Summary
I den här artikeln beskrivs en metod för märkning embryonala hud och tymus blodkärl.
Abstract
Inrättandet av en fungerande blodkärl nätverk är en viktig del av organogenesen, och krävs för optimal organfunktion. Till exempel, i tymus korrekt vaskulaturen bildning och mönstring är nödvändig för tymocyt inträde i organet och mogna T-cell-utgång till periferin. Den rumsliga arrangemanget av blodkärl i tymus är beroende signaler från den lokala mikromiljön, nämligen tymiska epitelceller (TEC). Flera färska rapporter tyder på att störningar av dessa signaler ger tymus blodkärl brister 1,2. Tidigare studier har beskrivit tekniker som används för att märka den neonatala och vuxna bräss vaskulatur 1,2. Vi visar här en teknik för märkning blodkärl i embryonala tymus. Denna metod kombinerar användningen av FITC-dextran eller Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lektin I (GSL 1 - isolectin B 4) ansikts ven injektioner och CD31 antikroppsfärgning att identifiera tymus vascular strukturer och PDGFR-β att märka tymus perivaskulära mesenkym 3-5. Alternativet att använda kryosnitt eller vibratom sektioner tillhandahålls också. Detta protokoll kan användas för att identifiera tymus vaskulära defekter, vilket är avgörande för att definiera roller TEC-härledda molekyler i tymus blodkärlsbildning. Eftersom metoden märker hela kärlsystemet, kan den också användas för att analysera de vaskulära nätverk i flera organ och vävnader i hela embryot inklusive hud och hjärta 6-10.
Protocol
1. Fluoresceinmärkt dextran och GSL I-isolectin B 4 ansikts ven injektioner att märka embryonal vaskulatur
- Framställ FITC-dextran (50ug/mL) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) i PBS i ett 1,5 mL Eppendorf-rör och värm till 37 ° C. Lägg 100 ul av 1,25 mM lager Fast Green / PBS till FITC-dextran-lösning (total volym 1 ml) och 180uL slut 1,25 mM Fast Green / PBS till GSL 1 - isolectin B 4 (total volym 200uL), så att lösningen är synligt blått.
- Dissekera E14.5-E18.5 embryon och gulesäcken tillsammans lämnar allantois stjälk (navelsträng artär och ven) intakt.
- Överför embryon till en ny petriskål (60 x 15 mm) och sänk ner dem i PBS vid rumstemperatur.
- Placera embryot för att åstadkomma en sagittal vy av huvudet / ansikte. Använd micro dissekera pincett för att försiktigt ta tag i embryot i spetsen.
- Med hjälp av en 30G nål, injicera 50 pl FITC-dextran (50ug/mL) eller GSL1 - isolectin B 4 (20ug i 200uL PBS) i ansiktet ven Nålen mot baksidan av huvudet.
- När färgen är synlig i navelsträngen ven, ta bort nålen och separera embryot från allantois stjälk (navelsträng artär och ven).
- Efter injektioner, tillåta embryot att förbli i PBS vid rumstemperatur under 2-3 minuter så att färgämnet cirkulerar hela embryot.
2. Hel-mount analys av hudens vaskulatur
- Efter att färgen att cirkulera i hela embryot, ta bort hud prover från områden i armar och ben, rygg och mage, etc. 8,9.
- Tvätta huden prov i kallt PBS och fixa i 4% PFA / PBS i 2 timmar 8,9. Tvätta 3 gånger under 10 minuter vardera i 4 ml klar flaska med 2 ml kall PBS.
- Placera hudprov på ett objektglas och tillsätt 100 pl montering media till varje bild och ett täckglas.
- Låt objektglasen torka i ett mörkt förråd.
- Proceed till Steg 2 'Image Acquisition avsnittet.
3. Multi-color märkning av tymus och hjärtats kärlsystem och perivaskulära celler för kryosnitt (Fortsätt från punkt 1, steg 7)
- "Flash frysa" hela embryo i flytande kväve. Embryon kan vara och lagrades vid -80 ° C tills analys.
- Alternativt dissekera ut bräss, skölj i 4 ° C PBS och fixa i 2 ml 4% paraformaldehyd (PFA) / PBS under 2 timmar. Tvätta 3 gånger under 10 minuter i kall PBS, plats Thymi i OCT, och frysa och lagra tills användning vid -80 ° C.
- För cryosectioning, sprida oktober på ett avsnitt "block" och montera embryot eller dissekerade organ / vävnader för sektionering.
- Skär frusen vävnad i 10 nm tjocka sektioner och samla på bilder.
- Fix sektioner i aceton under 5-10 minuter. Tvätta 3 gånger i kall TBS.
- Block i 10% donkey serum / TBS i en fuktkammare vid rumstemperatur.
- Inkubera sektioner för 1 timmes natten med 100 pl av primärantikroppar i en fuktkammare vid 4 ° C: i detta exempel använder vi råtta anti-mus CD31 (1:100) för att märka endotel, och get-anti-mus-PDGFR-β (1:100) för att märka perivaskulära celler. Det är nyttigt att täcka bilder med individuellt skurna Parafilm band för att säkerställa att antikroppen jämnt spridd över hela sektionen.
- Efter inkubation med primär antikropp, tvätta avsnitt 3 gånger i kall TBS. Inkubera med 100 pl av lämpliga sekundära antikroppar under 30 minuter minimum.
- Tvätta 3 gånger i kall TBS. Tillsätt 100 | il montering media till varje objektglas och ett täckglas.
- Låt objektglasen torka i ett mörkt förråd.
- Gå vidare till "Image Acquisition avsnittet.
4. Multi-color märkning av tymus vaskulatur och perivaskulära celler för vibratome sektioner (Fortsätt från punkt 1, steg 7)
- Dissekera ut bräss lober från embryo och skölj i kallt PBS.
- Fix tymus i 4% PFA / PBS vid rumstemperatur under 2 timmars..
- Tvätta i PBS-Triton X (0,15%) 3 gånger, 10 minuter och plats Thymi i en liten plast patron och dränka i 4% låg smältpunkt agaros / PBS (~ 4 ° C). Tymus bör vara i kontakt med botten av kassetten.
- Låt agaros att stelna på is (3-5 minuter). Använda ett rakblad för att skära bort överflödigt agaros. Lägg lim på vibratom blocket och vidhäftar provet till blocket.
- Lägg kall PBS till vibratome vattenbad tills provet och klingan är nedsänkta.
- Ange hastighet och amplitud (hög amplitud och låg måttlig hastighet är idealisk för mjuka thymus sektioner). Amplituden bör reduceras om avsnitten bryta upp på grund av överskott agitation.
- Skär 50 um sektioner.
- Med hjälp av en pensel, samla avsnitt i en 24-brunnars mikroplatta i kall PBS.
- Block sektioner 500 pl 10% åsna serum i PBS-Triton X (0,15%) under 30 minuter.
- Inkubera sektioner för 8 timmar till över natten med primär antikropp, såsom anti-CD31 och anti-PDGFR-β, I en täckt 24-brunnars mikroplatta.
- Tvätta 3 gånger i PBS-Triton X (0,15%) under totalt 8 timmar vid 4 ° C.
- Block sektioner 10% åsna serum i PBS-Triton X (0,15%) under 30 minuter.
- Inkubera sektioner under 8 timmar till över natten vid 4 ° C med lämpliga sekundära antikroppar.
- Tvätta 3 gånger i PBS-Triton X (0,15%) under totalt 8 timmar vid 4 ° C.
- Re-fix prover i 4% PFA / PBS i 30 minuter på is.
- Tvätta 3 gånger i PBS-Triton X (0,15%) under 30 minuter på is.
- Dehydratisera prover genom en graderad MeOH / PBS-Triton X-serien: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH och 100% MeOH vid 10 minuter för varje steg. Ersätt 100% MeOH med färsk MeOH efter 10 minuter och inkubera under 1 timme vid rumstemperatur.
- I en glasbehållare, blanda BABB (Benzylalkohol: bensylbensoat) i ett 1:2 förhållande. Kombinera BABB med MeOH för en slutlig koncentration av 50% BABB och 50% MeOH. Inkubera provet i Babb: MeOH i 10-15 minuter.
- Överför sample till en glasbehållare med 100% BABB och inkubera under 10-15 minuter eller tills raderas, vid rumstemperatur.
- Fyll depression bild (0.7mm djup) med färsk 100% BABB och överföring prov åt sidan. Lägg täcka glas (nr 1,5) och försegla med 2-3 strykningar nagellack. Låt nagellack härda i mörker vid rumstemperatur, sedan lagra prov vid 4 ° C.
OBS: Bilder ska vara helt täta innan konfokala bildtagning. Bilder skall tas inom 12-24 timmar, fluorescerande färgämnen kan blekna i Babb. - Gå vidare till "Image Acquisition avsnittet.
5. Bild förvärv
- Bild 10 um frysta snitt med en konfokalmikroskop med Plan-Apochromat 20X/0.8 mål (512 x 512 pixlar) med 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 - och 633-nm linjer laser.
- Förvärva konfokala z-sektioner av hela berget hud och 50 um agaros-inbäddade profiler med hjälp av Plan-Apochroma t 10X/0.4 mål (512 x 512 pixlar) med 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 - och 633-nm linjer laser. Serial Z-profiler ska samlas sekventiellt vid 1-micron för respektive kanal.
- Rekonstruera seriell Z-profiler med Zeiss AxioVision 4,6 eller annan bildanalys programvara.
6. Representativa resultat:
Effektiv märkning av embryonala vaskulaturen är avgörande för att bedöma fel blodkärl i embryonala möss. Figur 1 visar specifik märkning av E16.5 tymus blodkärl (1A-B) och sam-märkning med CD31 (1B), förutom färgning av de högra och vänstra ventriklarna (1E-F), resp. GSL I-isolectin B 4 protokoll för kryosnitt som beskrivs i avsnitt 1, 3 och 5 användes i dessa experiment. Hel-mount märkning av huden blodkärl nätverk E16.5 möss, enligt protokollen i avsnitt 1, 2 och 5 visas i figur 1C-D.
ntent ">
Figur 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B 4 ansiktet ven injektioner i E16.5 musembryon. en. kryosnittet embryonala tymus efter injektionen. b.. Sammanfoga CD31 tillsammans märkning med isolectin B 4. c.. och d. Hela-berg embryonala hud vaskulatur efter injektionen. e. och f.. kryosnittet av embryonala hjärta e. (höger kammare) f.. (vänster kammare) efter injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hel-fäste och PECAM-1 (CD31) färgning på sektioner är de konventionella metoderna för märkning av kärlen i embryonala möss. Dessa metoder kräver användning av direkt och / eller indirekt immunofluorescens, och tvättmedel till permeabilisering musvävnad. Det visar sig vara en ganska lägligt process. Här har vi använt FITC-dextran eller isolectin B 4 ansikts injektioner vein att direkt märka embryonala vaskulaturen, vilket eliminerar kravet på steg antikroppsmärkning. Vidare medger denna metod att bedöma den funktionella statusen av kärlsystemet, som "läckande" fenotyper kommer att avslöjas genom denna metod, men inte genom konventionella antikroppsfärgning metoder.
Vi har validerat effektiviteten av denna teknik genom att analysera delar av embryonala tymus, och hjärta, liksom hela fästen av hud vaskulatur strax efter ansikts ven injektioner. Dessutom har vi färgade bräss sektioner för CD31 efter FITC-dextren eller isolectin B 4 injektioner för att visa att FITC märker specifikt embryonala vaskulära strukturer. Därför FITC-dextran eller isolectin B 4 ansikts ven injektioner i embryon kan användas för att snabbt bedöma vaskulära fenotyper i flera organ i hela utveckling. Dessutom medger detta förfarande för forskare att bestämma specifik tid under utveckling i vilken den perifera vaskulaturen embryonala ansluter till ett organ av intresse, genom angiogenes. Vi har inkluderat ett protokoll antikroppsmärkning som är kompatibel med denna FITC-dextran eller isolectin B 4-protokollet. Med hjälp av detta protokoll, får PDGFR-β, SMA-α och andra antikroppar, som märker strukturella komponenter i blodkärl, användas för att ytterligare bedöma vilken typ av embryonala vaskulära defekter.
Viktigt: Ett färgämne som Fast Green kan läggas till FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4 lösning för att visualisera blandningen som det jags injiceras i ansiktet ven. Kort efter FITC-dextran injektion, kan färgämnet observeras i navelsträngsvenen och i blodkärl i hela gulesäcken och placenta. Vid denna punkt bör navelsträngen avlägsnas från embryot. I händelse av att färgämnet inte detekteras i allantois stjälken (navelsträng artär och ven) tekniken misslyckades troligen. Vi har observerat att om nålen inte direkt in i ansiktet ven, FITC-dextran / fluoresceinmärkt GSL 1 - isolectin B 4 ackumuleras i närliggande områden i ansiktet. Vi har också observerat att FITC-dextran märker hela kärlsystemet, medan GSL 1 - isolectin B 4 etiketter mest embryonala vaskulära strukturer, men även icke-vaskulära celler i levern. En fluorescens-dissektionsmikroskop kan användas för att testa huruvida injektion var lyckad.
Möss
C57BL6 / J-möss köptes från Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Embryon genererades genom vild typ, tidsinställda parningar. Experiment har godkänts av University of Georgia institutionella Animal Care och användning kommittén.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag nummer R01AI055001 och R01AI082127 från NIAID till NRM och SREB Disputation Fellowship Award till JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
