Summary
Förutsägelsen av coreceptor användning av HIV-1 krävs för administrationen av en ny klass av antiretrovirala läkemedel, dvs coreceptor antagonister. Det kan utföras genom sekvensanalys av
Abstract
Maravirok (MVC) är den första licensierade antiretrovirala läkemedel från klassen coreceptor antagonister. Det binder till värden coreceptor CCR5, som används av de flesta HIV-stammar för att infektera de humana immunceller (Fig. 1). Andra HIV-isolat använder en annan coreceptor, CXCR4. Vilken receptor används, bestäms i viruset av Env-protein (fig. 2). Beroende på den använda coreceptor, är virusen klassas som R5 eller X4, respektive. MVC binder till CCR5-receptorn inhiberar inträdet av R5 virus i målcellen. Under sjukdomen kan X4 virus uppstår och växa R5 virus. Fastställande av coreceptor användning (även kallad tropism) är därför obligatoriskt före administrering av MVC, som begärts av EMA och FDA.
Studierna för MVC effektivitet motivera, meriter och 1029 har utförts med Trofile analysen från Monogram, San Francisco, USA Det här är en högkvalitativ analys baserad på Sophisticated rekombinanta tester. Acceptansen för detta test för daglig rutin är ganska låg utanför USA, eftersom de europeiska läkarna snarare tenderar att arbeta med decentraliserade expertlaboratorier, som också ger samtidig resistenstestning. Dessa laboratorier har genomgått flera utvärderingar kvalitetssäkring, det sista en som presenteras i 2011 1.
Under flera år har vi utfört tropism bestämningar baserade på sekvensanalys från HIV-env-V3-gen-regionen (V3) 2. Denna region bär tillräckligt med information för att göra en tillförlitlig prognos. Den genotypisk bestämning av coreceptor användning ger fördelar såsom: kortare omsättningstid (motsvarande resistensbestämning), lägre kostnader, möjlighet att anpassa resultaten till patienternas behov och möjlighet att analysera kliniska prover med mycket låg eller till och med odetekterbar virusmängd (VL ), särskilt eftersom antalet prover som analyseras med VL <1000 kopior / ilgrovt ökat under de senaste åren (fig. 3).
De viktigaste stegen för tropism test (Fig. 4) visade i denna video:
1. Uppsamling av ett blodprov
2. Isolering av HIV-RNA från plasma och / eller HIV-proviralt DNA från mononukleära blodceller
3. Amplifiering av env-regionen
4. Amplifiering av V3-regionen
5. Sekvens reaktion av V3 amplikon
6. Rening av sekvenseringen proverna
7. Sekvensering de renade proverna
8. Sekvens redigering
9. Sekvensering tolkning av data och tropism förutsägelse
Protocol
Protokollet sammanfattas i figur. 4.
1. Insamling av blodprover
- Samla minst 3 ml blod i EDTA-rör vid den kliniska platsen.
- Proverna kan förvaras upp till en vecka vid 4 ° C.
- Skicka EDTA-blodprover så snart som möjligt till laboratoriet med vanlig post.
2. Isolering av HIV RNA och / eller DNA
- Skaffa viralt RNA och / eller DNA från 1000 xl helblod, serum eller plasma, med Magna Ren Kompakt nukleinsyraisolering I kitet I och Magna Ren Compact Systemet.
- Eluera den fick RNA eller DNA i 50 pl TE-buffert. Alternativt kan andra nukleinsyror reningsförfaranden användas.
3. Amplifiering av env-regionen
Amplifiera env-regionen (fig. 2 och 4) från antingen plasma-RNA eller proviralt DNA. En 1245 bp lång produkt, innefattande huvuddelen av Env-proteinet (nt 6556-7811 according till HXB2) genereras.
- RNA-prover: RT-PCR-reaktion
- Viralt RNA uppvisar en mycket komplex sekundärstruktur (fig 4) som kan hindra RT-reaktionen. För att undvika detta problem, inkubera 10 pl RNA vid 65 ° C under 10 minuter (redan i PCR-rör och i PCR-maskinen) och sedan sänka temperaturen till 50 ° C.
- Tillsätt 40 | il av PCR Master Mix inklusive primrarna Env-F och Env-R.
Master Mix för RT-PCR In-House-system:volym / reaktion (il) slutlig koncentration RNas-fri H-2 O 14,4 5x buffert (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 10 1x 5x Q-lösning 10 1x dNTP-blandning (10 mM vardera) <td> 2400 | iM av varje dNTP Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 2 Primer Env-F (100 iM) 0,3 0,6 pM Primer Env-R (100 pM) 0,3 0,6 pM RNas-inhibitor (RNasin) 1 5 enheter / reaktion
Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 enligt HXB2)
Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) - Kör RT-reaktionen vid 50 ° C under 30 minuter.
- Kör den första PCR enligt följande:
95 ° C, 15 min 1 X 95 ° C, 30 sek
50 ° C, 30 sek
72 ° C, 2 minuter 1 X95 ° C, 30 sek
56 ° C, 30 sek
72 ° C, 2 minuter38 X 72 ° C, 10 minuter
4 ° C ∞
- DNA-prover: PCR-reaktion
För provirala DNA-prover, är ingen initial RT-reaktion behövs, och PCR-reaktionen kan direkt starta.- Tillsätt 40 | il av PCR Master Mix till 10 pl provial DNA.
Master Mix för PCR In-House-system:volym / reaktion (il) slutlig koncentration RNas-fri H-2 O 15,4 5x buffert (HotStarTaq DNA-polymeras) 10 1x 5x Q-lösning 10 1x dNTP-blandning (10 mM vardera) 2 400 | iM av varje dNTP Enzym-Mix (HotStarTaq DNA-polymeras) 2 Primer Env-F (100 iM) 0,3 0,6 pM Primer Env-R (100 pM) 0,3 0,6 pM
Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586)
Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) - Kör PCR-betingelser som tidigare beskrivits för RNA-prover (steg 3.1.4).
- Tillsätt 40 | il av PCR Master Mix till 10 pl provial DNA.
4. Amplifiering av V3-regionen: innesluten PCR
- För innesluten PCR, använder 5 pl från den första PCR-reaktionen (utan föregående analys i agarosgel) som templat och tillsätt 95 pl av PCR MasTER Blanda.
Master Mix för kapslade-In-House-PCRvolym / reaktion (il) slutlig koncentration H 2 O 61,9 10x PCR-buffert 10 1x 5x Q-lösning 20 1x dNTP-blandning (10 mM vardera) 2 200 pM av varje dNTP Primer Env-2F (100 pM) 0,3 0,6 pM Primer Env-2R (100 pM) 0,3 0,6 pM HotStarTaq DNA-polymeras 0,5 2,5 enheter / reaktion
Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864)- Kör PCR enligt följande:
93 ° C, 15 min1 X 95 ° C, 30 sek
50 ° C, 30 sek
72 ° C, 90 sek1 X 95 ° C, 30 sek
56 ° C, 30 sek
72 ° C, 90 sek43 X 72 ° C, 10 minuter
4 ° C ∞- Analysera PCR-produkten på en 1% agarosgel (fig. 4). Den förväntade produkten är 902 bp lång.
- Rening av sekvenseringen proven.
- Rena PCR-produkten med Qiagen PCR-Purification Kit, med hjälp av protokollet, lösningar och mikro-kolonner som tillhandahålls av leverantören. Eluera på 30-100 pl PE-buffert, beroende på bandintensitet.
- Alternativt kan proven renas med användning ExonukleasJag och Fast AP (Thermo alkaliskt fosfatas). För detta ändamål, lägg 6 pl exo-AP-Mix till 15 pl PCR-produkt och inkubera 15 minuter vid 37 ° C.
580 pl H-2 O 66 ul snabb AP 13,4 ul Exo I
- Kör PCR enligt följande:
5. Sekvens reaktion av V3 amplikon
- Sekvensen reaktion består av en PCR-reaktion med användning av endast en av följande primrar:
Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980)
Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371)
Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000)
Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549)
Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507)
Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664)
Första val primers är: Env-2, Env-6 eller Env-7, Env-11 - Använd 1 pl från det renade V3 amplikonen som mall och tillsätt 9 ul PCR Master-mix.
Sekvensering Master Mix:4 pl sekvens blandning (HIV-Genotypning Kit) 4 il H 2 O 1 il primer (100 pmol / | il) - Kör sekvensen reaktionen enligt följande:
96 ° C, 10 sek 50 ° C, 10 sek 36 X 60 ° C, 45 sek 4 ° C ∞
6. Rening av sekvenseringen proverna
Rena sekvenser USIng Sephadex G-50 superfine.
- Fyll lämpligt antal brunnar i "kolumnen loader" med Sephadex G-50 superfine. Överför Sephadex till filterplattan MAHVN4510 genom att vrida på.
- Lägg 300 pl Milli-Q-H-2 O till varje brunn i filterplattan, och inkubera den i minst 3 timmar vid 2-8 ° C.
- Centrifugera plattorna under 5 minuter vid 910Xg och 4-15 ° C. Kassera genomflödet.
- Tillsätt 10 pl H 2 O till sekvensen produkten och sedan pipettera sekvensen på den svällda Sephadex plattan.
- För att få den renade produkten, centrifugera plattan under 5 min. vid 910Xg och 4-15 ° C och samla genomflödet.
7. Sekvensering de renade proverna på sequencern ABI Prism 3130 XL
- Före varje körning, ändra bufferten och kontrollera volymen av polymeren (POP7). Vid behov, byt ut gamla polymeren kolven med en ny.
- Använd de sparade kör villkor, inklusive en injektion tid på 18 sekunder.
- I denna maskin tar insamling av signaldata för en körning med 16 sekvens prover ungefär 60 minuter (36 cm kapillär) eller 150 minuter (50 cm kapillär).
8. Sekvens redigering
- Använd programmet Lasergene (DNA-stjärna) till anpassa och redigera sekvenserna (Fig. 5). Andra sekvens redigering program kan användas. Använd en "V3-Consensus B" och env konsensussekvensen som referenser.
- Lasergene skapar en konsensus sekvens av analyserade provet med hjälp av alla rådata som finns och lagra den som FASTA fil. FASTA filen är en textfil som innehåller en rubrik med namnet på provet och nukleotidsekvensen.
9. Sekvensering tolkning av data och tropism förutsägelse
- Sekvensering tolkning av data utförs av webbaserade tolksystem geno2pheno [coreceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). För tropism förutsägelse kan olika FPR inställningar väljas. Standardinställningen är enligt den tysk-österrikiska terapi riktlinjer. För FPR ≥ 20%, viruset klassas som R5 när FPR ≥ 20% och X4 för FPR <12,5%.
- Ladda FASTA filen i servern. Denna server översätter nukleotidsekvensen till aminosyror, justerar den med V3-Consensus B-sekvensen och ger en subtyp klassificering. Dessutom genererar den en förutsägelse av coreceptor användning (bild 4) uttryckt som falskt positiva ränta (FPR).
10. Representativa resultat
Den geno2pheno [coreceptor] utgång visar en graderad tolkning av tropism. Beroende på sannolikheten för coreceptor användning varierar tolkningen text och bakgrundsfärg från grön (<20% FPR), vilket tyder på ett säkert administration för MVC, till gult, vilket tyder på en möjlig, låg risk och slutligen till rött. Rött är färgen tyderning inte förskriva MVC. Dessutom genererar servern en pdf rapport som kan skrivas ut, fyllas med patientens och data prov, och skickas till läkaren. Exempel på geno2pheno [coreceptor] utgång visas i figur. 6.
Figur. 1. Schematisk replikation av HIV. Virionen måste binda till de cellulära CD4 som receptor och till antingen CCR5 eller CXCR4 som coreceptor. Den coreceptor CCR5 kan blockeras med CCR5-antagonister som Maravirok (MVC, Celsentri, Selzentry). Efter fusion av de virala och cellulära membran, är den virala nukleokapsiden frigörs i cytoplasman. Nukleokapsiden demonteras och det virala RNA-komplexet frigörs in i cytoplasman. Viralt omvänt transkriptas (RT) transkriberar det genomiska RNA till proviralt DNA, som sedan transporteras till kärnan och integreras i värdgenomet genom HIV-integras. Cellulärt RNA polymeraser TRAnscribe viral genomisk och RNA budbärare från provirala genomet. De virala proteinerna produceras i cytoplasman och transporteras till cellytan. Viruset partiklar knopp som omogna, icke-infektiösa virioner från cellerna. HIV-proteas klyver proteiner som producerar för smittsamma partiklar. Inhibering av en av stegen leder till ett avbrott i replikationscykeln.
De antiretrovirala läkemedel och replikering steg att de hämmar är markerade i rött.
De viralt RNA och proviralt DNA (material som används för tropism eller motstånd analys) är markerade i grönt.
Figur 2. HIV-proviralt genomet. Hiv partikeln är byggd med olika strukturella proteiner och hus olika enzymer och proteiner från både virala och cellulära ursprung. Figuren visars placeringen av gener inom det virala genomet. Ytan proteiner gp120 och gp41 utgör spikar på ytan av virionen och kontakta den humana cellen att utföra membranfusion. I den nedre delen av figuren, är PCR-amplifieringsprodukterna och de primrar som används i vår protokoll visas.
Figur 3. Andel patienter med låg virusmängd (VL) mätningar analyseras för läkemedelsresistens eller tropism beslutsamhet vid Institutet för virologi, Universitetet i Köln (Tyskland).
Figur 4. Övergripande system för experimentet .. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Sekvens redigering med Lasergene. V3 amplikon sekvenseras med åtminstone en framåt och en omvänd primer. Lasergene alignes de ". Abi"-filer som erhållits från sequencer med referensen sekvenser "V3-Consensus B" och env. Lasergene skapar en konsensussekvens använda alla rad uppgifter. De referensbränslen sekvenserna kan märkas (och visas sedan i grått), så att de inte bidrar till provet konsensussekvensen.
Figur 6. Tropism förutsägelse rapporter som genereras av geno2pheno [coreceptor] tool.The rapporter genereras som pdf-filer som kan sparas och fyllas i på datorn. Ytterligare data som vi patientens namn, datum för blod utvinning etc. kan manuellt inkluderas med en PDF Writer-program. Särskilda kommentarer kan också tillsättas. These uppgifter uteslutande på användarens dator och inte på geno2pheno [coreceptor] server. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
V3-sekvensen medger en tillförlitlig virala tropismen förutsägelse, som visas i kliniska studier 3-9. I själva verket är genotypiska beslutsamhet övervägs i de nuvarande europeiska och tysk-österrikiska riktlinjerna 10.
Jämfört med fenotypiska tester, inte bara är omsättningen kortare (ekvivalent med resistensbestämning), utan även är kostnaderna. Dessutom är en stor fördel med genotypiska tester att resultaten klassificeras som FPR och kan därför anpassas till patienternas behov. Trofile resultat, å andra sidan, är helt enkelt R5 eller X4 rapporter och tillgång till rådata anges inte.
För närvarande är de europeiska riktlinjerna föreslår en FPR cut-off 20% 10, medan de österrikisk-tyska riktlinjerna tillåter anpassa FPR cut-off specifikt till varje patients behov 11. I denna linje, för patienter med ett brett utbud av antiretrovirala läkemedel alternativ, högre FPR cut-off (> 20%) är rekommavslutades. Omvänt, för kraftigt förbehandlade patienter med begränsade behandlingsalternativ, lägre FPR cut-off (> 5%) kan användas. Denna typ av terapi vägledning pågår med resistensbestämning till NRTI, NNRTI, PI och Inis, där delvis aktiva läkemedel kan ingå i behandlingen av patienter med nedsatt terapeutiska alternativ. Dessutom, med allt fler genotypiskt-styrda terapi förändringar, kliniskt relevant FPR cut-offs ständigt justeras med en panel av bioinformatiker, virologer och kliniker.
En annan viktig fördel med genotypiska tropism testning är möjligheten att analysera kliniska prover med mycket låg eller till och med odetekterbar virusmängd (VL). I detta fall, när plasma-RNA inte amplifierbara, kan det provirala DNA sekvenseras och användas för tillförlitliga förutsägelser 9,12. Att notera, har antalet patienter med låg eller ej detekterbar virusmängd ökat kraftigt under de senaste åren. Hittills, Trofile analysen tillåter endast analys av prover från patienter med VL <1000 kopior / ml. Emellertid har preliminära studier visat att proviralt DNA kan också adecuate att testas med Trofile 13.
Disclosures
Denna video artikeln är sponsrad av ViiV Healthcare och GlaxoSmithKline.
Acknowledgments
Författarna finansieras från Corus, MedSys cellinmatning, kedja och Resina projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Group | 04 802 993 001 | |
| MagNA Pure Compact System | Roche Group | 03731146001 | |
| T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
| HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
| Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
| ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |
References
- Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).
- Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage. Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).
- McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial. 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).
- Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice. Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).
- Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study. Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).
- Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype. 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).
- Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing. Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).
- Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing). , (2011).
- Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort. Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).
- Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).
