Summary
우리는 엽록체 trnL-F 스페이서 지역 내의 대상의 DNA 서열 차이의 종류를 구분하는 것이 다양한 특정 PCR primers의 직원을 고용하고 비용 효과적이고 신속한 분자 genotyping 프로토콜을 제공
Abstract
야생 형 저 cylindrica (cogongrass)는 부정적인 아프리카, 아시아, 유럽, 뉴질랜드, 오세아니아 및 미주 1-2에 걸쳐 73 개국에서 농업과 천연 자원에 영향을 미치는, 세계 10 대 최악의 침입 식물 중 하나입니다. Cogongrass는 토착 식물 종의 큰 다양성을 치환하고 차례로 마초와 쉼터를위한 전이 원시 식물 수종에 따라 야생 동물을 위협 빠르게 - 확산, monodominant 스탠드를 형성합니다. 문제를 추가하려면, 관상용 다양한 [나 cylindrica VAR. koenigii (Retzius가)] 널리 Imperata cylindrica 'Rubra', 레드 바론, 일본 혈액 풀 (JBG)의 이름하에 판매됩니다. 이것은 다양한 putatively 살균 및 비침 투이며 붉은 단풍을위한 바람직한 관상용으로 간주됩니다. 그러나, 정확한 조건 하에서, JBG가 가능한 종자를 생산할 수있다 (캐롤 Holko 2009 개인 통신)와 나는 녹색으로 되돌릴 수 있습니다그것이 야생 형 침략 다양한 4 (그림 1)의 구분되는 특징에 걸릴 cogongrass에서 종종 구별할 수있다 nvasive 형식입니다. 이것은 신분도 잘받은 식물 taxonomists 위해 형태학 어려운 작업을 사용하여 만듭니다. 공격적인 녹색 표현형에 JBG의 복귀도 드문 아닙니다. 코딩 및 원자력과 엽록체 둘 다 DNA의 변수 영역의 시퀀스 비교를 사용하여, 우리는 JBG는 메릴랜드, 사우스 캐롤라이나, 그리고 미주리 주에서 내에 녹색 침략으로 되돌 것으로 확인되었습니다. 활성 cogongrass의 침입이 아닌 곳에 JBG는 대륙 미국에서 거의 모든 국가에서 판매하고 심은되었습니다. 잘 이해되지에서는 되돌릴 문제의 범위는 되돌 식물 문서화하고 종종 파괴 때문이다.
이 분자 프로토콜의 응용 JBG가갑니다 식별할 수있는 방법을 제공하고 공동 발생이 품종을 유지하는 데 도움ND 가능성이 hybridizing. Cogongrass가 다른 유전자형으로 건널 때 고맙게 여기게 outcrosser이며, - 바람의 분산 가능한 생산 5-7 넓은 거리를 통해 cogongrass 뿌리 씨앗을하실 수 있습니다. JBG는 cogongrass보다 약간 다른 유전자형을 가지고 있으며, cogongrass으로 가능한 하이브리드를 구성할 수 있습니다. 문제를 추가하려면, JBG는 cogongrass 8-10보다 추위와 관용 그늘이고,이 두 품종 간의 유전자 흐름은 더 공격적이다 하이브리드를 생성할 가능성이 야생 형 cogongrass보다 성의 관용, 그리고 차가운 그늘. 야생 형 cogongrass 현재 동남 미국에서 전세계 100 만 490여 헥타르, 감염 시켰어 있지만 그것은 500,000헥타르 통해 감염 시켰어하고 빠르게 북쪽의 광범위한 틈새 시장 및 지리적 잠재 3,7,11에 의한 확산으로 미국의 대부분을 차지하는이 가능합니다. 유전자 건널목의 잠재력은 USDA-진딧물 연방 유해 주 프로그램에 대한 심각한 우려입니다. 현재 USDA-진딧물은 주와 무에서 JBG 금지오히려 주요 cogongrass의 infestations (예, 플로리다, 알라바마, 미시시피)가 있습니다. cogongrass와 JBG 자신의 배포판을 확장할 그러나 결합에서 두 품종을 방지하는 것은 더 어려울 수 있습니다. 또한, JBG 되돌릴 수의 배포는 현재 알려지지 조직 형태를 통해 이러한 품종을 식별하는 능력없이 일부 cogongrass의 infestations은 JBG는 되돌려의 결과가 될 수도 있습니다. 불행히도, 신분의 현재 분자 방법은 일반적으로 소모 및 비용 시간은 둘 다 AFLP (증폭 단편 길이 Polymorphisms)와 DNA 시퀀싱에 의존하고 있습니다. 여기서는 정확 cogongrass와 JBG 되돌릴 구별하는 최초의 비용 절감 효과 및 안정적인 PCR 기반의 분자 genotyping 방법을 제시한다.
Protocol
1. 표본 수집 및 보존
이 방법은 개발 신선, 냉동, 그리고 최근 건조 잎 조직을 사용하여 테스트되었습니다.
- cogongrass 및 / 또는 잔디 수종 식별 전문 taxonomist의 도움으로 조직을 JBG를 식별합니다. 그 밝은 붉은 나뭇잎으로 장식 JBG는 시각 되돌릴 야생 형 cogongrass와 JBG에서 구별 하기란 쉽지 않지만, cogongrass와 JBG 되돌리려 하나를 거의 구별할 수 있습니다. Cogongrass와 JBG 되돌 표현형은 녹색, 긴 잎, 상당히 크고 긴 rhizomes와 JBG 12 (그림 1) 이상의 잎 면적 있습니다.
- 신선한 잎 조직은 가장 풍부하고 최고 품질의 DNA를 제공하며, 필드 또는 온실 재배 전에서 수집한하실 수 있습니다 cylindrica 공장. 신선한 조직이 사용되는 경우, 저하를 방지하기 위해 수집 3 시간 이내에 DNA를 추출합니다. 그렇지 않으면, 스토리지, keepi위한 조직을 준비직사 광선의 NG 조직 시원한 밖에.
- 나중에 DNA 추출을위한 조직을 저장하기 위해 가장 최적의 방법은 ° C에서 즉시 -80에서 조직을 동결하고 저장하는 것입니다. 냉동 조직 DNA를 추출 이전 해동하도록 허용하지 마십시오. 해동 막기 위해 DNA를 추출의 분쇄 단계 이전의 액체 질소에 냉동 조직을 전송합니다.
- -80 ° C의 냉동고를 사용할 수없는 경우, 건조한 조직은 즉시. 건조 저장 들어, 종이 봉투에 조직을 배치하고 건조 실리카 젤 또는 실온에서 다른 활성 desiccants에서 봉투를 저장합니다. 혼합 지표 실리카의 작은 금액으로되지 않은 나타내는 실리카는 그 실리카가에 대해 전적으로 탈수 및 적합 확인을 할 것입 함께 식물 조직을 건조.
- 최소 10 배 무게에 의한 신선한 잎 조직보다 더 많은 실리카 젤을 사용합니다. 공장 조직은 24 시간 이내에 건조한다. DNA의 품질과 수량 (식물 표본집 검체의 경우와 마찬가지로 시간이 지남에 따라 건식 저장을 통해 감소들).
2. DNA 추출
포르노 수정으로 제조 업체의 지침, 식물 조직에서 DNA를 추출하려면 DNeasy 공장 미니 키트 (고양이 # 69104 또는 69106 Qiagen, 발렌시아, CA)를 따릅니다. 대신 각 항목에 대해 제안된 미만 100 밀리그램 신선한 조직 또는 20 밀리그램 마른 티슈를 사용하는 적절한 튜브로 (마른 티슈 또는> 20 밀리그램) 신선 또는 냉동 조직에서 100 밀리그램을 전송 후 큰 100여 MG를 갈기, 그리고 추출을위한. 원자력 및 plastid DNA가 동시에 추출됩니다.
- 이 절차를 시작하기 전에, 그 에탄올을 확인하는 것은 버퍼 AP3 / E와 AW 추가되었습니다.
- 냉장 박격포와 유봉으로 분쇄와 액체 질소의 3 라운드를 사용하여 미세 분말로 신선 또는 냉동 잎 조직 (또는 건조 잎 조직> 20 밀리그램) 중> 100 밀리그램을 갈아서. 시작하는 재료의 부족 중단이나 부족 용해 또한 DNA의 낮은 수율로 이어집니다. 조심스럽게 tiss을 갈다월엔 너무 많은 조직과 열 과부하하지 않습니다.
- 버퍼 AP1 400 μl와 각 튜브에 작은 선반에 배치할 수 RNase A. 4 μl를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 신선 또는 냉동 조직 (또는 건조한 조직에서 분말 20 밀리그램)에서 100 밀리그램 냉동 분말을 전송 튜브 당 조직의 정확한 무게를 감시하는 균형.
- 와동 또는 셰이크 샘플 (들) 혼합 65에서 10 분 동안 부화 ° C, 2-3 회 인큐베이션 기간 동안 반전 튜브 (들).에게
- 각 샘플로 버퍼 AP2 130 μl를 추가합니다. 반전 튜브 (들)를 여러 번, 그리고 얼음에서 5 분 부화하여 섞는다.
- Pipet은 각 별도의 QIAshredder의 미니 스핀 컬럼으로 lysate와 2 ML 컬렉션 튜브 (키트와 함께 제공)에서 각 열에 배치합니다. 이 20,000 XG (~ 14,000 RPM)의 분, 각각의 새로운 튜브 (키트와 함께 제공되지 않음)로 분획 흐름 통해 형성 펠렛을 방해하지 않고 전송을위한 원심 분리기 칼럼 (들).
- / 버퍼 AP3의 1.5 볼륨을 추가E, 그리고 pipetting하여 혼합.
- 2 ML 수집 튜브 DNeasy 미니 스핀 열에 혼합물보다 650 μl를 전송합니다. 한 6,000 XG (~ 8,000 RPM)에서 분, 그리고 흐름을 통해를 폐기를위한 원심 분리기 칼럼 (들). 각 샘플에 대한 나머지 혼합물이 단계를 반복합니다.
- 새로운 두 ML 수집 튜브 (들)에 스핀 컬럼 (들)을 놓고, 각 열의 맨 위에 버퍼 AW 500 μl를 추가합니다. 한 6,000 XG (~ 8,000 RPM)에서 분, 그리고 흐름을 통해 폐기를위한 원심 분리기 칼럼 (들).
- 각 열의 맨 위에 버퍼 AW의 또 다른 500 μl를 추가합니다. 20,000 XG (~ 14,000 RPM)에서 2 분 동안 원심 분리기. 이 단계는 따라서 PCR을 억제 수있는 버퍼에 포함된 잔류 에탄올을 제거 컬럼을 건조합니다.
- 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 샘플 튜브에 각 스핀 컬럼을 전송합니다. 용리 각 칼럼의 상단에 100 μl 버퍼 AE를 추가하고, 실온에서 5 분 동안 열 (들)을 품어. DNA를 수집하기 위해 6,000 XG (~ 8,000 RPM)에서 1 분을위한 원심 분리기 칼럼 (들).
- 이러한 용출 샘플 200 μl를 얻을 수있는 동일한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 DNA를 eluting, 한 번 단계를 반복합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 저장 DNA 샘플. DNA의 농도는 조직 유형 및 저장 조건에 따라 다릅니다. 버퍼 AE 200 μl의 총 DNA를 eluting 때 최적의 수율을 얻을되지만 농도가 용출 볼륨이 최소 50 μl로 감소하는 경우 증가 수 있습니다.
3. DNA의 품질 및 수량의 검증
- 분광 광도계 또는 fluorometer 및 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 설치 이전 추출한 DNA의 품질과 수량을 테스트합니다. 이것은 후속 단계의 성공을 위해 필요합니다.
- 분광 광도계, 테스트 DNA의 품질과 수량을 사용합니다. 좋은 DNA의 수율은 50과 150 사이 여야합니다 2.0에 가까운 280분의 260 및 280분의 230 비율로 μl / NG. 예를 들어, 그림 2 NanoDrop 분광 광도계 (ThermoScientific를 사용하여 양질의 결과를 보여줍니다 윌밍턴, DE).
- 표준 1퍼센트 아가로 오스 겔을 사용하여 전기 영동을 실시. RNA 오염으로부터 약간 줄이 있고 (그림 3)에없이 비교적 큰 밴드 (> 10 KB)의 존재를 확인합니다.
- DNA 농도가 높은, 묽은 DNA 샘플 후속 단계 70 NG / μl의 경우.
4. PCR Primers
이 프로토콜에 사용되는 PCR의 primers는 cogongrass와 JBG genotypes의 plastid trnL-F 스페이서 지역 간의 서열의 차이에 바탕을두고 있습니다. 이러한 차이는 SNPs의 형태 (단일 염기 Polymorphisms)과 독특한 시퀀스의 사이트 (그림 4)에서 primers를 찾는하여 다양한 특정 primers의 개발을 허용 InDels (삽입 및 삭제)로 왔습니다.
- primers의 품질은 PCR 결과에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 믿을만한 회사에서 주문 primers. 우리는 경사 바이오 주식 회사 (으로부터 primers를 주문www.obliquebio.com/web/ / :/ "대상 ="_blank "유일한 표준 탈염 절차를 요청> http://www.obliquebio.com/web/, 헌츠빌, AL),.
- trnL-F 긍정적인 제어 primers : 본 입문서 세트는 11-13 대부분의 잔디 taxa의 plastid trnL-F 스페이서 영역을 증폭하고 좋은 긍정적인 제어 (890 BP 대역에서 발생하는) 역할을한다.
이름 순서 trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 '엑손)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' - 야생 형 cogongrass의 primers : 본 입문서 세트 cogongrass에만이며 genotypes을 JBG의 trnL-F 영역을 증폭하지 않습니다. 595 BP는 밴드 세트 결과입니다.
이름 Sequence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' - JBG와 JBG 것은 primers를 되돌리기 : 본 입문서 세트 유전자형을 JBG에 특정한이며 cogongrass의 trnL-F 영역을 증폭하지 않습니다. 594 BP는 밴드 세트 결과입니다.
이름 순서 trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' - -20 ° C, 장기간에 저장될 수 있습니다 100 MM 주식 솔루션을 얻기 위해 nuclease 무료 ddH 2 O의 충분한 볼륨의 각 프라이머를 Resuspend.
- PCR 설치 단계 이전 12 밀리미터 각 프라이머 주식을 희석.
5. PCR 설정
DNA extractions는 PCR 반응 상기 프라이머 세트의 각을 사용하여 증폭하고 있습니다. 모든 PCR 시약의 잘 일하고 있고 밴드를 생성할 수 있도록 긍정적인 컨트롤을 포함합니다. 시약의 누구도 원하지 않는 DNA로 오염되지 않도록하기 위해 부정적인 컨트롤을 포함합니다. 부정적인 통제는 더 - 템플릿을 포함하지없이 밴드 생산을 초래한다.
- thermocycler 블록과 시료 사이에 나은 열전달을 허용하도록 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에있는 모든 반응을 준비합니다. 우리는 오염을 방지하기 위해 상용 에어로졸없는 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
- 각각의 분리된 DNA 샘플을 보려면 아래 나열된 순서대로 얼음 속에서 다음과 같은 시약을 추가하여 0.2-ML 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에 상기 프라이머 세트의 각을 사용하여 50 μl PCR 반응을 설정합니다. 여러 샘플 준비중인 경우를 제외한 모든 시약이 들어있는 칵테일 만들기DNA를 템플릿의 모든 반응 사이의 균일한 조건을 설정합니다.
PCR 시약 사용하는 볼륨 최종 Concetration Nuclease 무료 ddH 2 O 40.5 μl 10X 장점이 PCR 버퍼 (Clonetech, CA) 5.0 μl 10 % (V / V) 장점 UltraPure PCR dNTP 믹스 (10 MM 각 Clonetech, CA) 1.0 μl 0.2 MM 프라이머 1 (ddH 2 O에서 12μM) 1.0 μl 0.24 μm의 프라이머 2 (ddH 2 O에서 12μM) 1.0 μl 0.24 μm의 장점이 효소 믹스 (Clonetech, CA) 0.5 μl 1퍼센트 (V / V) DNA 추출(70 NG / 반응, 필요에 따라 ddH 2 O 볼륨을 조절) 1.0 μl 1.4 NG / μl 합계 : 50.0 μl - 모든 PCR의 시약이 잘 작동하는지 확인하려면 긍정적인 제어 primers를 사용하여 긍정적인 제어를 설정.이 입문서 세트는 되돌릴 및 기타 목초를 JBG, cogongrass, JBG과 동일하게 작동하며 890 BP는 밴드가 높아집니다.
- 대신 DNA를 추출 ddH 2 O를 사용하여 긍정적인 제어로 설정 같은 컨트롤 프라이머를 사용하여 부정적인 컨트롤을 설치합니다. 모든 시약은 DNA가 오염의 무료면,이 반응은 어떠한 밴드집니다.
- DNA의 농도가 낮은 경우, 더 많은 DNA가 Nuclease없는 ddH 2 O의 양을가 50 μl로 총 반응 량을 가져다 주곤 조정, 각 반응에 추가할 수 있습니다. DNA의 5 개 이상 μl (10 %를 사용하지 마십시오 R 당 총 볼륨)eaction, DNA 샘플에 포함된 가능한 불순물은 PCR 반응을 억제하실 수 있습니다.
6. PCR 사이클링
- 다음 PCR 사이클 매개 변수를 사용하여 온수 뚜껑을 갖춘 thermocycler에서 PCR amplifications을 수행. 우리는 표준 온도 올렸 조건으로 작동하도록 설정 Mastercycle 프로 S thermocycler을 (Eppendorf, Hauppauge, NY)을 사용합니다. 모든 품질 thermocycler 잘 수행한다.
주기 어닐링 변성 중합 일 95시 2 분 ° C 2 95 ° C에서 30 초 30 초 61에 ° C에서 90 초 68에 ° C에서 35 사이클 3 68시 5 분 ° C 샘플을 제거 ° C까지 4에 잡아 - DNA의 품질에 따라 필요에 따라 PCR (뇌관 어닐링 온도, 연장 시간, 순환의 수를 포함)에 대한 조건을 최적화 primers는 thermocycler의 DNA 형성 촉매의 중합 효소 또는 유형이 사용됩니다. 우리는 최적의를 결정할 때 그라디언트 능력 thermocycler를 사용하는 것이 좋습니다 온도 풀림.
- 사용중인 thermocycler는 온수 뚜껑이없는 경우, PCR 사이클 동안 증발을 방지하기 위해 각 시료의 상단에 미네랄 오일 1 방울을 추가합니다.
7. PCR 제품의 젤 전기 영동
분석의 결과를 시각화하는 표준 전기 영동을 사용하여 1 % 아가로 오스 겔에 대한 별도의 PCR 제품.
- 각각의 증폭 PCR 제품의 5 μl와 표준 DNA를 로딩 버퍼 2 μl (일반적으로 5 배 또는 6x 용액)을 결합.
- 전자로 만든 EtBr을 (DNA의 염색법에 대한 ethidium의 브로마이드)이 포함된 1 % 아가로 오스 겔에 샘플을로드ither 태 또는 SB (나트륨 borate)는 버퍼 시스템 16. 우리는 100 ML 1퍼센트 아가로 오스 (0.1 μg / ml) 쇼핑 당 10 밀리그램 / ML EtBr 주식 솔루션 1 μl를 사용합니다.
- 염료 전면에 도달할 때까지 ~ 120V에서 샘플을 실행하여 일정한 젤의 총 길이.
- 자외선 아래에서 (단파 자외선 라이트 박스 등), 적절한 단편이 증폭되었다 있는지 결과 밴드를 검사.
- 가능한 사진 문서 시스템 또는 카메라를 사용하여 겔과 결과 밴드 문서.
8. 대표 결과
PCR 제품의 가시화되면 cogongrass은 JBG 또는 JBG을 (그림 5) 복귀의에 비해 독특한 banding 패턴을 가지고 있습니다. 각각의 DNA 샘플을 보려면 trnL-F 긍정적인 컨트롤 프라이머 세트 ~ 890 BP의 단일 높은 농도 대역을 초래한다. 이것은 모든 PCR 시약 제품이 잘 작동하는지 확인합니다. 마찬가지로 부정적인 컨트롤 (없음 템플릿) 반응은 어떤 입문서의에 대한 밴드 포함되어서는 안됩니다동부 표준시가 사용됩니다. 이것은 시약 중 누구도 오염되지 않았습니다 확인합니다.
DNA 샘플은 야생 형 cogongrass, JBG 특정 primers은 어떠한 밴드가 높아집니다 동안 cogongrass 특정 프라이머 세트는 ~ 595 BP의 단일 밴드가 높아집니다를 사용하여 PCR 반응에서 파생되는 경우. DNA 샘플은 JBG에서 파생된 또는 JBG 되돌 경우 cogongrass 특정 primers은 어떠한 밴드가 높아집니다 동안 마찬가지로, JBG 특정 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시 ~ 594 BP 하나의 밴드가 높아집니다. JBG와 JBG 복귀하는 것은 동일한 핵산 서열을 가지고 있기 때문에, 그들은 따라서 동일한 banding 패턴을해야합니다. 많은 시료가 동시에 겔에 비교 될 경우, 우리는 이렇게 쉽게 긍정적인 결과에 대한 샘플을 스캔하고, 서로 옆에있는 설정 각 프라이머에서 파생된 모든 샘플을 실행하는 것이 좋습니다.
갑니다을 JBG와 JBG 간의 형태학의 차이는 매우 분명 (나뭇잎과 JB의 작은 키가의 예 : 붉은 색 PCR 결과가 동일합니다 반면 G 대 녹색 착색, 더 큰 성장과 JBG의 공격적인 성장을 되돌리려면)은, 그러니까, JBG 종류의 식물 형태를 사용하여 구분하기 쉽습니다.
그림 1. Imperata cylindrica VAR. koenigii (일본어 혈액 잔디)를 재배 온실의 비교는 마찬가지 되돌림 cylindrica VAR. koenigii (JBG는 되돌리기)과 나 cylindrica (야생 형 cogongrass).
그림 2. NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 확인된 DNA 샘플의 예. , 상관없이 사용되는 분광 광도계의, 280분의 260 비율이 가까운 1.8에 있어야하며 230분의 260 비율이 2.0으로 가까이해야합니다.
그림 3. DNA 샘플은 1 % 아가로 오스 겔에 표준 겔 전기 영동을 사용하여 확인. 상업적 유전자 마커는 크기 분석에 사용되었다. 레인 # 4 번짐 및 일부 RNA 오염을 보여주는, 품질이 낮은 DNA 샘플의 예입니다.
Imperata cylindrica VAR. koenigii (일본어 혈액 풀)의 trnL-F 영역의 그림 4. 순서 정렬 마찬가 되돌림 cylindrica VAR. koenigii (JBG는 되돌리기)과 나 cylindrica (야생 형 cogongrass). 수직 검은 화살표 SNPs와 InDels으로 인한 시퀀스의 차이를 나타냅니다. 수평 녹색 화살표 cogongrass 특정 PCR에 사용되는 와일드 타입 cogongrass의 primers의 위치를 나타냅니다. 수평 빨간색 화살표는 PO를 나타내는JBG와 JBG의 sitions은 JBG 특정 PCR에 사용된 primers를 되돌리기.
그림 5. cogongrass 및 JBG 특정 primers로뿐만 아니라 trnL-F 긍정적인 제어 및 템플릿 부정적인 통제없이 결합의 DNA 샘플을 JBG하고 되돌릴 JBG cogongrass에서 파생 PCR 제품의 겔 전기 영동의 대표적인 결과를 가져올 수도 있습니다.
Discussion
미국의 보육 및 조경 산업은 이국적이고 새로운 식물 종을 재배하고 판매에 번성. 무역의 성장 세계화의 결합 이것은, 침입 식물 종 (种)을 입력 수립, 그리고 미국에서 연방 정부가 침략이 될 수있는 가능성을 포함하여 자주 사용할 수없는 정보에 의존 그러한 식물을 조절하는 능력을 확산 것이라는 가능성을 증가 , 토종과 귀화 taxa의 올바른 분류법, 그리고 유전 distinctness. 침입 식물이 우리의 지식은 종종 제한이기 때문에, 숨겨진 침입 특성과 수입 식물은 기꺼이 그들만이 우리 농업과 자연 자원을 침해하는 나중에 배우고 도입되었습니다. 이 프로토콜은 저와 관련된 이러한 문제를 해결하는 것을 목표로 정확하게 야생 형 cogongrass과 관상용 JBG의 대응의 복귀 형태를 구분할 수있는 최초의 단순 분자 방법을 제공하여 cylindrica 품종.
이 프로토콜의 개발을위한 jove_content ">은 야생 형 cogongrass은 2008 년 6 월 제이 플로리다 인근 산타 로사 카운티의 연못 크릭 임업 단위에서 귀화한 인구로부터 수집되었다. JBG는 상업 탁아소 (블루버드 보육, INC로부터 조달되었다 .. Riverdale, MA의 대학 공원 일부터 6 월 2009 년;) 6 월 2008 년뿐만 아니라 콜롬비아에서 주택 소유자의 컬렉션에서 미주리 JBG 준 2008 년 클렘슨 대학, 사우스 캐롤라이나에서 캠벨 지질 박물관의 안뜰에서 얻은 있었을갑니다 및 콜롬비아, 2009 년 미주리 (리랜드 Cseke 식별)의 주택 소유자의 정원에서. 모든 식물은 헌츠빌에서 알라바마의 대학 (헌츠빌, AL)에있는 온실에서 유지되었다.이들 식물에서 수집한 DNA의 유전자 시퀀싱은 일반적으로 바코드 식물 2로 사용 9 독립적인 DNA 영역의 깊이 비교에 포함되어있었습니다. 모든 경우에서, JBG의 시퀀스를 따라서하는 데 도움 JBG 되돌릴 분들에게 100 % 일치했다JBG 실제로 녹색, 침입 형태로 되돌리려는 것을 확인합니다. 오직 핵 ITS와 엽록체 trnL-F 영역은 유전자 cogongrass와 JBG 구별하는 데 사용할 수있는 차이점이 있습니다. trnL-F 지역은 2 SNPs 2 InDels합니다 (삽입 및 삭제)이있는 동안은 ITS 지역, cogongrass와 JBG 사이 세 SNPs (단일 염기 polymorphisms)의 총 있습니다. 이러한 유전적 차이는 야생 형 cogongrass와 JBG이갑니다 구분 수있는 개발되는 다양한 특정 PCR의 primers를 허용했다. 가장 안정적인 결과는 plastid trnL-F 지역에서 파생된 primers에서 왔습니다. 따라서이 프로토콜은 cogongrass, JBG의 엽록체의 게놈의 trnL-F 지역 및 JBG (그림 4) 되돌 간의 순서의 차이에 따라 달라집니다.
문제의 종류, 더 구체적인 primers를 생성할 수 있도록하고 밀접하게 관련 종, 야외에서 잘못된 반응을 방지하기 위해I.의 리터 알려져 trnL-F 시퀀스 cylindrica 품종은 관련 잔디 종 (29 종 43 독립적인 시퀀스, 예를 들어, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, Miscanthus sinensis의, Saccharum officinarum, 수수 halepense)에서 trnL-F 시퀀스와 비교되었다. 우리는 잔디, 다양한 특정 primers의 특이성의 29 여종에 걸쳐 다양한 전용 프라이머 시퀀스를 검사 있지만 종합적으로 대부분의 다른 잔디 종에서 DNA를 증폭하는 기능에 대해 검사되지 않았습니다. 따라서 DNA 추출에 사용되는 조직은 신중하게 나로 식별되어야합니다 cylindrica 전에이 프로토콜을 시작합니다. 잔디는 다음 cogongrass 또는 JBG 중으로 확인할 수 없다면 우리는 시퀀스 cogongrass 또는 JBG에 정확히 일치하는 것을 확인하기 위해 PCR 제품을 시퀀싱하는 것이 좋습니다. 현재 주어진 잔디 시편의 신원을 확인하는 가장 정확한 방법은 t 모두에서 PCR을 수행하는 것입니다rnL-F와 ITS 지역 시퀀스 PCR 제품을 확인하고 정확하게 식별 taxa에서 알려진 시퀀스의 시퀀스를 비교하여 따라갔다. DNA가 컨트롤이 프로토콜에 설명된 primers (trnL-F 지역의 경우) 또는 다른 primers 기타 출판물 13-15에서 해당 이용할 수를 사용하여 증폭 할 수 있습니다. 시퀀싱이 훨씬 노동 및 간소화된 절차를 사용하여보다 집중적인 비용입니다.
PCR에 사용된 primers의 품질은 프로 시저의 성공에 중요합니다. 우리는 경사 바이오 주식 회사 (에서 제공하는이 절차에 대한 primers를 만들었 http://www.obliquebio.com/web/ , 헌츠빌, AL). 경사 바이오에서 primers 주문에 대한 장점은 그들이 우리 실험실에서 최적화에 사용된 primers와 같은 동일한 샘플 생산 시리즈에서 각 프라이머의 aliquots 다수를 저장한다는 것입니다. 따라서, primers는 같은 순서를 가지고 있지만, t 없습니다야이 프로토콜에 사용되었습니다 동일한 생산 많이에서 왔어요. 같은 많은로부터 primers를 사용하여 PCR의 primers의 품질의 차이에서 발생할 수있는 절차에 필요없는 변수를 방지하는 데 도움이됩니다. 마찬가지로 다른 DNA 형성 촉매의 polymerases는 PCR, 사용된 DNA 형성 촉매 효소의 품질을 위해 좋을 동안 PCR 결과의 품질에 영향을 미칠 것이다. PCR 시약의 더 나은 일관성을 허용하기 위해, 우리는 Clontech의 시약을 사용하여 프로토콜을 최적화했습니다. 장점이 효소는 (Clontech, 캘리포니아 주 마운틴 뷰, 고양이 # 639201 또는 639202) 강력한, 핫 스타트 DNA 형성 촉매의 중합 효소의 혼합물과 높은 특이성과보다 정확한 amplifications를 제공하는 데 도움이 증명 독서 효소이다.
이 프로토콜은 maternally 목초에서 상속되는 엽록체의 DNA에 의존하기 때문에 cogongrass 및 JBG의 genotypes 사이의 하이브리드화 이벤트는 우리의 분자 식별 절차에 캡처되지 않을 수 있습니다. hypridization가 suspe는 경우cted, 우리는 양쪽 부모로부터 상속됩니다 핵 영역을 사용하는 것이 좋습니다. 식물 genotyping에서 고려해야 할 가장 일반적으로 사용되는 비 plastid 변수 영역은 핵 ribosomal ITS 지역 13-15,17입니다. 현재, 우리는 동일한 PCR 튜브에 핵 ITS 영역의와 엽록체 trnL-F 영역의 증폭을 멀티플렉싱으로 진전된다. 핵 DNA 영역으로 plastid 멀티플렉싱하는 것은 잠재적으로 홀로 중 하나를 사용하는 한계를 우회할 것이다 있지만, 이러한 방법은 케이스별로 사건에 타당성을 결정하는 최적화 및 추가적인 평가가 필요합니다. 정량 실시간 PCR (qPCR)과 같은 분자 비콘 (형광 프라이머 프로브) 등 최신 기술의 사용은 또한 고장 안전하고 정확한 식물 genotyping 방법으로 취급되고있다.
여기에 제시된 프로토콜은 JBG는 야생 형 cogongrass의에서 되돌릴 구별하는 빠르고 안정적인 접근 방식을 제공합니다. 우리는 사용 권장이 프로토콜의 RS는이 프로토콜의 사용에서 파생된 결과를보고하기 위해 저희에게 연락하십시오. 이러한 공유 정보 JBG는 되돌려의 분포에 관한 정보를 제공하는 데 도움이됩니다. 이것은 USDA의 규제가 매우 침략적 cogongrass 품종의 보급과 잠재 하이브 리다이 제이션을 회피 할 수있는 행동에 객관적인 판단을 내릴 도움이 될 것입니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리는 표본을 얻기에 도움 앨런 Tasker (USDA-진딧물, Riverdale, MD), 스티븐 콤튼 (클렘슨), 셰리 Aultman (클렘슨), 크레이그 램지 (USDA-진딧물, 포트 콜린스, 콜로라도), 그리고 베티 Marose (UMD)를 감사 . 우리는 비디오의 촬영에 그의 작업에 대한 학생 앤드류 아드리안 (UA-헌츠빌)와 데릭 대커 (UA-헌츠빌)이 프로토콜을 테스트하고 그들의 도움, 그리고 요셉 Herdy 감사드립니다. 이 작품은 국립 수산 및 야생 동물 재단에 의해 후원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5’ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech Laboratories | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech Laboratories | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
References
- Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).
- CABI, Crop Protection Compendium. Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , Wallingford, UK. (2007).
- MacDonald, G. E. Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management. Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).
- Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).
- Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management. Weed Technology. 12, 737-743 (1998).
- Chikoye, D., Ekeleme, F. Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa. Weed Research. 41, 475-490 (2001).
- Weber, E. Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).
- Patterson, D. T. Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats. Weed Science. 28, 735-740 (1980).
- Cole, J. T., Cole, J. C. Ornamental grass growth response to three shade intensities. Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).
- Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability. Weed Technology. 21, 141-144 (2007).
- Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States. Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).
- Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. CPHST Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).
- Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers. J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).
- Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).
- Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data. Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).
- Brody, J. R., Kern, S. E. Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques. 36, 214-216 (2004).
- Chou, C. -H., Tsai, C. C. Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).
