Summary
في الكائنات النموذج ، ويمكن التلاعب transgenesis ظائف الجينات في حين يمكن رني ضربة قاضية نصوص محددة مرنا 1-2. هذا البروتوكول يهدف لتوضيح التقنيات اللازمة لإدخال الحمض النووي التي تنتقل ستابلي وعابرة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل في الخيطية necromenic
Abstract
على الرغم من أنها غير معقولة على نحو متزايد بالنسبة للكائنات نموذج الناشئة للحصول على تسلسل الجينوم تماما ، وكذلك في العمق وظائف الجينات والتحليلات التعبير تدخل الحمض النووي الريبي وtransgenesis مستقرة. تظل محدودة في كثير من الأنواع بسبب التشريح والبيولوجيا الخلوية خاصة الجزيئية للكائن على سبيل المثال ، خارج من انواع معينة المجموعة التي تضم تاج ايليجانس انواع معينة 3 ، تنتقل ستابلي خطوط المعدلة وراثيا في انواع معينة من غير الأنواع لم يتم الإبلاغ عنها في هذه العائلة خادع (النيماتودا) ، مع استثناء من الأسطوانيات البرازية 4 و 5 Pristionchus pacificus. لتسهيل توسيع دور P. pacificus في دراسة التنمية والتطور ، والسلوك 6-7 ، ونحن هنا تصف الأساليب الحالية لاستخدام microinjection الحيوانات المعدلة وراثيا لجعل والجينات التي نهدم رني. مثل الغدد التناسلية لل
Protocol
1. Transgenesis : إعداد الحمض النووي
- المهيمن المشترك الحقن علامة : pRL3 [PPA - PRL - 1 (tu92)]
والبلازميد pRL3 هو المهيمن المشترك الحقن علامة لتحديد بصريا أحداث التحول الناجح. هذا البلازميد بترميز لأليل متحولة المهيمنة (tu92) من الجين PPA PRL - 1 - ترتبط ارتباطا وثيقا sqt - 1 الجين الكولاجين في C. ايليجانس ويحول تحرك في اتجاه عقارب الساعة الى wildtype الجيبية حركات اللف على طول جسم الدودة محور 1،5. الحيوان تحول مشابه جدا للعلامة الاختيار الشعبي السائد رول - 6 (su1006) المستخدمة في C. ايليجانس على مدى السنوات ال 20 الماضية. - الهدف التحوير المراسل : المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP
يمكن ربط الجينات ذات الاهتمام transcriptionally أو translationally إلى GFP تسلسل الترميز 9. في هذه الدراسة ، والمؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4promoter : تم GFP (EGL - 4 ، المركب كيناز البروتين التابعة) الاستخدام :د لتحديد ما إذا كان جزء 2 كيلو المنبع لبدء الترجمة يمكن أن تمنح في التعبير GFP P. pacificus PS312. هذا ناقلات GFP يحتوي على المنطقة مع تعديل الترميز GFP
الإنترونات متعددة في المؤسسة العامة للتقاعد ، RPL - 23 3 'UTR فاصل 5 قدم وانغ Xiaoyue تتكرم ورالف جيه سومر (معهد ماكس بلانك ، توبينجن وألمانيا والاتحاد الأوروبي). و - الجينومية دنا : PS312
إضافة P. wildtype مطلوب pacificus الحمض النووي الجيني PS312 للحصول على الميراث التحوير مستقرة ، ولا سيما من الحيوانات المعدلة وراثيا 1 F لذريتها 2 F 5. فإنه ليس من المؤكد حتى الآن إذا كان الحمض النووي الجيني الأشكال المعقدة صفائف الكروموسومات اضافية مع الجينات المحورة اثنين (علامة المشترك الحقن PRL - 3 والمؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : مراسل GFP) مشابهة لتلك التي لوحظت في مستقر خطوط المعدلة وراثيا في 2 F جيم ايليجانس 3. ومع ذلك ، فإن شرط الحصول على الحمض النووي والجينات المحورة الجينومية لتبادل cohesi متطابقةلقد يتدلى توحي بقوة تشكيل صفائف خارج الخلايا الصبغية مجمع المضيف يمكن التعرف على الحمض النووي للانتقال السليم (gDNA إعدادها باستخدام سيغما G1N10 الطقم). - الحمض النووي الهضم
وتستخدم أنزيمات تقييد ليصبح خطي من المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP ناقلات الحمض النووي لانتاج ويتدلى لزجة متوافق مع pRL3 علامة المشترك الحقن وgDNA PS312. مزيج من خلال استغلال ، وليس vortexing. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.
| pRL3 | 4 ميكروغرام |
| 10xbuffer | 10 ميكرولتر |
| PstI (10 U / ميكرولتر) | 4 ميكروليتر |
| DH 2 O | ~ |
| المجموع : | 100 ميكرولتر |
| المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP | 4 ميكروغرام |
| 10X العازلة | 10 ميكرولتر |
| سالي (10 U / ميكرولتر) | 4 ميكروليتر |
| DH 2 O | ~ |
| المجموع : | 100 ميكرولتر |
| gDNA PS312 | 10 ميكروغرام |
| 10X العازلة | 10 ميكرولتر |
| PST الأول وأنا سال (10 U / ميكرولتر) | ميكرولتر 8 |
| DH 2 O | ~ |
| المجموع : | 100 ميكرولتر |
الجدول 1. الخليط لتقييد الإنزيم دايجست.
- الحمض النووي هطول الأمطار ، وإعداد
- إضافة 1:10 خلات الصوديوم (3 م 3 NaCOOCH الهيدروجيني 5.2) و2.5X حجم الإيثانول بنسبة 100 ٪ على المنتج لهضمها ، ويضاف 20 نانوغرام / ميكروليتر من الجليكوجين لرؤية بيليه أسهل.
- الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- صب وطاف بواسطة تيبينانوغرام ببطء أنبوب الطرد المركزي رأسا على عقب ومن ثم النقر على ورقة الأنسجة ، والتأكد من أن بيليه هو آمن على الزاوية السفلى من الأنبوب وخالية من الايثانول.
- إضافة 1 مل من الايثانول 75 ٪.
- تدور على الفور في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- صب وطاف قبل التحول ببطء أنبوب الطرد المركزي رأسا على عقب ومن ثم النقر على ورقة الأنسجة التأكد من أنها آمنة بيليه في الزاوية السفلى من الأنبوب وخالية من الايثانول.
- بيليه الجافة في اجهزة الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة فراغ لمدة 5 دقائق في 25-30 درجة مئوية ، حتى جافة وخالية تماما من الايثانول.
- إضافة 30 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات أو معقمة درهم 2 O وترك بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لفترة وجيزة قبل الاختلاط دوامة.
- الجدول 2 يصف كيفية إنشاء خليط من كل حقن الحمض النووي المنقى للحقن.
- المحل في -20 درجة مئوية. بعد ذوبان الخليط عن طريق الحقن ، وتدور في أسفل أنبوب 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق للتخلص جسيمات الحطام التي قدتسد إبرة الحقن.
| المادة الوراثية | تركيز |
| المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP (سالي) | > 5 نانوغرام / ميكروليتر (0.1-10ng/μl) |
| pRL3 (PstI) | > 1 نانوغرام / ميكروليتر |
| gDNA PS312 (PstI + سالي) | > 60 نانوغرام / ميكروليتر |
| DH 2 O | ~ |
| المجموع : | 30 ميكرولتر |
الجدول 2. خليط PPA PRL - 1 - الحقن
2. الحمض النووي الريبي التدخل : في المختبر توليف الحمض النووي الريبي مزدوج تقطعت بهم السبل
- استخدام PCR لتضخيم الجين من الفائدة. واستخدمت RHL091 5' - agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 3 "(BamHI الموقع) وRHL092 5' - tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3" (موقع PstI) لتضخيم الجينومية غليان 464 فرجمنة (موقف 3-466) من ناقلات pRL3 تحتوي على أليل PPA - PRL - 1 (tu92).
- هضم منتج PCR مع BamHI وPstI.
- Ligate جزء لBamHI / PstI يهضم pL4440 رني ناقلات التغذية 2.
- تحويل ناقلات إدراجها في الخلايا المختصة وتنمو عليها وسائل الاعلام على لوحات أمبيسيلين LB (50 ميكروغرام / مل).
- حدد إدراج ناقلات بنجاح PCR باستخدام بادئات T7.
- استخدام T7 يحيط PCR المنتجات التي تحتوي على جينات PRL - 1 لجعل المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الرنا المزدوج الجديلة) باستخدام BLOCK - IT رني توليف مجموعة (Invitrogen).
- تركيز الرنا المزدوج الجديلة الأفضل إذا> 200 نانوغرام / ميكروليتر ، وتصل إلى 1 ميكروغرام / ميكروليتر للحقن.
- المحل في -20 درجة مئوية. بعد ذوبان الخليط عن طريق الحقن ، وتدور في أسفل أنبوب 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق للتخلص من جسيمات الحطام التي قد تسد إبرة الحقن.
3. Microinjection : بروتوكول لحقن الجينات المحورة و / أو الرنا المزدوج الجديلة
- حقن الابر
- مجموعة الإبرة Narishige مجتذب (نموذج # : PC - 10) درجة الحرارة :
- بدوره مفتاح أسفل إلى "مسخن NO.2".
- تحويل "مسخن NO.2 الصفة". مقبض الباب حتى لوحة يقرأ 55،0-60،0 درجة مئوية لمدة طرف مدبب إبرة ذات أطوال متباينة.
- أدر مفتاح أسفل الظهر إلى "الخطوة 1" (تسحب الإبرة في خطوة واحدة).
- تحميل إبرة في الغرفة والتأكد من أنها آمنة.
- اضغط على زر "ابدأ" (زر أحمر) والسماح ليتم سحبها إبرة مع جميع الأوزان (وهذا ينبغي أن إبرتين متطابقة في اتجاهين متعاكسين).
- إزالة الإبرة من غرفة وتخزينها في لوحة الثقافة البلاستيك المضمون في المكان قبل المباراة ، دوه لمنع الغبار من التراكم على الإبر.
- مجموعة الإبرة Narishige مجتذب (نموذج # : PC - 10) درجة الحرارة :
- تصاعد الوسادات
- في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل ، وجعل حل 2 ٪ آجار نوبل بإضافة 0.02 غرام من آجار نوبل إلى 1 مل من H 2 O. ويمكن تخزين أغار عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى عام.
- مزيج دقيق وآغار تذوب في كتلة لتعيين حرارة> 88 درجة مئوية.
- باستخدام micropipette 1 مل ، ضع قطرة من أجار السائل الكريم إلى 2 ٪ في منتصف شريحة زجاجية (فيشر ، 12 544 فهرنهايت).
- تتسطح عن طريق وضع شريحة أخرى من الزجاج على أعلى من الانخفاض.
- تكرار "الخطوة إسقاط" حتى يكون هناك طبقة من الزجاج خمس شرائح.
- إزالة كل شريحة زجاجية عن طريق تحريك الشرائح الزجاجية قبالة بعضهما البعض.
- آغار منصة جافة تتسطح على الشرائح الزجاجية في فرن الفراغ عند 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ليلة وضحاها (أو في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها).
- جعل منصات حقن وتخزين متعددة لاستخدامها في المستقبل.
- Microinjection في المناسل hermaphroditic
الشكل 1. رسم تخطيطي للP. pacificus التشريح. الخلايا الأنوية واضحة هي خلايا جرثومية الإناث (البويضات) والجزء المظلل الرمادي هو الأمعاء. ويرد واحد فقط التناسلية الأمامية القاصيولكن لاحظت المناسل two القاصي عبر بعضها البعض ظهريا قرب منتصف الجسم.
الشكل 2. صور microinjection (A) غيض إبرة الحقن في التركيز مع خط اليمين المتطرف من قطعة سحبت الشعرية. عن طريق لمس طفيفة غيض من الإبرة إلى أن الحافة ، ينبغي التلميح الإبرة كسر مع الاحتفاظ نقطة حادة. (ب) والغدد التناسلية إدراج إبرة في رأس فقط فوق انحناء القناة الهضمية لحقن الأولى. (C) والغدد التناسلية إدراج إبرة في أسفل أسفل القناة الهضمية للانحناء الحقنة الثانية.
- تأكد من التباين ومدينة دبي للإنترنت الإعداد القص مثالية لعرض المناسل خنثى.
- تحميل 1،0-2،0 ميكرولتر من خليط حقن إبرة لسحب شعري.
- مكان الإبرة في تتلاعب microinjection ، وينبغي وضع مقاييس ضغط خزان النيتروجين إلى الظروف المثالية (10-20 رطلل0،5-1 ثانية).
- كسر رأس الإبرة من خلال لمس ذلك قليلا إلى حافة أنبوب شعري سحبت رقيقة توضع على شريحة (الشكل 2A).
- إبرة الشريحة الكسارة : أنحف جزء من شعري وسحبت توضع على شريحة زجاجية في قطرة من النفط
- بمجرد كسر الإبرة يمكن أن يكون في مكان وضع الخمول أثناء التقاط الدودة الخاص إلى لوحة (P. pacificus يكون نافذة لمدة 5 دقائق قبل الحقن أصل الجافة وأنهم يموتون).
- باستخدام لوحة كاملة من الديدان البالغة J4 يونج ، صب زيت برافين يكفي (الثقيلة) لمجرد تغطية جميع الديدان في الحديقة OP50 البكتيرية.
- اختيار دودة ووضعه على منصة الحقن.
- وضع شريحة زجاجية مع دودة على المجهر ؛ موقف التناسلية الدودة في اتجاه الإبرة والفرج بعيدا عن الإبرة (الشكل 2B ، 2C).
- انخفاض الإبرة إلى موضع العرض المجهر.
- موقف التناسلية العليا وإبرة في نفس الطائرة التنسيق (الشكل 2B).
- كزة الدودة بلطف ومضخة في مزيج الحقن ؛ ooctyes فصل نحو الحافة البعيدة تدل على نجاح الحقن (لتحسين التحوير أو الرنا المزدوج الجديلة التسليم ، يجب على حقن نرى موجة من التوسع في الغدد التناسلية التي لا تزال حتى يكون على مقربة من القاصي غيض).
- تغيير موضع إبرة لحقن لانخفاض الغدة التناسلية ، والحقن تكرار ؛ منذ لكن هذا التناسلية تحت الوتر سوف لا ينتشر من البويضات أن ينظر وبالتالي فهي أكثر صعوبة لتحقيق (الشكل 2C).
- دودة العادي يبحث يدل على نجاح الحقن بعد الحقن ، ينبغي ألا يكون هناك أي تلف الغدد التناسلية (جاحظ الخروج من الفرج أو انتشرت داخل تجويف الجسم).
- مكان إبرة الظهر في وضع الخمول.
- الاستعداد لانقاذ دودة.
- إضافة إلى انخفاض (0.5 ميكروليتر) من M9 العازلة على لوحة حيث يتم وضع دودة حقن.
- باستخدام بعض البكتيريا على OP50 تختار ، المس دودة مع OP50 ، وأنه ينبغي أن عصا. Wه عدم استخدام ماصة الفم.
- وضع لوحة على دودة مع المصنفة 50 ميكرولتر من البقع OP50 ، يمكن انقاذ 2-4 الديدان على لوحات من هذا القبيل.
- بعد الحقن التخزين والفرز لTransgenesis
- مخزن حقن الديدان (ف 0) في 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام ~ لوضع البيض ويكبر F 1.
- الديدان الشاشة في اليوم الرابع لتحديد النمط الظاهري (على الشاشة للبحث ، transgenesis للحيوانات المتداول معربا عن المؤسسة العامة للتقاعد ، PRL - 1 علامة المهيمنة).
- اختيار واحدة مستقلة F 1 'ق الحيوانات مع النمط الظاهري لوحظ أن لوحة المصنف الجديد وتخزينها في درجة حرارة 25 درجة مئوية ، هذه الدرجة تشجع على تشكيل خطوط ثابتة من F 1' س.
- واحد من المستقلين F 2 خطوط 1 F. فرد F 2 خطوط متشابهة معدلات انتقال التحوير. غالبا ما نحصل> 15 خطا لكل F 2 1 تحول الحيوان F.
- مخزن الأجيال اللاحقة في 25 درجة مئوية.
- معدل انتقال بكرات ثابتة لا تزال عادة بعد جيل 4 F ، وبالتالي فمن الضروري في هذا الوقت لتحديد مستوى التعبير عن التحوير الهدف (PPA - EGL - 4P : GFP) عن كل خط على حدة. قد GFP التعبير لم تكن متطابقة مع مدى انتفاذ من النمط الظاهري الأسطوانة المهيمنة.
- بعد الحقن التخزين والكشف عن الظواهر رني
- مخزن حقن الديدان (ف 0) في 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام لوضع ~ وتنمو F 1.
- شاشة F 1 الديدان في اليوم الرابع لتحديد النمط الظاهري (للكشف عن النمط الظاهري رني ضربة قاضية ، والبحث عن الظواهر توغل التي قد تترافق مع فقدان النشاط الجينات المستهدفة ، في حالتنا فقدان النمط الظاهري PPA PRL - 1).
- في تجربتنا ، يتم فقدان النمط الظاهري ضربة قاضية غير الدوارة في 97 ٪> من 2 إلى F.
4. ممثل النتائج :
ع "> 1. النتيجة Transgenesis| جلسة | حقن ف 0 | F 1 مداحل | F 2 ٪ المعدلة وراثيا | متوسط ٪ بعد انتقال F 2 |
| 1 | 60 | 2 | (السطر 1) 0 ٪ (السطر 2) 13 ٪ | NA 13 ٪ ± 10 |
| 2 | 40 | 1 * | (السطر 3) 0 ٪ | NA |
| 3 | 40 | 0 | 0 ٪ | NA |
| 4 | 40 | 1 | (السطر 4) 0 ٪ | NA |
| 5 | 20 | 0 | 0 ٪ | NA |
| 6 | 40 | 1 | (السطر 5) 26 ٪ | 22 ٪ ± 10 |
. الجدول 3 نتائج PS312 حقنوا PPA - EGL - 4P : GFP (سال أنا هضمها) ، pRL3 (الدوارة) (PST أنا المهضوم) ، وgDNA PS312 (PstI سالي وهضمها).
الشكل 3 (أ) wildtype (B ، C) A F 4 pRL3 مستقرة ؛ PPA - EGL - 4P : : خط عرض المعدلة وراثيا GFP تعبير رئيس GFP الخلايا العصبية.
2. نتيجة لتدخل الجيش الملكي النيبالي
الشكل 4. حقن الحمض النووي الريبي PRL - 1 المسوخ تظهر ضربة قاضية للتنقل كاملة "المتداول" (A) PRL - 1 - الأسطوانة كسب من وظيفة tu92 متحولة. (ب) "ترسيتها" PRL - 1 متحولة الموقف المعرض wildtype طبيعية والحركة. (C) المصبوبة PRL - 1 (القاع) كما يعد بody من PRL - 1 متحولة (أعلى). (د) يعد الجسم من 1 PRL حقن (أسفل) هو أيضا لفترة أطول من PS312 wildtype (أعلى). ولوحظ أيضا أن يعد النمط الظاهري في الجسم ، ورول 5 (sqt - 1) رني ضربة قاضية للجيم ايليجانس N2 (لا تظهر البيانات).
| لفة | غير لفة | |
| A - 1 PRL الرنا المزدوج الجديلة (200 نانوغرام / ميكروليتر) | 13 | 21 |
| B - 1 PRL الرنا المزدوج الجديلة (1000 نانوغرام / ميكروليتر) | 9 | 16 |
| مراقبة | 20 | 2 |
الجدول 4 موجز PPA PRL - 1 - حقن الرنا المزدوج الجديلة. (A) [الرنا المزدوج الجديلة] = 200 نانوغرام / ميكروليتر ، (B) [الرنا المزدوج الجديلة] = 1000 نانوغرام / ميكروليتر. P = 0.0019 و 0.041 من خلال اختبار دقيق فيشر ، واثنين من الذيل ، لحقن 200 و 1000 نانوغرام / ميكرولتر ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم العثور على P. السكان pacificus بالتعاون الوثيق مع مختلف أنواع خنفساء الجعران في جميع أنحاء العالم ، وهو نموذج الخيطية وسيطة بين الذين يعيشون بحرية والديدان الطفيلية. قوة P. pacificus باعتبارها النموذج الحي الناشئة يكمن في دمج خرائط وراثية والمادية التي تشجع على رسم الخرائط الموضعية من المسوخ معزولة عن شاشات الوراثية غير منحازة إلى الأمام (وليس فقط عن الجينات المرشحة تتميز سابقا في ايليجانس جيم) 6،10. ومع ذلك ، C. التقنيات الجينية ايليجانس غير قابلة للتحويل بسهولة إلى P. نظرا للاختلافات كبيرة في التشكل الجهاز ، تسلسل الحمض النووي الرئيسي ، وكذلك ردا على الحمض النووي pacificus الأجنبية. دراستنا الحالية يوضح بالتفصيل كيفية إدخال جينات مراسل مستقرة صفها من قبل Schlager وآخرون (5) وكيفية اسقاط نفسها متحولة الأسطوانة المهيمن رني. بروتوكول لدينا لا تفترض قبل كيلونيوتنowledge من transgenesis أو رني في C. ايليجانس.
معدل التحول F 1 المبينة في هذه الدراسة (~ 2 ٪) ومقارنة النتائج السابقة باستخدام علامة PRL - 1 في P. pacificus (2-10 ٪) 5 ، ولكن أقل من المعدل الموجود في S. البرازية (3-22 ٪) 4. لا تزال هناك إمكانات كبيرة لتحسين التكنولوجيا المعدلة وراثيا في P. pacificus. حتى باستخدام PRL - 1 (tu92) المهيمنة علامة الأسطوانة مثلي إلى استخداما رول - 6 (su1006) أليل في C. ايليجانس ، وفعالية في transgenesis P. pacificus هو أقل بكثير من تلك التي وصفها الأول لجيم ايليجانس بواسطة ميلو وزملاء - 3 ، التي يمكن من خلالها الحصول على العديد من سلالة معدلة وراثيا F 1 حقن حيوان الواحد في أيدي الخبراء. عدة عوامل قد تفسر هذا الاختلاف : (1) انخفاض عدد البويضات في طور التحرك الخلالي في P. pacificus الإناث germline (افيقد الغضب 1 في الغدد التناسلية) 8 يعكس انخفاض معدل الخلايا الجرثومية الإنقسامية الانتقال إلى الانقسام الاختزالي في P. pacificus مقارنة C. ايليجانس 11. وبالتالي ، يمكن أن يستغرق أقل من البويضات الحمض النووي الريبي وبعد كل حقنة. انخفاض حجم الحضنة الشاملة لكل خنثى في P. pacificus PS312 (~ 200) مقارنة جيم قد ايليجانس N2 (~ 300) تؤدي أيضا إلى زيادة عدد أقل من 1 F المعدلة وراثيا للحيوان الواحد حقن. (2) شرط لالحمض النووي الجيني في مزيج الحقن لنقل الحمض النووي الأجنبية من 1 إلى F F 2 قد توحي أيضا إسكات الجينات أقوى آلية المشاركة في P. من pacificus في C. ايليجانس. ومع ذلك ، P. pacificus التحوير التعبير لا يبدو أن الخضوع لإسكات الجينات المتطرفة موجودة في S. البرازية في التحوير الذي يقتصر التعبير عن الحيوانات F 1 4. نحن في الوقت الراهن توصيف التعبير عن المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P :: خطوط GFP F 6 في الحيوانات. طريقة واحدة واضحة لتحسين معدلات transgenesis هو زيادة تركيز الأسطوانة شارك في حقن علامة (حاليا 1 نانوغرام / ميكروليتر من pRL3 مقارنة 25-50 نانوغرام / ميكروليتر من pRF4 في ايليجانس جيم).
القدرة على التعامل مع وظيفة الجين على المستوى العضوي بواسطة رني وtransgenesis هي ركيزتي التكنولوجيا التي ترفع C. ايليجانس أعلاه العديد من الكائنات النموذج الأخرى. نأمل دراستنا الحالية سوف يعزز كثيرا من P. pacificus نموذج لدراسات علم الوراثة والسلوك في مجال التنمية من خلال توفير تعليمات يمكن الوصول إليها بسهولة عن transgenesis ورني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون جدا لسومر RJ وانغ X للحصول على مساعدة microinjection ، فضلا عن التعليقات الثاقبة من المراجعين المجهولين. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح SC2GM089602.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMI3000 Injection microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Tritech Research, Inc. | Narashige BC-3 Ball joint | |
| Needle Puller | Tritech Research, Inc. | Narashige PC-10 | |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Tritech Research, Inc. | Narashige MINJ-D | |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N70 | |
| pJet Cloning Jet kit | Fermentas | K1231 | |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | Fermentas | K0502 | |
| DNA Clean & Concentrator™ | Zymo Research Corp. | D4005 | |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | Invitrogen | K3500-01 & K3650-01 | |
| Difco™Agar Noble | Fisher Scientific | DF0142-15-2 | |
| Microscope cover glass (1.5 - 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | Fisher Scientific | 12-554-F | |
| Glass capillaries (filament) | A-M Systems | 615000 | |
| Paraffin Oil (Heavy) | Fisher Scientific | O122-1 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | AC20651-5000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP3581 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M80-500 |
References
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
- Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
- Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).
