -20 ° C och analyseras för mucin och / eller cytokinuttryck vid ett senare tillfälle.
- Ändra basala MM dagligen av aspirera och ersätta med 1 ml av färsk MM. Använd en ny spets barriär pipett för varje brunn. Behandla används media med 10% blekmedel över natten och kasta.
4. Inympning av EpiAirway vävnader
- Streak ut en ny kultur av nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) från frysta glycerol lager på choklad agar. Växa över natten i en fuktig 5% CO 2 inkubator.
- Nästa dag resuspendera enstaka kolonier av NTHi i förvärmda D-PBS med kalcium och magnesium till en OD (600 nm) på cirka 0,7. Vortex kraftfullt innan mäta den optiska densiteten. Förhållandet mellan optisk densitet kolonibildande enheter per ml (CFU / ml) NTHi är att en OD (600 nm) på 0,2 ungefär lika med 1,0 x 10 8 CFU / ml. Därför är en OD (600 nm) på 0,7 ca 3,5 x 10 8 CFU / ml. Denna algoritm bör godkännas för varje NTHi stam före ympningen.
- Den EpiAirway vävnader AIR-100 odlas på skär med en yta av 0,6 cm 2 och en 0,4 micron membran. Vävnaderna består av ~ 8,0 x 10 5 till ~ 1,0 x 10 6 </ Sup> celler. Därför motsvarar en inympning av 1,0 x 10 7 CFU till en mångfald av infektion i ca 10 - 12. För att ympa, skölj varje EpiAirway in som i 3,1, lägg sedan till 28 mikroliter av bakteriesuspensionen upprättats i 4,2 till apikala ytan på varje EpiAirway in i biosäkerhet skåpet. Inte ympa den basala MM. Återgå varje platta till inkubatorn.
5. Kvantifiering av NTHi inokulatet
- Förbered en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning med 0,1% gelatin (PBS-G), autoklav för att sterilisera. Etikett sterila 1,5 ml Eppendorf-rör med önskad 1:10 spädningar baseras på OD (600 nm) av inokulatet och delprov 900 mikroliter av den sterila PBS-G i varje rör.
- Bestäm antal plattor choklad agar som krävs för att räkna upp de inokulerade NTHi. Placera dessa plattor i en luft inkubator upp och ned med botten av plattan vilar på hälften av den översta i en timme. Detta gör det möjligt plattan både varm till 37 ° C och ytan torka, underlätta drop-plätering av NTHi.
- Starta seriella 1:10 utspädningar av inokulatet genom att lägga till 100 mikroliter av bakteriesuspensionen från 4,2 till det första röret. Vortex varje spädning kraftigt i 5 sekunder innan du köper nästa. Drop 10 mikroliter alikvoter på förvärmda och utanpåliggande torkade plattor choklad agar, med halva tallriken för varje utspädning. Fem till sex 10 mikroliter alikvoter som får plats på en halv av varje 100 mm platta utan att köra tillsammans. När torr, placera upp och ner i en fuktig 37 ° C CO 2 inkubator natten.
- Nästa dag, bestämmer CFU / ml genom att räkna de spädningar som har 15-30 olika kolonier i varje droppe och beräkning tillbaka till din faktiska livskraftiga inokulum av NTHi.
6. Långsiktigt samarbete kultur med NTHi
- Var 24 timme, tvätta insatser som i 3,1, sedan slå ihop de tvättar av varje vävnad som har inokuleras med samma stam av bakterier och frys vid -20 ° C i en märkt cryovial för framtida analys. Dessa prover kan analyseras för förekomst av mucin-punkt blots eller för uttrycket av cytokiner med ELISA. Alternativt kan vävnader skördas för mRNA och qPCR kan utföras på gener av intresse. Ändra basala MM dagligen som i 3.2. Fortsätt så länge det co-kultur.
7. Skörd av EpiAirway vävnader
- Bered en färsk 1% lösning av saponin i D-PBS utan kalcium och magnesium, filter-sterilisera och värm till 37 ° C.
- Värm en 50 ml tub med MM och en annan av D-PBS utan kalcium och magnesium till 37 ° C.
- Förbered spädning rör som i 5,1, samt en tom steril 1,5 ml Eppendorf-rör per skär, märkt med Infoga nummer och NTHi stam.
- Den EpiAirways kan skördas för antingen total cell-associerade bakterier, vilket inkluderar både anhängare och internaliserad organismer, eller för internaliserad bakterier.
- Bestäm antal plattor choklad agar som behövs för att drop-platta på cell-associerade eller invaderade NTHi, etikett och torka i en timme i en luft inkubator som i 5,2.
- Skörda totalt cell-associerade bakterier, skölj apikala yta EpiAirways tre gånger med 200 mikroliter av D-PBS utan kalcium eller magnesium, sedan luta insatsen och skölj eventuellt återstående mm från basalmembran. Den första tvätten kan frysas för senare analys, kassera efter tvättar.
- Placera tvättas in i en ny 6-brunnar utan MM, och pipettera 250 mikroliter av den sterila 1% saponin lösning från 7,1 på den apikala ytan på varje vävnad. Återgå till inkubatorn i 10 minuter.
- Ta bort från inkubatorn, och med en steril P1000 pipettspets, skrubba vävnader från membranet med hjälp av en fram-och-tillbaka rörelse, följt av en cirkelrörelse för att ta bort vävnad från kanterna av insatsen. Med hjälp av en stor bar steril spets P1000 pipett, placera suspensionen till den märkta tomma röret upprättats i 7,3. Tillsätt 250 mikroliter av D-PBS utan kalcium eller magnesium på apikala ytan av insatsen.
- Undersök in med ett inverterat faskontrastmikroskop att avgöra om det finns någon kvarvarande vävnad att skördas. Om det behövs skrubba igen med en annan steril P1000 pipettspetsen, lägg sedan till denna suspension till att röret från 7,8 med hjälp av en stor bar steril spets P1000 pipett. Ta med den totala volymen av röret till 1 ml med hjälp av D-PBS utan kalcium eller magnesium.
- Kraftigt virvel cellsuspensionen i full fart i en minut. Med en steril 1 ml spruta med en 26 gauge kanyl, aspirera suspensionen i sprutan genom nålen. Sakta passerar suspensionen genom nålen 3 gånger och var noga med att inte skapa bubblor. Vortex kraftigt igen under en minut.
- Med hjälp av en stor bar pipettspetsen, plats 100 mikroliter av fjädring i den första spädningen röret upprättats i 7.3. Vortexa kraftigt i fem sekunder, gör sedan seriella 1:10 spädningar. Drop-platta önskad spädningar på ytan-torkade plattor choklad agar.
- Att skörda internaliserade bakterier bara tvätta varje in 3 gånger med 200 mikroliter av D-PBS utan kalcium eller magnesium. Behåll och frysa den första tvätten. Lägg gentamicin sulfate att förvärmas MM till en slutlig koncentration på 100 mikrogram / ml. Förbered 1,5 ml av media per skär att skördas. Byt ut den basala mm med gentamicin innehåller MM och lägga 300 mikroliter av gentamicin innehåller MM på apikala ytan. Placera plattan tillbaka in i CO 2-inkubator för en timme.
- Ta bort gentamicin innehåller mm från apikala ytan och tvätta apikala ytan och basalmembran av insatsen mycket med förvärmda D-PBS utan kalcium och magnesium. Fortsätt som i 7,7-7,11.
8. Representativa resultat:
Skanning elektron micrographs av (A) oinfekterade EpiAirway vävnad och (B.) vävnad efter en 5-dagars co-kultur med NTHi visas i figur 1. Långsiktigt samarbete kultur med NTHi inte medför betydande skada för den apikala vävnader, vilket understryker nyttan av den EpiAirway modell. En graf som visar antalet internaliserade bakterier kvantifieras över tiden inne vävnader visas i figur 2. Bägge resultaten är ganska reproducerbara, vilket gör EpiAirway vävnader en konsekvent och biologiskt relevanta in vitro-modell av det mänskliga övre luftvägarna där för att studera NTHi värd-patogen interaktioner.
Figur 1. Svepelektronmikroskopi av EpiAirway vävnader. A. infekterade kontroll vävnad. B. Vävnadsbestämmande efter fem dagars samarbete kultur med NTHi. Inga väsentliga skador på apikala ytan observeras i den infekterade vävnaden.
Figur 2. Antal NTHi internaliserad över tiden under EpiAirway co-kultur. Sila R2866 var inokuleras i ca 1,0 x 10 7 CFU / infoga (Dag 0), sedan skördas för internaliserad bakterier vid varje angivna tidpunkt. Stapel n = 3 replikat i minst två exemplar. Felstaplar är SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod gör det möjligt att utreda långsiktiga värd-patogen interaktioner i en biologiskt relevant bakgrund av primära mänskliga respiratoriska vävnad vid luft-vätske-gränssnitt. Här har vi använt NTHi som den infekterande organismen, men samverkan av någon bakterie som inte medför oacceptabla cytotoxicitet över tiden kan kvantifieras med denna metod. Den EpiAirway Modellen kan också användas för studier av virus, droger eller kemikalier som påverkar det mänskliga övre luftvägarna 5, 6, 7, 8. Vi har behållit oinfekterade vävnader i mer än 40 dagar, och vävnader infekterade med NTHi i minst 10 dagar. Vi förväntar oss att infekterade vävnader kan bibehållas under betydligt längre, om så önskas.
Begränsningarna med denna metod liknar den som varje in vitro-modell, bland annat oförmågan att rekonstruera ett kompetent immunförsvar i dessa vävnader. Även dagliga tvättar av vävnader utförs för att efterlikna normala mucociliary clearance, inrättande av ett naturligt utlopp för mucin som produceras i dessa vävnader vore mer önskvärt 9. Vidare kontakt med NTHi kan inducera mucin uttryck i människans andningsvägar epitelceller, vilket förvärrar problemet 10. Å andra sidan kan den dagliga EpiAirway tvättar sparas och analyseras för proteiner eller enzymatiska aktiviteter av intresse, lägga till en viktig dimension till metoden och öka dess användbarhet.
Ett viktigt steg i den framgångsrika resultat med denna metod är den mekaniska störningar av vävnader före drop-plating de NTHi (steg 7,10). Eftersom EpiAirways mycket differentierade och består av flera celltyper, vävnader är inte lika lätt att falla sönder som en cell monolager, även efter saponin behandling. Dessutom NTHi är notoriskt känsliga för föreningar som stöd i uppdelning av vävnader. Därför har vi funnit att passera cellsuspension genom en 26 nål avsevärt förbättrar vår förmåga att generera konsekventa och repeterbara kvantifiering av internaliserad eller cell-associerade bakterier.
När denna teknik behärskas, kan det också användas för att undersöka den relativa förmågan hos muterade bakteriestammar att överleva jämfört med sina vilda-typ föräldrar, vilket gör att utredaren att karakterisera effekterna av specifika genetiska mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Patrick Hayden (Mattek) för hjälpsamma diskussioner, och Robert Smith och Libby Perry Georgiens Health Sciences University för sina EM färdigheter. Denna studie har finansierats av NIDCD bevilja DC010187 till DAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
