Summary
Естественных клеток-киллеров в небольшой популяции лимфоцитов. Здесь мы показываем, как изолировать эти клетки из человеческой крови путем отрицательного отбора, используя набор из StemCell Technologies. Клетки, полученные жизнеспособны и нетронутой антитела, и, следовательно, готов к использованию в течение нескольких процедур.
Abstract
Естественных киллеров (НК) клетки больших гранулярных цитотоксических лимфоцитов, которые принадлежат к системе врожденного иммунитета и играют важную роль в борьбе против рака и инфекций, но они также участвовали в ранних стадиях беременности и отторжения трансплантата. Эти клетки присутствуют в периферической крови, из которых они могут быть изолированы. Клетки могут быть изолированы с использованием либо положительного или отрицательного отбора. Для положительного отбора мы используем антитела, направленные к поверхности маркер присутствует только на клетки интерес, тогда как для отрицательного отбора мы используем коктейли антител, направленных на поверхностные маркеры присутствуют на всех клетках, но клетки интерес. Последний метод представляет преимущество оставляя клетки беспроцентный антител, тем самым снижая риск нежелательного активации клеток или differenciation. В этом видео-протокола мы покажем, как отделить NK клетки из человеческой крови путем отрицательного отбора, используя RosetteSep комплект от StemCell технологий. Процедура включает в себя получение периферической крови человека (в соответствии с институциональными наблюдательного совета, утвержденные протоколом для защиты человека в качестве субъекта) и смешивая его с коктейль из антител, которые связываются с маркерами отсутствует на киллеров, но присутствует на всех других мононуклеарных клеток в периферической крови (например, Т-лимфоциты, моноциты ...). Антител, присутствующих в коктейль сопрягаются с антителами, направленных на гликофорина на эритроцитах. Все нежелательных клеток и красных кровяных клеток, таким образом, оказаться в ловушке комплексов. Сочетание коктейля крови и антител, затем разбавляют, наложенных на Histopaque градиента, и центрифугировали. NK клеток (> 80% чистоты) могут быть собраны на границе Histopaque и разбавленной плазмы. Подобные коктейли доступны для обогащения других популяций клеток, например, человеческий Т-лимфоцитов.
Protocol
Подробный протокол входит в состав каждой изоляции коктейль Розетка сентября и доступна в Интернете на веб-сайте StemCell технологий 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клеток, выделенных с помощью этой техники можно дополнительно разделить на различные группы населения с использованием других комплектов разделения клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosette Sep cocktail for human NK cells | Reagent | Stem Cell Technologies | 15065 | |
| PBS, steile, 1x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-058 | |
| Fetal calf serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| Histopaque-1077 | Reagent | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| PBS supplemented with 2% FCS and Histopaque solutions must be brought to room temperature before the begining of the procedure. | ||||
References
- Procedures and instruction manuals. , http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx Forthcoming.
