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Biology

जीनोटाइपिंग पीसीआर आधारित विधि के जंगली प्रकार और सजावटी किस्मों के बीच भेद Imperata cylindrica Published: February 20, 2012 doi: 10.3791/3265
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, Huntsville, 2USDA-APHIS-PPQ, Center for Plant Health Science and Technology

Summary

हम एक लागत प्रभावी और तेजी से आणविक जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल है कि विविधता विशेष पीसीआर प्राइमरों को रोजगार कि लक्ष्य डीएनए अनुक्रम chloroplast स्पेसर trnL एफ क्षेत्र के भीतर मतभेद की किस्मों के बीच अंतर करने के लिए प्रदान करते हैं

Protocol

1. नमूना संग्रह और संरक्षण

इस विधि विकसित की है और ताजा जमे हुए, और हाल ही में सूख पत्ता ऊतकों का उपयोग कर परीक्षण किया गया था.

  1. Cogongrass और / या एक वर्गीकरण है कि घास की प्रजातियों की पहचान करने में माहिर की मदद के साथ ऊतकों JBG पहचानें. अपने चमकीले लाल पत्तों के साथ, सजावटी JBG आसान है नेत्रहीन जंगली प्रकार cogongrass और JBG से भेद वापस लौटने के, लेकिन, cogongrass और JBG वापस लौटने के लगभग एक दूसरे से अप्रभेद्य हैं. Cogongrass और JBG लौट phenotype के हरे, अब पत्ते, काफी बड़ा है और अब rhizomes, और अधिक JBG 12 (चित्रा 1) से पत्ता क्षेत्र है.
  2. ताजा पत्ता ऊतक सबसे प्रचुर मात्रा में है और उच्चतम गुणवत्ता डीएनए प्रदान करता है और क्षेत्र या ग्रीनहाउस बड़े हो मैं से एकत्र किया जा सकता है cylindrica पौधों. यदि ताजा ऊतक करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, संग्रह के 3 घंटे के भीतर डीएनए निकालने गिरावट को रोकने में मदद. अन्यथा, भंडारण, keepi के लिए ऊतक तैयारएनजी ऊतक शांत और प्रत्यक्ष सूर्य के प्रकाश से बाहर है.
  3. एक बाद की तारीख में डीएनए निष्कर्षण के लिए ऊतकों की दुकान, सबसे इष्टतम विधि फ्रीज करने और -80 डिग्री सेल्सियस तुरंत ऊतक की दुकान है. जमे हुए ऊतक डीएनए निष्कर्षण से पहले पिघलना करने के लिए अनुमति न दें. डीएनए निष्कर्षण के पीस कदम विगलन को रोकने के लिए पूर्व तरल नाइट्रोजन में जमे हुए ऊतक स्थानांतरण.
  4. यदि एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर उपलब्ध नहीं है, सूखी ऊतक तुरंत. शुष्क भंडारण के लिए, एक कागज के लिफाफे में ऊतक जगह और निर्जलित सिलिका जेल या कमरे के तापमान पर अन्य सक्रिय desiccants में लिफाफा की दुकान सूचक सिलिका की एक छोटी राशि मिश्रित गैर सिलिका का संकेत है यह सुनिश्चित करेंगे कि सिलिका पूरी तरह से निर्जलित और के लिए उपयुक्त है साथ में प्लान्ट टिशू सुखाने.
  5. कम से कम 10 गुना अधिक वजन द्वारा ताजा पत्ती के ऊतकों की तुलना में सिलिका जेल का प्रयोग करें. प्लान्ट टिशू 24 घंटे के भीतर सूखी शुष्क भंडारण के माध्यम से गुणवत्ता और डीएनए की मात्रा समय के साथ कम है (के रूप में वनस्पति संग्रहालय नमूना के मामले में. चाहिएओं).

2. डीएनए निष्कर्षण

एक मामूली संशोधन के साथ निर्माता के निर्देशों प्लान्ट टिशू से डीएनए निकालने, DNeasy संयंत्र मिनी किट (बिल्ली 69,104 या 69,106 क्विएज़न, वालेंसिया, सीए) का पालन करें. प्रत्येक स्तंभ के लिए सुझाव दिया कम से कम 100 मिलीग्राम ताजा ऊतक या कम से कम 20 मिलीग्राम शुष्क ऊतक का उपयोग करने के बजाय, 100 मिलीग्राम से अधिक पीस, और फिर ताजा या फ्रोजन ऊतक से 100 मिलीग्राम (या सूखी ऊतकों से 20 मिलीग्राम) उपयुक्त ट्यूब के लिए स्थानांतरण निकासी के लिए. परमाणु और plastid डीएनए के साथ निकाला जाता है.

  1. इन प्रक्रियाओं को शुरू करने से पहले, कि इथेनॉल AP3 / ई और ऐडवर्ड्स बफ़र्स को सत्यापित करने के लिए जोड़ा गया है.
  2. एक ठीक पाउडर एक ठंडा मोर्टार और मूसल में पीसने के साथ तरल नाइट्रोजन के तीन दौर का उपयोग करने के लिए ताजा या फ्रोजन पत्ता ऊतक (या सूखा पत्ता ऊतक के 20 मिलीग्राम) की 100 मिलीग्राम सामग्री शुरू की अपर्याप्त विघटन या अपर्याप्त lysis भी पीस कर सकते हैं. डीएनए की कम पैदावार के लिए नेतृत्व. ध्यान से Tiss पीसue और स्तंभों बहुत अधिक ऊतक के साथ अधिभार नहीं है.
  3. ताजा या फ्रोजन ऊतक (या शुष्क ऊतक से पाउडर के 20 मिलीग्राम) से 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge AP1 बफर 400 μl और RNase ए 4 μl प्रत्येक ट्यूब पर एक छोटे से रैक में रखा जा सकता है युक्त ट्यूब के लिए 100 मिलीग्राम जमे हुए पाउडर स्थानांतरण ट्यूब प्रति ऊतक का सही वजन पर नजर रखने के संतुलन.
  4. भंवर या शेक नमूना (मिश्रण) और 65 में 10 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस, ऊष्मायन के दौरान 2-3 बार inverting ट्यूब (ओं) को सेते हैं.
  5. प्रत्येक नमूना बफर AP2 के 130 μl जोड़ें. Inverting (ओं) ट्यूब कई बार, और बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं द्वारा मिश्रण.
  6. Pipet एक अलग QIAshredder के मिनी स्पिन स्तंभ में प्रत्येक lysate, और एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब किट के साथ प्रदान की प्रत्येक स्तंभ में जगह. 20,000 XG (~ 14,000 rpm) में 2 मिनट, और किसी भी गठन गोली में बाधा पहुँचा के बिना हर अंश प्रवाह के माध्यम से एक नया ट्यूब (किट के साथ नहीं की आपूर्ति) में हस्तांतरण के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ (ओं).
  7. AP3 / बफर के 1.5 मात्रा जोड़ेंई, pipetting और मिश्रण.
  8. एक DNeasy एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में मिनी स्पिन स्तंभ में मिश्रण की 650 μl स्थानांतरण. 6000 XG (~ 8000 आरपीएम) में 1 मिनट, और प्रवाह के माध्यम से त्यागने के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ (ओं). प्रत्येक नमूना के लिए शेष मिश्रण के साथ इस चरण को दोहराएँ.
  9. स्पिन स्तंभ (ओं) को एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह के ट्यूब (ओं) में रखें, और प्रत्येक स्तंभ के शीर्ष करने के लिए बफर ऐडवर्ड्स के 500 μl जोड़ने. 6000 XG (~ 8000 आरपीएम) में 1 मिनट, और प्रवाह के माध्यम से त्यागने के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ (ओं).
  10. प्रत्येक स्तंभ के शीर्ष करने के लिए बफर ऐडवर्ड्स का एक और 500 μl जोड़ें. 20,000 XG (~ 14,000 rpm) में 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. यह कदम स्तंभ सूखी, इस प्रकार किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल हटाने बफ़र्स में निहित है कि पीसीआर को बाधित कर सकते हैं होगा.
  11. एक नया 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge नमूना ट्यूब स्थानांतरण करने के लिए प्रत्येक स्पिन स्तंभ. क्षालन के लिए प्रत्येक स्तंभ के शीर्ष 100 μl बफर एई जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्तंभ (ओं) को सेते हैं. 6000 XG (~ 8000 आरपीएम) करने के लिए डीएनए लेने पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ (ओं).
  12. दोहराएँ इन क्षालन एक बार कदम है, एक ही 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge के लिए नमूने के 200 μl उपज ट्यूब में डीएनए eluting. स्टोर -20 डिग्री सी का उपयोग करें जब तक डीएनए नमूने डीएनए सांद्रता. ऊतक प्रकार और भंडारण की स्थिति पर निर्भर करते हैं. इष्टतम पैदावार जब बफर एई के 200 μl के एक कुल के साथ डीएनए eluting प्राप्त कर रहे हैं, तथापि, सांद्रता वृद्धि हुई किया जा अगर प्रोद्धावन संस्करणों के रूप में छोटा रूप में 50 μl के लिए कम कर सकते हैं.

3. डीएनए गुणवत्ता और मात्रा का सत्यापन

  1. गुणवत्ता और निकाले डीएनए की मात्रा पीसीआर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या fluorometer और जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर सेटअप करने के लिए पहले टेस्ट. यह बाद के चरणों की सफलता सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी.
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, परीक्षण, डीएनए गुणवत्ता और मात्रा का उपयोग करना. अच्छा डीएनए की पैदावार 50 और 150 के बीच होना चाहिए 2.0 के लिए करीब 260/280 और 230/280 अनुपात के साथ एनजी / μl. एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 2 अच्छी गुणवत्ता वाले परिणामों से पता चलता है NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (ThermoScientific का उपयोग, Wilmington, डे).
  3. वैद्युतकणसंचलन एक मानक 1% agarose जेल का उपयोग आचरण. शाही सेना संदूषण से थोड़ा streaking (चित्रा 3) के लिए नहीं के साथ अपेक्षाकृत बड़े बैंड (> 10 Kb) की उपस्थिति को सत्यापित करें.
  4. यदि डीएनए एकाग्रता उच्च, पतला 70 / एनजी μl बाद के चरणों के लिए डीएनए नमूने है.

4. पीसीआर प्राइमर

इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता पीसीआर प्राइमरों plastid trnL एफ स्पेसर क्षेत्र cogongrass और JBG जीनोटाइप के बीच मतभेद अनुक्रम पर आधारित हैं. इन मतभेदों SNPs के रूप (एकल nucleotide बहुरूपताओं) और InDels (निवेशन और विलोपन) (चित्रा 4) अद्वितीय दृश्यों की साइटों पर प्राइमरों का पता लगाने के द्वारा विविधता विशिष्ट प्राइमरों के विकास की अनुमति दी में आते हैं.

  1. प्राइमरों की गुणवत्ता पीसीआर परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. एक सम्मानित कंपनी से आदेश प्राइमरों. हम तिर्यक जैव, इंक से हमारे प्राइमरों के आदेश (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "लक्ष्य =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), केवल मानक desalting प्रक्रियाओं का अनुरोध.
  2. trnL एफ सकारात्मक नियंत्रण प्राइमरों: इस किताब सेट सबसे घास 11-13 taxa का plastid trnL एफ स्पेसर क्षेत्र amplifies और एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण (एक 890 बीपी बैंड में जिसके परिणामस्वरूप) के रूप में कार्य करता है.
    नाम अनुक्रम
    trnF (GAA) एफ 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3
    trnL (5 'एक्सॉन) सी 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3
  3. जंगली प्रकार cogongrass प्राइमरों: इस किताब सेट cogongrass के लिए विशिष्ट है और जीनोटाइप JBG के क्षेत्र trnL एफ बढ़ाना नहीं करता है. एक बैंड है कि 595 बीपी में सेट परिणाम है.
    नाम Sequence
    trnLF - सी F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3
    trnLF सी-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3
  4. प्राइमरों JBG और JBG वापस करें: इस किताब सेट के जीनोटाइप JBG के लिए विशिष्ट है और के क्षेत्र cogongrass trnL एफ बढ़ाना नहीं करता है. एक बैंड है कि 594 बीपी में सेट परिणाम है.
    नाम अनुक्रम
    trnLF - आर F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3
    trnLF आर - R2 के 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3
  5. Nuclease मुक्त DDH 2 हे की पर्याप्त मात्रा में प्रत्येक प्राइमर Resuspend के लिए एक 100 मिमी स्टॉक समाधान है कि -20 डिग्री सेल्सियस, लंबे समय में संग्रहीत किया जा सकता प्राप्त.
  6. 12 मिमी पीसीआर सेटअप कदम से पहले करने के लिए प्रत्येक प्राइमर स्टॉक के पतला.

5. पीसीआर सेटअप

डीएनए एक्सट्रेक्शन पीसीआर प्रतिक्रियाओं में ऊपर प्राइमर सेट के प्रत्येक का उपयोग प्रवर्धित. एक सकारात्मक नियंत्रण करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी पीसीआर अभिकर्मकों अच्छी तरह से काम कर रहे हैं और एक बैंड उत्पन्न कर सकते हैं शामिल हैं. अभिकर्मकों की है कि कोई भी अवांछित डीएनए के साथ दूषित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल नकारात्मक नियंत्रण कोई टेम्पलेट होता है और कोई बैंड उत्पादन में परिणाम चाहिए.

  1. पतली दीवारों पीसीआर नलियों में सभी प्रतिक्रियाओं को तैयार करने के लिए thermocycler ब्लॉक और नमूना के बीच बेहतर गर्मी हस्तांतरण की अनुमति व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एयरोसोल मुक्त विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करने के लिए मदद संक्रमण से बचने की सलाह देते हैं.
  2. प्रत्येक पृथक डीएनए नमूने के लिए, 50 μl पीसीआर 0.2 मिलीलीटर पतली दीवारों पीसीआर नलियों में नीचे सूचीबद्ध क्रम में बर्फ पर निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़कर प्रत्येक सेट के ऊपर प्राइमर का उपयोग प्रतिक्रियाओं सेट. यदि कई नमूने तैयार किया जा रहा है, अपवाद के साथ सभी अभिकर्मकों युक्त कॉकटेलडीएनए टेम्पलेट की सभी प्रतिक्रियाओं के बीच एक समान शर्तों को स्थापित करने के लिए.
    पीसीआर अभिकर्मक खेतों में प्रयुक्त किए गए वॉल्यूम अंतिम Concetration
    Nuclease मुक्त DDH 2 हे 40.5 μl
    10X के लाभ 2 पीसीआर बफर (Clonetech, सीए) 5.0 μl 10% (v / v)
    लाभ ultrapure पीसीआर dNTP मिक्स (प्रत्येक 10 मिमी, Clonetech, सीए) 1.0 μl 0.2 मिमी
    1 प्राइमर (12μM DDH 2 हे में) 1.0 μl 0.24 माइक्रोन
    2 प्राइमर (12μM DDH 2 हे में) 1.0 μl 0.24 माइक्रोन
    लाभ 2 पोलीमरेज़ मिक्स (Clonetech, सीए) 0.5 μl 1% (v / v)
    डीएनए निष्कर्षण(70 एनजी / प्रतिक्रिया, DDH 2 हे मात्रा को समायोजित करने के रूप में की जरूरत है) 1.0 μl 1.4 एनजी / μl
    कुल: 50.0 μl
  3. यह सुनिश्चित करने कि सभी पीसीआर अभिकर्मकों अच्छी तरह से काम कर रहे हैं, सकारात्मक सकारात्मक नियंत्रण प्राइमरों का उपयोग करते हुए नियंत्रण सेटअप इस किताब सेट cogongrass, JBG के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है, वापस लौटने और अन्य घास JBG और एक बैंड है कि 890 बीपी में परिणाम देगा.
  4. नकारात्मक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही नियंत्रण सेट प्राइमर का उपयोग कर, DDH 2 हे डीएनए निष्कर्षण के बजाय का उपयोग करते हुए नियंत्रण सेटअप यदि सभी अभिकर्मकों डीएनए contaminates के लिए स्वतंत्र हैं, इस प्रतिक्रिया नहीं बैंड में परिणाम होगा.
  5. यदि डीएनए एकाग्रता कम है, अधिक डीएनए प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जा सकता है, समायोजन Nuclease मुफ्त DDH 2 हे की राशि के लिए कुल 50 μl प्रतिक्रिया की मात्रा लाने के लिए किया डीएनए की अधिक से अधिक 5 μl (10% का उपयोग नहीं है. कुल मात्रा) आर प्रतिeaction, के रूप में संभव डीएनए नमूनों में निहित दोष पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं.

6. पीसीआर साइकल चलाना

  1. बाहर एक निम्नलिखित पीसीआर साइकिल चालन के मापदंडों का उपयोग कर एक गर्म ढक्कन के साथ सुसज्जित thermocycler में पीसीआर amplifications ले. हम Mastercycle समर्थक एस thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) के लिए मानक तापमान ramping शर्तों के साथ संचालित करने के लिए सेट का उपयोग करें. कोई गुणवत्ता thermocycler के अच्छा प्रदर्शन करना चाहिए.
    चक्र एनीलिंग विकृतीकरण Polymerization
    1 2 मिनट में 95 डिग्री सेल्सियस
    2 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड 30 सेकंड 61 डिग्री सेल्सियस 90 सेकंड 68 डिग्री सेल्सियस 35 साइकिल
    3 68 से कम 5 मिनट डिग्री सेल्सियस
    4 में पकड़ डिग्री सेल्सियस तक नमूना निकाल दिया जाता है
  2. पीसीआर (प्राइमर annealing के तापमान, विस्तार बार, और चक्रों की संख्या सहित) के लिए के रूप में डीएनए की गुणवत्ता पर निर्भर करता है की जरूरत है स्थिति अनुकूलन, प्राइमरों, Taq या thermocycler की पोलीमरेज़ प्रकार का इस्तेमाल किया. हम एक ढाल सक्षम thermocycler के का उपयोग कर जब इष्टतम का निर्धारण करने की सिफारिश तापमान annealing है.
  3. यदि इस्तेमाल किया जा रहा thermocycler एक गर्म ढक्कन नहीं है, प्रत्येक नमूना के शीर्ष करने के लिए खनिज तेल की 1 ड्रॉप जोड़ने पीसीआर साइकिल चालन के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए.

7. पीसीआर उत्पाद की जेल वैद्युतकणसंचलन

विश्लेषण के परिणाम की कल्पना, एक 1% agarose मानक वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर जेल पर अलग पीसीआर उत्पादों.

  1. प्रत्येक प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद के 5 μl के साथ एक मानक डीएनए लोड हो रहा है बफर के 2 μl (आमतौर पर एक 5x या 6x समाधान) का मिश्रण है.
  2. एक 1% agarose जेल EtBr (डीएनए धुंधला के लिए ethidium ब्रोमाइड) युक्त ई के साथ बनाया पर लोड नमूनेither TAE या एस.बी. (सोडियम borate) बफर 16 प्रणालियों. हम प्रति 100 मिलीलीटर 1% agarose (0.1 / μg मिलीग्राम) 10 मिलीग्राम / एमएल EtBr स्टॉक समाधान के 1 μl का उपयोग करें.
  3. ~ 120V पर नमूने चलाएँ जब तक डाई सामने पहुँचता ¾ जेल की कुल लंबाई की.
  4. पराबैंगनी प्रकाश के तहत एक छोटी लहर यूवी प्रकाश बॉक्स जैसे, जिसके परिणामस्वरूप बैंड का निरीक्षण करने के लिए देखने के लिए अगर एक उचित टुकड़ा परिलक्षित किया गया था.
  5. जेल और जिसके परिणामस्वरूप बैंड उपलब्ध फोटो प्रलेखन प्रणाली या कैमरे का उपयोग कर दस्तावेज़.

8. प्रतिनिधि परिणाम

पीसीआर उत्पादों के दृश्य पर, cogongrass एक अद्वितीय बैंडिंग JBG या लौट JBG (चित्रा 5) की तुलना में पैटर्न है. प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए, trnL - एफ सकारात्मक नियंत्रण प्राइमर सेट ~ 890 बीपी पर एक उच्च तीव्रता बैंड में परिणाम चाहिए. यह पुष्टि करता है कि सभी पीसीआर अभिकर्मकों अच्छी तरह से काम कर रहे हैं. इसी तरह, नकारात्मक (कोई टेम्पलेट) नियंत्रण प्रतिक्रिया किसी भी भजन की पुस्तक के लिए कोई बैंड शामिल करना चाहिएएट इस्तेमाल किया. यह पुष्टि अभिकर्मकों की कोई भी दूषित गया है.

यदि डीएनए नमूने जंगली प्रकार cogongrass, उपयोग प्राइमर cogongrass विशिष्ट सेट ~ 595 बीपी पर एक बैंड में परिणाम जबकि JBG विशिष्ट प्राइमरों कोई बैंड में परिणाम होगा एक पीसीआर प्रतिक्रिया से ली गई है. इसी तरह, अगर डीएनए नमूने JBG से ली गई है या JBG लौट, एक पीसीआर प्राइमर JBG विशिष्ट सेट का उपयोग कर प्रतिक्रिया ~ पर 594 बीपी एकल बैंड में परिणाम जबकि cogongrass विशिष्ट प्राइमरों नहीं बैंड में परिणाम होगा. क्योंकि JBG और लौट JBG समान न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम है, वे इसलिए समान बैंडिंग पैटर्न का होगा. यदि कई नमूने एक जेल पर एक ही समय में तुलना कर रहे हैं, हम प्रत्येक प्राइमर एक दूसरे के बगल में सेट से प्राप्त नमूनों चलाने की सलाह देते हैं, इस प्रकार यह आसान करने के लिए सकारात्मक परिणाम के लिए नमूने स्कैन करने के लिए बना.

JBG और JBG बदल जाती है के बीच morphological अंतर काफी स्पष्ट हैं (उदाहरण के लिए पत्तियों और जेबी के छोटे कद के लाल रंग जी बनाम हरी रंगाई, बड़ा कद और JBG की आक्रामक वृद्धि वापस लौटने), जबकि पीसीआर परिणाम वही होगा, JBG किस्मों संयंत्र आकारिकी का उपयोग भेद करने के लिए आसान कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 ग्रीनहाउस की तुलना Imperata cylindrica var koenigii. (जापानी रक्त घास के) बड़े हो, मैं वापसी cylindrica var JBG वापस करें. koenigii और मैं cylindrica (cogongrass जंगली - प्रकार).

चित्रा 2
चित्रा 2. डीएनए एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करते हुए सत्यापित नमूने का एक उदाहरण है. ध्यान दें कि, चाहे इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, 260/280 अनुपात 1.8 के लिए बंद हो सकता है और अनुपात 260/230 2.0 के लिए बंद हो जाना चाहिए चाहिए.

"ontent> चित्रा 3
चित्रा 3 डीएनए नमूने एक 1% agarose जेल पर मानक जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर सत्यापित कर रहे हैं. एक वाणिज्यिक डीएनए मार्कर के आकार के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था. # 4 लेन गरीब गुणवत्ता डीएनए नमूने का एक उदाहरण है, smearing और कुछ शाही सेना संदूषण दिखा.

चित्रा 4
चित्रा 4. Imperata cylindrica var (जापानी रक्त घास के). Koenigii, trnL एफ क्षेत्रों के अनुक्रम संरेखण लौट आई. cylindrica var JBG वापस करें. koenigii और मैं cylindrica (cogongrass जंगली - प्रकार). कार्यक्षेत्र काला तीर SNPs और InDels से उत्पन्न दृश्यों में मतभेद संकेत मिलता है. क्षैतिज हरी तीर जंगली प्रकार cogongrass पीसीआर cogongrass - विशिष्ट के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों की स्थिति से संकेत मिलता है. क्षैतिज लाल तीर से संकेत मिलता है पुलिसJBG और JBG की sitions JBG विशेष पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों में वापस लौटे.

चित्रा 5
चित्रा 5 पीसीआर cogongrass से व्युत्पन्न उत्पादों की जेल वैद्युतकणसंचलन, JBG और JBG वापस लौटने के डीएनए नमूने cogongrass और JBG विशिष्ट प्राइमरों के साथ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से trnL एफ सकारात्मक नियंत्रण और एक नहीं टेम्पलेट नकारात्मक नियंत्रण संयुक्त के प्रतिनिधि परिणाम.

Discussion

अमेरिकी नर्सरी और परिदृश्य उद्योगों की खेती और बिक्री विदेशी और उपन्यास संयंत्र प्रजातियों पर पनपे. यह व्यापार के बढ़ते वैश्वीकरण के साथ मिलकर, संभावना है कि एक आक्रामक प्रजातियों के पौधे में प्रवेश स्थापित होगा, और अमेरिका में फैल करने के लिए संघ जानकारी पर निर्भर करता है कि अक्सर उपलब्ध नहीं है आक्रामक बनने की क्षमता सहित, इस तरह के पौधों को विनियमित करने की क्षमता बढ़ जाती है सही वर्गीकरण, और देशी और देशीयकृत taxa से आनुवंशिक शुद्धता क्योंकि इनवेसिव पौधों के हमारे ज्ञान अक्सर सीमित है, छुपा आक्रामक विशेषताओं के साथ आयातित संयंत्रों को स्वेच्छा से किया गया है केवल बाद में जानने के लिए कि वे हमारे कृषि और प्राकृतिक संसाधनों पर आक्रमण करने के लिए शुरू की है. इस प्रोटोकॉल जैसे कि मैं के साथ जुड़े समस्याओं का समाधान करना पहले सरलीकृत आणविक विधि है कि सही प्रकार के जंगली cogongrass और अपने सजावटी JBG समकक्ष लौट फार्म के बीच भेद कर सकते हैं प्रदान करके cylindrica किस्मों.

इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए jove_content ">, जंगली प्रकार cogongrass सांता रोजा के निकट जे, FL काउंटी में 2008 के जून में तालाब क्रीक वानिकी इकाई में देशीयकृत आबादी से एकत्र किया गया था JBG एक वाणिज्यिक नर्सरी (Bluebird नर्सरी, इंक से प्राप्त किया गया था. .) के रूप में अच्छी तरह के रूप में जून 2008 में कोलंबिया में एक homeowner के संग्रह से, एमओ JBG जून 2008 में Clemson विश्वविद्यालय, अनुसूचित जाति पर कैम्पबेल भूवैज्ञानिक संग्रहालय के आंगन से प्राप्त किया गया बदल जाती है, जून 2009 में Riverdale, एमए में विश्वविद्यालय पार्क से, और कोलंबिया, एमओ 2009 में (लेलैंड Cseke द्वारा की पहचान) में एक homeowner के सामने यार्ड से सभी पौधों. Huntsville में अलबामा के विश्वविद्यालय (Huntsville, AL) पर स्थित ग्रीन हाउस में बनाए रखा गया.

इन पौधों से एकत्र डीएनए की जेनेटिक अनुक्रमण 9 स्वतंत्र डीएनए सामान्यतः बारकोड 2 पौधों के लिए प्रयोग किया जाता क्षेत्रों की गहराई की तुलना में शामिल हैं. सभी मामलों में, JBG के दृश्यों JBG वापस लौटने के उन लोगों के लिए एक 100% मैच थे, इस प्रकार की मदद करने के लिएसत्यापित करें कि JBG वास्तव में एक हरे रंग की, आक्रामक फार्म वापस करता है. केवल परमाणु इसके chloroplast और trnL एफ क्षेत्रों मतभेद है कि आनुवंशिक रूप से cogongrass और JBG के बीच भेद किया जा सकता है. इसके क्षेत्र के 3 cogongrass और JBG के बीच SNPs के (एकल nucleotide बहुरूपताओं) के एक कुल की है, जबकि क्षेत्र trnL एफ 2 SNPs और 2 InDels (सम्मिलन और हटाना). इन आनुवंशिक मतभेद विविधता विशेष पीसीआर प्राइमरों की अनुमति दी है कि जंगली प्रकार cogongrass और JBG बदल जाती है के बीच भेद कर सकते हैं विकसित किया जा. सबसे विश्वसनीय परिणाम plastid trnL एफ क्षेत्र से व्युत्पन्न प्राइमरों से आ गए. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल की cogongrass, JBG chloroplast जीनोम के trnL एफ क्षेत्रों और JBG (चित्रा 4) लौट के बीच मतभेद अनुक्रम पर आधारित है.

प्राइमरों है कि अधिक प्रश्न में किस्मों के लिए विशिष्ट हैं उत्पन्न करने में मदद करने के लिए और मदद के लिए निकट से संबंधित प्रजातियों, अल से झूठी सकारात्मक से बचने केमैं जाना जाता है, मैं के trnL एफ दृश्यों cylindrica किस्मों संबंधित घास की प्रजातियों (29 प्रजातियों में से 43 स्वतंत्र दृश्यों, जैसे, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, lacryma jobi Coix, miscanthus sinensis, इक्षु, चारा halepense) से trnL एफ दृश्यों के साथ तुलना की गई. हालांकि, हम घास, विविधता विशिष्ट प्राइमरों की विशिष्टता की 29 प्रजातियों भर में विविधता विशिष्ट प्राइमर दृश्यों की जांच की व्यापक नहीं किया गया है सबसे अन्य घास की प्रजातियों से डीएनए बढ़ाना करने की क्षमता के लिए जांच की. नतीजतन, डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया ऊतक ध्यान से मैं के रूप में पहचान किया जाना चाहिए cylindrica इस प्रोटोकॉल से पहले शुरू करने के लिए. यदि घास या तो cogongrass या JBG रूप पहचान नहीं कर सकते हैं तो हम सुझाव है कि पीसीआर उत्पाद अनुक्रमण करने के लिए यकीन है कि के दृश्यों cogongrass या JBG के लिए एक सटीक मैच. वर्तमान में, सबसे सटीक पद्धति दिया घास नमूना की पहचान को सत्यापित करने के लिए दोनों टी पर पीसीआर प्रदर्शनRNL एफ और इसके क्षेत्रों, पीसीआर उत्पादों के अनुक्रम सत्यापन और सही पहचान taxa से जाना जाता है दृश्यों के दृश्यों की तुलना द्वारा पीछा किया. डीएनए नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में विस्तृत प्राइमरों (क्षेत्र trnL - एफ के लिए) या ​​अन्य कि 13-15 अन्य प्रकाशनों में उपलब्ध प्राइमरों का उपयोग परिलक्षित किया जा सकता है. अनुक्रमण बहुत अधिक श्रम और हमारे सरलीकृत प्रक्रिया का उपयोग कर से गहन कीमत है.

पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों की गुणवत्ता प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. हम इस प्रक्रिया से उपलब्ध तिर्यक जैव इंक (के लिए प्राइमरों बना दिया है http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). तिर्यक जैव से प्राइमरों आदेश करने के लिए लाभ है कि वे, प्राइमरों हम अनुकूलन के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता के रूप में समान नमूना उत्पादन श्रृंखला से प्रत्येक किताब की aliquots की बड़ी संख्या की दुकान. नतीजतन, प्राइमरों उसी क्रम ही नहीं है, लेकिन टीहे सटीक एक ही उत्पादन बहुत है कि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था से आ. एक ही बहुत से प्राइमरों का उपयोग करने में मदद कर सकते हैं प्रक्रिया में बाहरी चर है कि पीसीआर प्राइमरों की गुणवत्ता में अंतर से हो सकता है से बचने के. इसी तरह, जबकि अन्य Taq पीसीआर पीसीआर, Taq पोलीमरेज़ का इस्तेमाल किया गुणवत्ता के लिए ठीक काम करना चाहिए पीसीआर परिणाम की गुणवत्ता पर असर पड़ेगा. पीसीआर अभिकर्मकों में बेहतर स्थिरता के लिए अनुमति देने के लिए, हम Clontech से प्रोटोकॉल का उपयोग कर अभिकर्मकों अनुकूलित है. लाभ 2 पोलीमरेज़ (Clontech, माउंटेन व्यू, सीए, 639,201 # ६३९२०२ या बिल्ली) एक मजबूत, गर्म शुरू Taq पोलीमरेज़ का एक मिश्रण है और पढ़ने एक एंजाइम सबूत है कि उच्च विशिष्टता और अधिक सटीक amplifications प्रदान में मदद करता है.

क्योंकि यह प्रोटोकॉल chloroplast डीएनए है, जो माता के रूप में घास में विरासत में मिला है पर निर्भर करता है, cogongrass और JBG जीनोटाइप के बीच संकरण की घटनाओं हमारे आणविक पहचान प्रक्रिया के साथ कब्जा नहीं कर सकता है. मामलों में जहां hypridization suspe हैcted, हम परमाणु क्षेत्रों है कि दोनों के माता पिता से विरासत में मिला रहे हैं का उपयोग करने की सलाह देते हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया गैर plastid चर लिए संयंत्र जीनोटाइपिंग में विचार क्षेत्र परमाणु ribosomal इसके 13-15,17 क्षेत्र है. वर्तमान में, हम कि परमाणु वही पीसीआर ट्यूब में इसके क्षेत्र के साथ chloroplast क्षेत्र एफ trnL के प्रवर्धन बहुसंकेतन की दिशा में प्रगति कर रहे हैं. परमाणु डीएनए क्षेत्रों के साथ plastid बहुसंकेतन संभवतः या तो अकेले का उपयोग की सीमाओं को दरकिनार होगा, लेकिन, इस तरह के तरीकों अनुकूलन और अतिरिक्त मूल्यांकन की आवश्यकता है के लिए मामले के आधार द्वारा एक मामले पर व्यवहार्यता का निर्धारण. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) और आणविक बीकन, (फ्लोरोसेंट प्राइमर जांच) के रूप में नई प्रौद्योगिकियों, का उपयोग भी कर रहे हैं असफल सुरक्षित और सही संयंत्र जीनोटाइपिंग तरीके के रूप में मूल्यांकन किया जा रहा है.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय भेद JBG जंगली प्रकार cogongrass के उस से वापस लौटने के लिए दृष्टिकोण प्रदान करता है. हम प्रोत्साहित करते हैं का उपयोग करेंइस प्रोटोकॉल की रु हमसे संपर्क करने के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग से प्राप्त परिणामों की रिपोर्ट. इस तरह के साझा जानकारी में मदद मिलेगी JBG बदल जाती है के वितरण पर जानकारी प्रदान करते हैं. यह भी मदद के USDA में नियामकों कार्यों है कि प्रसार और अत्यधिक आक्रामक cogongrass किस्मों के संभावित संकरण को दरकिनार करने की जरूरत है किया जा सकता है पर सूचित निर्णय करना होगा.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम नमूनों को प्राप्त करने में सहायता के लिए एलन tasker (USDA APHIS, Riverdale, एमडी), स्टीफन कॉम्पटन (Clemson), शेरी Aultman Clemson (), क्रेग रैमसे (USDA APHIS, किले कोलिन्स, CO), और बेटी Marose (UMD) है धन्यवाद . हम वीडियो की शूटिंग में अपने काम के लिए के एंड्रयू एड्रियन (UA Huntsville) और डेरेक ठेकर (UA Huntsville) इस प्रोटोकॉल परीक्षण में उनकी सहायता के लिए, और यूसुफ Herdy के छात्रों को धन्यवाद देता हूं. यह काम राष्ट्रीय मछली और वन्य जीव फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104 or 69106 Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures.
trnF(GAA)-F Oblique Bio, Inc. 3-0578 Forward positive control primer
trnL(5’ exon)-C Oblique Bio, Inc. 3-0579 Reverse positive control primer
trnLF-C-F1 Oblique Bio, Inc. 3-0864 Forward wild-type cogongrass primer
trnLF-C-R1 Oblique Bio, Inc. 3-0865 Reverse wild-type cogongrass primer
trnLF-R-F2 Oblique Bio, Inc. 3-0866 Forward JBG and JBG revert primer
trnLF-R-R2 Oblique Bio, Inc. 3-0867 Reverse JBG and JBG revert primer
Advantage UltraPure PCR dNTP Mix Clontech Laboratories 639125
Advantage 2 Polymerase Clontech Laboratories 639201 or 639202 A good proof-reading, hot-start Taq polymerase

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References

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Cseke, L. J., Talley, S. M. A… More

Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica. J. Vis. Exp. (60), e3265, doi:10.3791/3265 (2012).

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