Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס Published: October 16, 2011 doi: 10.3791/3270
Automatic Translation
1, 1
1Biology Department, California State University

Summary

ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות necromenic

Abstract

למרות זאת הוא סביר יותר ויותר עבור אורגניזמים מודל המתעוררים להשיג רצף הגנום לחלוטין, נוסף מעמיק פונקציה גן ומנתח ביטוי על ידי התערבות RNA ו transgenesis יציב להישאר מוגבלת מינים רבים בשל האנטומיה בפרט ביולוגיה תאית מולקולרית של האורגניזם. כך, למשל, מחוץ Caenorhabditis קבוצת כתר הכולל Caenorhabditis elegans 3, המשודר ביציבות קווי מהונדס שאינם Caenorhabditis מינים לא דווחו מערכה זו מטעה (Nematoda), למעט Strongyloides stercoralis 4 ו Pristionchus פקיפיקוס 5. כדי להקל את תפקידו המתרחב של פ פקיפיקוס במחקר של התפתחות, אבולוציה, התנהגות 6-7, נתאר כאן את השיטות הקיימות להשתמש microinjection להכנת חיות טרנסגניות ואת הגן להפיל על ידי RNAi. כמו בלוטות המין של פ פקיפיקוס הוא syncitial ומסוגלים שילוב DNA ו-RNA לתוך ביציות כאשר נמסר על ידי microinjection ישיר. שלא כמו ג elegans עם זאת, transgene ירושה יציבה ביטוי סומטי פ פקיפיקוס דורש תוספת של הדנ"א הגנומי עצמי מעוכל עם endonucleases משלים את הקצוות של transgenes היעד סמנים coinjection 5. תוספת של הדנ"א הגנומי הספק דומה הדרישה לביטוי transgene ב Strongyloides stercoralis 4 והן בתאי הנבט של C. elegans. עם זאת, לא ברור אם דרישה ספציפית של הדנ"א הגנומי שלו של החיות הוא כי פ פקיפיקוס סומה הוא יעיל מאוד השתקת שאינם מורכבים רב להעתיק את הגנים או מערכים extrachromosomal ב P. פקיפיקוס דורשים רצף גנומי להרכבה kinetochore נאות במהלך מיטוזה. ההגירה הגחון של שני חמושים (didelphic) בלוטות המין של הרמפרודיטים מסבכת עוד יותר את היכולת להזריק הן בלוטות המין של תולעים הפרט 8. אנחנו גם מדגימים את השימוש microinjection כדי מציאה מוטציה דומיננטית (הרים, tu92) על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך בלוטות המין כדי להשיג ללא גלגול 1 הצאצאים F. שלא כמו ג elegans, אבל כמו נמטודות האחרים, פ ' פקיפיקוס PS312 אינו פתוח RNAi מערכתי באמצעות האכלה השריית ולכן dsRNA חייב להיות מנוהל על ידי microinjection לתוך בלוטות המין syncitial. במחקר הנוכחי, אנו מקווים לתאר את התהליך microinjection צורך להפוך האמרגן PPA-EGL-4:: כתב ה-GFP היתוך מציאה הרים דומיננטי PRL-1 (tu92) מוטציה בפרוטוקול מידע חזותי.

Protocol

1. Transgenesis: הכנת ה-DNA

  1. סמן דומיננטי שיתוף הזרקה: pRL3 [PPA-PRL-1 (tu92)]
    הפלסמיד pRL3 הוא סמן דומיננטי שיתוף הזרקה עבור חזותית זיהוי אירועים טרנספורמציה מוצלחת. פלסמיד זה מקודד עבור אלל מוטנט דומיננטי (tu92) של הגן PPA-PRL-1 קשור קשר הדוק הגן sqt 1-קולגן ב C. elegans והופך תנועה סינוסי wildtype לתוך תנועות סיבוב עם כיוון השעון לאורך הגוף של התולעת ציר 1,5. החיה הפכה דומה מאוד סמן הבחירה הפופולרית השלטת רול-6 (su1006) המשמשים ג elegans במשך 20 השנים האחרונות.
  2. כתב יעד transgene: PPA-EGL-4P: GFP
    הגן של עניין יכול להיות מקושר transcriptionally או translationally ל-GFP קידוד רצף 9. במחקר זה, PPA-EGL-4promoter: GFP (EGL-4, חלבון קינאז תלוי cGMP) היה להשתמשד כדי לקבוע אם קטע 2 קילו במעלה הזרם של תחילת התרגום יכול להעניק ביטוי של GFP ב P. פקיפיקוס PS312. זה וקטור GFP מכיל באזור ה-GFP עם קידוד שונה
    אינטרונים ואת תכליתי PPA-RPL-23 UTR 3 "שליחות קטלנית 5 מספקים בנדיבותם ידי Xiaoyue וואנג ראלף ג'זומר (מכון מקס פלנק, Tuebingen, גרמניה, האיחוד האירופי).
  3. הדנ"א הגנומי: PS312
    תוספת של wildtype פ פקיפיקוס הדנ"א הגנומי PS312 נדרש לקבל ירושה transgene יציבה, במיוחד מהונדס F 1 חיות לצאצאים 2 ו 5. זה עדיין לא בטוח אם הדנ"א הגנומי צורות מורכבות מערכים כרומוזומלית נוספת עם שני transgenes (הסמן שיתוף הזרקת PRL-3 ו-PPA EGL-4P:: כתב ה-GFP) דומים לאלה שנצפו יציב 2 קווים F מהונדס ב ג elegans 3. עם זאת, הדרישה לקבל את הדנ"א הגנומי ו transgenes לשתף cohesi זההיש המסוכך מצביעים היווצרות חוץ כרומוזומלית מערכים מורכבים התאים לארח יכול לזהות להעברת DNA תקין (gDNA מוכן באמצעות סיגמא G1N10 קיט).
  4. ה-DNA העיכול
    אנזימי הגבלה משמשים linearize PPA-EGL-4P:: DNA-GFP וקטור לייצר המסוכך דביק תואם שיתוף הזרקת סמן pRL3 ו PS312 gDNA. מערבבים על ידי לחיצה, לא vortexing. דגירה למשך שעה אחת ב 37 ° C.
pRL3 4 מיקרוגרם
10xbuffer 10 μl
PstI (10 U / μl) 4 μl
DH 2 O ~
סך הכל: 100 μL
PPA-EGL-4P: GFP 4 מיקרוגרם
10x חיץ 10 μl
סאלי (10 U / μl) 4 μl
DH 2 O ~
סך הכל: 100 μl
gDNA PS312 10 מיקרוגרם
10x חיץ 10 μl
Pst אני וסאל אני (10 U / μl) 8 μl
DH 2 O ~
סך הכל: 100 μl

טבלה 1. תערובת של אנזים הגבלה דייג'סט.

  1. ה-DNA המשקעים הכנה
    1. הוסף נתרן אצטט 01:10 (3 מ 3 NaCOOCH pH 5.2) ונפח 2.5x של אתנול 100% על המוצר את מעוכל; להוסיף 20 ng / μl של גליקוגן לראות גלולה קלה יותר.
    2. צנטריפוגה 14,000 סל"ד במשך 15 דקות 4 ° C.
    3. למזוג supernatant ידי tipping לאט את צינור צנטריפוגות הפוך ולאחר מכן הקשה על זה על ממחטת נייר, ולוודא כי גלולה הינו מאובטח בפינה התחתונה של הצינור חופשי של אתנול.
    4. הוסף 1 מ"ל של אתנול 75%.
    5. מיד ספין בסל"ד 14,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    6. למזוג supernatant ידי לאט מפנה את הצינור צנטריפוגות הפוך ולאחר מכן הקשה על הנייר רקמה לוודא כי גלולה זה מאובטח בפינה התחתונה של הצינור חופשי של אתנול.
    7. יבש גלולה בצנטריפוגה ואקום ב 14,000 סל"ד במשך 5 דקות על 25-30 מעלות צלזיוס, עד יבש ונקי לחלוטין של אתנול.
    8. הוסף 30 μl של TE או סטרילי DH 2 O ולהשאיר לילה בשעה 4 ° C לפני זמן קצר ערבוב עם מערבולת.
    9. לוח 2 מתאר כיצד ליצור את התערובת זריקה מ-DNA כל מטוהרים להזרקה.
    10. חנות ב -20 ° C. לאחר ההפשרה את התערובת להזרקה, ספין למטה התחתית 14,000 סל"ד במשך 5 דקות כדי להיפטר חלקיקי פסולת שעלוליםלהדביק את מחט הזריקה.
חומר גנטי ריכוז
PPA-EGL-4P: GFP (סאלי) > 5 ng / μl (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI) > 1 ng / μl
gDNA PS312 (PstI + סאלי) > 60 ng / μl
DH 2 O ~
סך הכל: 30 μl

2. טבלה PPA-PRL-1 הזרקת תערובת

2. התערבות RNA: ב סינתזת RNA במבחנה כפולה תקועים

  1. השתמש ב-PCR כדי להגביר את הגן של עניין. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 "(אתר BamHI) ו RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3" (אתר PstI) שימשו כדי להגביר Frag 464 נ"ב גנומיתment (עמדה 3-466) של וקטור pRL3 המכיל את האלל PPA-PRL-1 (tu92).
  2. תקציר המוצר PCR עם BamHI ו PstI.
  3. ולקשור שבר את BamHI / PstI מתעכל pL4440 RNAi האכלה וקטור 2.
  4. המרה וקטור מוכנס לתוך תאים המוסמכת ולגדל אותם על צלחות אמפיצילין LB ​​מדיה (50 מיקרוגרם / מ"ל).
  5. בחר את וקטור מוכנס בהצלחה על ידי PCR בעזרת פריימרים T7.
  6. השתמש T7 מוקף מוצר PCR המכיל את PRL-1 הגן לעשות פעמיים תקועים RNA dsRNA) באמצעות BLOCK-IT RNAi סינתזה הערכה (Invitrogen).
  7. ריכוז dsRNA היא הטובה ביותר אם> 200 ng / μl, עד 1 מיקרוגרם / μl להזרקה.
  8. חנות ב -20 ° C. לאחר ההפשרה את התערובת להזרקה, ספין למטה התחתית 14,000 סל"ד במשך 5 דקות כדי להיפטר של חלקיקי פסולת שעלולים לסתום את המזרק.

3. Microinjection: פרוטוקול הזרקת transgenes ו / או dsRNA

  1. הזרקת מחטים
    1. הגדר את המחט Narishige חולץ (מודל #: PC-10) טמפרטורה:
      1. הפעל את הכפתור התחתון "מחמם מס '2".
      2. הפעל את "Adj מחמם מס '2". הידית עד פאנל קורא 55.0-60.0 מעלות צלזיוס במשך חוד המחט של קוני באורכים שונים.
    2. סובבו את כפתור בתחתית בחזרה "שלב 1" (מושך מחט בצעד אחד).
    3. טען מחט לתוך החדר כדי לוודא שהיא מאובטחת.
    4. לחצו על כפתור "התחל" (כפתור אדום) ולאפשר מחט להיות משך כל משקולות (זה צריך לעשות שתי מחטים זהים בכיוונים מנוגדים).
    5. הסר מחט מן החדר ולאחסן בצלחת תרבות פלסטיק במקום מאובטח על ידי פלסטלינה כדי למנוע אבק המצטבר על המחטים.
  2. הרכבה רפידות
    1. בתוך צינור 1.5 צנטריפוגות מ"ל, להפוך את פתרון 2% אגר נובל על ידי הוספת 0.02 גרם של אגר נובל ל 1 מ"ל של H 2 O. אגר ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.
    2. מערבבים ביסודיותלהמיס אגר בתוך גוש חום מוגדר כ> 88 ° C.
    3. שימוש 1 מ"ל micropipette, במקום ירידה של אגר נוזלי נובל 2% עד אמצע השקופית זכוכית (פישר, 12-544-F).
    4. שטחו ידי הצבת אחר שקופית זכוכית על גבי הירידה.
    5. חזור על "שלב Drop" עד שיש שכבה של שקופית חמש זכוכית.
    6. הסר כל שקופית זכוכית ידי הזזה מזכוכית שקופיות אחד את השני.
    7. לרדד משטח יבש אגר בשקופיות זכוכית בתנור ואקום ב 70 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עד לילה (או בטמפרטורת החדר למשך הלילה).
    8. הפוך את רפידות הזרקת מרובים לאחסן לשימוש עתידי.
  3. Microinjection לתוך בלוטות המין hermaphroditic

איור 1
באיור 1. ציור סכמטי של פ האנטומיה פקיפיקוס. התאים בעלי הגרעין ברורים בתאי הנבט הנשי (ביציות) ואת החלק מוצל אפור הוא המעי. רק אחד שחלה קדמית דיסטלי מוצגאבל לשים לב לשני בלוטות המין דיסטלי לחצות אחד את השני dorsally ליד אמצע הגוף.

איור 2
באיור 2. תמונות של microinjection. (א) קצה מחט הזריקה היא להתמקד עם הקו השמאלי של היצירה נימי שלף. על ידי נוגעות קלות את קצה המחט אל קצה, קצה מחט צריך לשבור תוך שמירה על נקודה חדה. (ב) מחדיר מחט אל תוך החלק העליון שחלה בדיוק מעל עקמומיות המעיים עבור הזריקה הראשונה. (ג) מחדיר מחט לתוך התחתון בלוטת המין ממש מתחת עקמומיות המעיים להזרקה השנייה.

    1. ודא כי בניגוד וקביעת DIC הגז הוא אידיאלי עבור הצגת בלוטות המין אנדרוגינוס.
    2. טען 1.0-2.0 μl של תערובת זריקה לתוך המחט נימי שלף.
    3. מניחים את המחט המניפולטור microinjection, מודד לחץ מיכל חנקן יש להגדיר תנאים אידיאליים (10-20 psiעבור 0.5-1 שניות).
    4. שוברים את קצה המחט על ידי נגיעה בו מעט קצה צינור נימי דק משך להציב בשקופית (תמונה 2A).
      1. מחט שקופיות מפסק: החלק הדק של נימי משך דגש על שקופיות זכוכית טיפה של שמן
    5. לאחר מחט שבורה זה יכול להיות מקום בעמדת המתנה תוך כדי לקטוף תולעת שלך לרפד את (פ 'פקיפיקוס יש חלון 5 דקות לפני שהם הזרקת יבש החוצה למות).
    6. בעזרת צלחת מלאה J4 צעירים תולעים בוגרות, לשפוך שמן פרפין מספיק (כבד), רק כדי לכסות את כל התולעים הדשא OP50 חיידקי.
    7. פיק תולעת ולמקם אותו על משטח הזריקה.
    8. מניחים את השקף זכוכית עם התולעת על המיקרוסקופ, עמדה בלוטת המין של התולעת לכיוון של המחט ואת הפות מן המחט (תרשים 2B, 2C).
    9. מנמיכים את מחט אל המיקום של התצוגה מיקרוסקופ.
    10. מקם את בלוטת המין העליון את המחט המטוס מוקד זהה (תרשים 2B).
    11. נקבו את התולעת בעדינות בתערובת משאבת הזרקה, ooctyes הפרדת לקראת קצה דיסטלי מצביעים על זריקה מוצלחת (כדי למטב transgene או מסירה dsRNA, אתה צריך לראות על זריקה גל של התרחבות אשך אשר ממשיך עד שהוא קרוב דיסטלי טיפ).
    12. שנה את מיקום המחט להזריק אל בלוטת המין התחתון הזרקה חוזרת, אולם מאז שחלה זה תחת במעיים הפצת ביציות לא יראו ועל כן קשה יותר להשיג (איור 2C).
    13. תולעת מחפש רגיל מצביע על זריקה מוצלחת לאחר ההזרקה, לא צריכה להיות שום נזק בלוטות המין (בולטות החוצה מן הנרתיק או קפץ בתוך חלל הגוף).
    14. מניחים את המחט בחזרה בעמדה סרק.
    15. הכן כדי להציל את התולעת.
    16. הוסף ירידה (0.5 μl) של חיץ M9 על כרית שבו תולעת מוזרק ממוקם.
    17. באמצעות כמה OP50 חיידקים על להרים שלך, למגע עם תולעת OP50, והוא צריך להישאר. Wהדואר לא להשתמש פיפטה בפה.
    18. מניחים את התולעת לצלחת seeded עם 50 נקודות μl של OP50, 2-4 תולעים יכולים להינצל על הצלחות כאלה.
  2. לאחר הזרקת אחסון ועבודה הקרנת עבור Transgenesis
    1. חנות מוזרק תולעים (P 0) על 20 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים ~ להטיל ביצים לגדול F 1.
    2. מסך תולעים ביום הרביעי של פנוטיפ שנבחר (למסך לחיפוש transgenesis, לבעלי חיים מתגלגל המבטא את PPA-PRL-1 סמן דומיננטי).
    3. פיק יחיד עצמאית F 1 "חיות ים עם פנוטיפ הנצפה לצלחת seeded חדשים בחנות של 25 ° C, הטמפרטורה הזו מעודדת היווצרות של שורות יציב מ 1 נ 's.
    4. F סינגל 2 מתוך עצמאית F-1 שורות. הפרט F 2 קווי תמסורת דומה יש שיעורי transgene. לעתים קרובות אנו להשיג> 15 F 2 שורות לכל בעל חיים טרנספורמציה 1 F.
    5. חנות הדורות הבאים של 25 ° C.
    6. קצב שידור של הגלילים בדרך כלל נשאר קבוע אחרי דור ה-F 4, ולכן יש צורך בשלב זה לקבוע את רמת הביטוי של transgene היעד (PPA-EGL-4P: GFP) עבור כל קו הפרט. ביטוי של GFP לא יכול לתאם עם היקף של פנוטיפ penetrance ההרים דומיננטי.
  3. לאחר הזרקת אחסון ועבודה הקרנת עבור פנוטיפים RNAi
    1. חנות מוזרק תולעים (P 0) על 20 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים ~ להניח ולגדול F 1.
    2. מסך F 1 תולעים ביום הרביעי של פנוטיפ שנבחר (למסך עבור פנוטיפ מציאה RNAi, לחפש פנוטיפים penetrant כי עשויה להיות קשורה לאובדן פעילות הגן היעד, במקרה שלנו אובדן של פנוטיפ PPA-PRL-1).
    3. מניסיוננו, פנוטיפ הלא רולר מציאה הוא איבד 97%> של ה-F 2.

4. נציג תוצאות:

p "> 1. תוצאת Transgenesis

מושב הזריקו P 0 F 1 רולרס מהונדס% F 2 % ממוצע לאחר שידור F 2
1 60 2 (קו 1) 0%
(שורה 2) 13% 		NA
13% ± 10
2 40 1 * (שורה 3) 0% NA
3 40 0 0% NA
4 40 1 (שורה 4) 0% NA
5 20 0 0% NA
6 40 1 (קו 5) 26% 22% ± 10
"תוכן> * הרים זכר שלא לחצות; NA: לא ישים

. לוח 3 תוצאות PS312 הזריקו PPA-EGL-4P: GFP (סאל אני מעוכל), pRL3 (גלגלת) (PST אני מעוכל), ו gDNA PS312 (PstI ואת סאלי מעוכל).

איור 3
איור 3 (א) wildtype (B, C) ​​יציב F 4 pRL3; PPA-EGL-4P:.: GFP קו מהונדס מראה ראש עצב ביטוי של GFP.

2. תוצאת התערבות RNA

איור 4
איור 4. RNA מוזרק PRL-1 מוטנטים להראות מציאה שלם של תנועה "מתגלגלת". (א) PRL-1 מכבש רווח של פונקציית מוטציה tu92. (ב) "הפיל" PRL-1 התערוכה מוטציה נורמלי wildtype יציבה תנועה. (ג) הזריקה PRL-1 (למטה) יש גם ב יותרody מאשר PRL-1 מוטציה (למעלה). (ד) גוף ארוך יותר מוזרק PRL-1 (למטה) הוא גם ארוך יותר PS312 wildtype (למעלה). פנוטיפ הגוף כבר נצפתה גם את רול-5 (sqt-1) מציאה RNAi של C. elegans N2 (מידע לא מוצג).

גליל אי - רול
PRL-1 dsRNA (200 ng / μl) 13 21
ב PRL-1 dsRNA (1000 ng / μl) 9 16
שליטה 20 2

לוח 4. סיכום PPA-PRL-1 dsRNA זריקות. (א) [dsRNA] = 200 ng / μl; (ב) [dsRNA] = 1000 ng / μl. P = 0.0019 לבין 0.041 ידי בדיקה מדוקדקת של פישר, שני זנב, עבור 200 ו 1000 זריקות ng / μl, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פ אוכלוסיות פקיפיקוס נמצאים בשיתוף הדוק עם מינים שונים חיפושית חיפושית ברחבי העולם הוא נמטודות מודל ביניים בין חיים חופשיים נמטודות טפיליות. כוחה של פ פקיפיקוס כאורגניזם מודל המתעוררים טמון בשילוב של מפות גנטיות הפיזי שלה כי לקדם מיפוי מיקומית של מוטציות גנטיות מבודד מסכי קדימה משוחדת (כלומר, לא רק עבור גנים מועמדים מאופיין בעבר C. elegans) 6,10. עם זאת, C. טכניקות elegans גנטית אינם ניתנים להעברה בקלות פ בשל הבדלים משמעותיים מורפולוגיה איברים, רצפי DNA העיקרי, כמו גם בתגובה דנ"א זר פקיפיקוס. המחקר הנוכחי שלנו מדגים בפירוט כיצד להציג גנים כתב יציב שתואר קודם לכן על ידי Schlager ואח' 5 ואיך להפיל את אותה מוטציה דומיננטית על ידי מכבש RNAi. פרוטוקול שלנו אינה מתיימרת kn לפניowledge של transgenesis או RNAi ב C. elegans.

1 F שינוי המחיר המוצג במחקר זה (~ 2%) ניתן להשוות תוצאות קודמות באמצעות סמן PRL-1 ב פ פקיפיקוס (20-10%) 5, אבל פחות משיעור נמצא ש stercoralis (3-22%) 4. יש עדיין פוטנציאל רב לשיפור של הטכנולוגיה מהונדס ב P. פקיפיקוס. אפילו באמצעות PRL-1 (tu92) סמן רולר דומיננטי הומולוגיים ל נפוץ רול-6 (su1006) אלל ב C. elegans, את האפקטיביות של transgenesis ב P. פקיפיקוס באופן משמעותי פחות מאלו שתוארו הראשון C. elegans ידי מלו ועמיתים לעבודה 3, בו מרובים מהונדס 1 הצאצאים F ניתן להשיג לכל חיה מוזרק בידי מומחה. מספר גורמים עשויים להסביר את ההבדל הזה: (1) מספר נמוך יותר של ביציות ב diakinesis ב P. פקיפיקוס נקבה germline (ממוצעזעם 1 לכל אשך) 8 עשוי לשקף שיעור נמוך יותר של בתאי הנבט mitotic מעבר ל המיוזה ב P. פקיפיקוס לעומת C. elegans 11. לפיכך, ביציות פחות יכול לקחת DNA ו-RNA לאחר כל הזרקה. גודל להרהר הכוללת נמוכה יותר לכל אנדרוגינוס ב P. פקיפיקוס PS312 (~ 200) ג לעומת elegans N2 (~ 300) אף עלולה להחמיר את מספר נמוך יותר של מהונדס F 1 לכל חיה מוזרק. (2) הדרישה הדנ"א הגנומי בתמהיל הזרקת להעברת דנ"א זר מן F 1 F 2 מציע ההשתקה חזק מנגנון גנטי עשוי גם להיות מעורב פ פקיפיקוס מאשר ב C. elegans. עם זאת, פ הביטוי פקיפיקוס transgene לא נראה לעבור את השתקת הגן קיצוניים נמצא ש stercoralis שבו הביטוי transgene מוגבל ל F 1 חיות 4. כרגע אנחנו המאפיינת את הביטוי של PPA-EGL-4P:: קווי GFP ב F 6 חיות. שיטה אחת פשוטה כדי לשפר את שיעורי transgenesis היא הגדלת הריכוז של הגליל שיתוף הזרקת סמן (כיום 1 ng / μl של pRL3 לעומת 25-50 ng / μl של pRF4 ב C. elegans).

היכולת לתפעל פונקציה גן ברמת האורגניזם על ידי RNAi ו transgenesis הם עמודי התווך התאום של הטכנולוגיה לרומם ג elegans מעל מודל אורגניזמים רבים אחרים. אנו מקווים כי המחקר הנוכחי שלנו יהיה מאוד לשפר את פ פקיפיקוס מודל גנטיקה מחקרים בהתפתחות ובהתנהגות על ידי מתן הוראות נגיש עבור transgenesis ו RNAi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

המחברים מודים מאוד RJ זומר ו-X וואנג לסיוע עם microinjection, כמו גם הערות תובנה מן הבודקים אנונימי. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק SC2GM089602.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMI3000 Injection microscope Leica Microsystems DMI3000
Microinjector manipulator (Direct drive) Tritech Research, Inc. Narashige BC-3 Ball joint
Needle Puller Tritech Research, Inc. Narashige PC-10
MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System Tritech Research, Inc. Narashige MINJ-D
GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N70
pJet Cloning Jet kit Fermentas K1231
GeneJET plasmid Miniprep kit Fermentas K0502
DNA Clean & Concentrator™ Zymo Research Corp. D4005
BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit Invitrogen K3500-01 & K3650-01
Difco™Agar Noble Fisher Scientific DF0142-15-2
Microscope cover glass (1.5 - 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) Fisher Scientific 12-554-F
Glass capillaries (filament) A-M Systems 615000
Paraffin Oil (Heavy) Fisher Scientific O122-1
KH2PO4 Fisher Scientific P386-500
Na2HPO4 Fisher Scientific AC20651-5000
NaCl Fisher Scientific BP3581
MgSO4 Fisher Scientific M80-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
  3. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  4. Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
  5. Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
  6. Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
  7. Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
  8. Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
  11. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).

Tags

לביולוגיה התפתחותית גיליון 56 התערבות RNA Pristionchus פקיפיקוס microinjection transgenesis, ביולוגיה התפתחותית התנהגות ביטוי גנים
RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic<em> Pristionchus פקיפיקוס</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cinkornpumin, J. K., Hong, R. L.… More

Cinkornpumin, J. K., Hong, R. L. RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus. J. Vis. Exp. (56), e3270, doi:10.3791/3270 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter