Summary
I modellorganismer kan genmodifiering manipulera genfunktioner medan RNAi kan ÖVERVÄLDIGANDE specifika mRNA transkript 1-2. Detta protokoll syftar till att illustrera de tekniker som behövs för att införa stabilt överförs DNA och övergående dubbelsträngat RNA i necromenic nematoder
Abstract
Även om det är allt överkomligt för nya modellorganismer för att få helt sekvenserade genom ytterligare fördjupad geners funktion och analyser uttryck genom RNA-interferens och stabil genmodifiering förblir begränsade i många arter på grund av särskilda anatomi och molekylär cellbiologi av organismen. Till exempel har utanför kronan gruppen Caenorhabditis som inkluderar Caenorhabditis elegans 3, stabilt överförs transgena linjerna i icke-Caenorhabditis arter som inte redovisats i denna bestickande fylum (Nematoda), med undantag för Strongyloides stercoralis 4 och Pristionchus pacificus 5. För att underlätta den växande roll P. pacificus i studien av utveckling, evolution och beteende 6-7, beskriver vi här de nuvarande metoderna att använda mikroinjektion för att göra transgena djur och genen slå ner med RNAi. Liksom gonaderna i
Protocol
1. Genmodifiering: DNA-preparation
- Dominerande co-injektion markör: pRL3 [PPA-PRL-1 (tu92)]
Den pRL3 plasmiden är en dominerande co-injektion markör för visuellt identifiera framgångsrika omvandling händelser. Denna plasmid kodar för en dominerande mutant allel (tu92) av PPA-PRL-1 genen nära samband med sqt-1 kollagen-genen i C. elegans och förvandlar wildtype sinusformade rörelseorganen i medurs vridning rörelser längs masken kropp axel 1,5. Den förvandlade djur är mycket likt det populära dominerande valet markör rol-6 (su1006) som används i C. elegans för de senaste 20 åren. - Mål reporter transgenen: PPA-EGL-4p:: GFP
En gen av intresse kan kopplas transkriptionellt eller translationally till en GFP kodning sekvens 9. I denna studie PPA-EGL-4promoter: var GFP (EGL-4, cGMP beroende proteinkinas) användning:d för att avgöra om en 2 kb fragment före starten av översättningen kan ge GFP uttryck i P. pacificus PS312. Detta GFP vektor innehåller en GFP kodande region med modifierad
introner och mångsidiga PPA-RPL-23 3 'UTR terminator 5 vänligt som Xiaoyue Wang och Ralf J. Sommer (Max-Planck-institutet, Tübingen, Tyskland, EU). - Genomisk DNA: PS312
Tillägget av wildtype P. pacificus PS312 genomiska DNA krävs för att få en stabil transgenen arv, särskilt från transgena F 1 djur till sina F 2 avkommor 5. Det är ännu inte säkert om arvsmassans DNA bildar komplex extra kromosom matriser med de två transgener (samtidig injektion markör PRL-3 och PPA-EGL-4p:: GFP reporter) liknande de som observerats i stabila F 2 transgena linjer i C. elegans 3. Men kravet har genomiska DNA och transgener att dela identiska cohesihar överhäng tyder starkt bildandet av komplexa extra kromosom arrayer värden cellerna kan känna igen för korrekt DNA-överföring (gDNA prepareras med Sigma G1N10 kit). - DNA matsmältningen
Begränsning enzymer används för att linjärisera PPA-EGL-4p:: GFP vektor-DNA och producera klibbiga överhäng kompatibel med co-injektionen markör pRL3 och PS312 gDNA. Blanda genom att knacka på, inte vortexa. Inkubera en timme vid 37 ° C.
| pRL3 | 4 mikrogram |
| 10xbuffer | 10 l |
| PstI (10 U / l) | 4 l |
| dH 2 O | ~ |
| Totalt: | 100 mikroliter |
| PPA-EGL-4p:: GFP | 4 mikrogram |
| 10x buffert | 10 l |
| Sali (10 U / l) | 4 l |
| dH 2 O | ~ |
| Totalt: | 100 l |
| gDNA PS312 | 10 mikrogram |
| 10x buffert | 10 l |
| Pst jag och Sal jag (10 U / l) | 8 l |
| dH 2 O | ~ |
| Totalt: | 100 l |
Tabell 1. Blandning för Restriktionsenzymanalys Digest.
- DNA nederbörd och förberedelse
- Lägg 1:10 natriumacetat (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) och 2,5 gånger volymen av 100% etanol till att smälta produkten, lägga till 20 ng / l av glykogen för att se pellets lättare.
- Centrifugera vid 14.000 rpm i 15 minuter vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten genom Tipping långsamt centrifugröret upp och ned och sedan trycka på den på ett papper och se till att pelleten är säker på nedre hörnet av röret och fri från etanol.
- Tillsätt 1 ml 75% etanol.
- Omedelbart snurra på 14.000 rpm i 5 minuter vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten genom att långsamt tippa centrifugröret upp och ned och sedan trycka på den på ett papper och se till att pelleten det säkert i nedre hörnet av röret och fri från etanol.
- Torr pellets i vakuum centrifugera vid 14.000 rpm i 5 minuter vid 25-30 ° C tills den är torr och helt fri från etanol.
- Tillsätt 30 ìl av TE eller steril dH 2 O och lämna över natten vid 4 ° C innan blandas snabbt med en virvel.
- Tabell 2 beskriver hur du skapar en injektion blandningen från varje renat DNA för injektion.
- Förvara vid -20 ° C. Efter upptining blandningen för injektion, spinn ner röret vid 14.000 rpm i 5 minuter för att få bort skräp partiklar som kantäppa injektionsnålen.
| Genetiskt material | Koncentration |
| PPA-EGL-4p:: GFP (Sali) | > 5 ng / l (0.1-10ng/μl) |
| pRL3 (PstI) | > 1 ng / l |
| gDNA PS312 (PstI + Sali) | > 60 ng / l |
| dH 2 O | ~ |
| Totalt: | 30 l |
Tabell 2. PPA-PRL-1 injektion blandning
2. RNA-interferens: In vitro dubbelsträngat RNA syntesen
- Använd PCR att förstärka genen av intresse. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 "(BamHI site) och RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3" (PstI sida) användes för att förstärka ett 464 bp genomisk fragning (läge 3-466) från pRL3 vektor som innehåller PPA-PRL-1 (tu92) allel.
- Digest PCR-produkten med BamHI och PstI.
- Ligate fragmentet till BamHI / PstI smälta pL4440 RNAi utfodring vektor 2.
- Omvandla den införda vektorns till behöriga celler och odla dem på Ampicillin LB medier plattor (50 mikrogram / ml).
- Välj den framgångsrikt införda vektorns med PCR med T7 grundfärger.
- Använd T7 flankeras PCR-produkten innehåller PRL-1-genen att göra dubbelsträngat RNA dsRNA) med BLOCK-IT RNAi syntes kit (Invitrogen).
- Den dsRNA koncentration är bäst om> 200 ng / l, upp till 1 mikrogram / l för injektion.
- Förvara vid -20 ° C. Efter upptining blandningen för injektion, spinn ner röret vid 14.000 rpm i 5 minuter för att bli av med skräp partiklar som kan täppa igen kanylen.
3. Mikroinjektion: protokoll för injektion av transgener och / eller dsRNA
- Injektionsnålar
- Ställ Narishige nålen avdragare (modell #: PC-10) temperatur:
- Vrid ner ratten till "No.2 Värmare."
- Vrid "No.2 Värmare Adj." ratten tills panelen läser 55,0-60,0 ° C för koniska nålspetsen av varierande längd.
- Vrid ner ratten till "Steg 1" (Drar nål i ett steg).
- Ladda nålen i kammaren och kontrollera att den är säker.
- Tryck på "Start"-knappen (röd knapp) och låt nålen dras med alla vikter (detta bör göra två identiska nålar i motsatt riktning).
- Ta bort nålen från kammaren och förvara i en plast odlingsplatta på plats genom Play-Doh att förhindra att damm samlas på nålar.
- Ställ Narishige nålen avdragare (modell #: PC-10) temperatur:
- Montering Pads
- I ett 1,5 ml centrifugrör, göra en 2% Noble agar-lösning genom att tillsätta 0,02 g Noble Agar till 1 ml H 2 O. Den agar kan lagras vid 4 ° C i upp till ett år.
- Blanda väl ochsmälta agar i ett värmeblock satt till> 88 ° C.
- Använda en 1 ml mikropipett, placera en droppe vätska 2% Noble Agar till mitten av glasskiva (Fisher, 12-544-F).
- Platta genom att placera en annan glasskiva ovanpå släpp.
- Upprepa "Drop Step" tills det finns ett lager av fem glas bild.
- Ta bort varje glasskiva genom att skjuta glaset glider ifrån varandra.
- Torr plattar agar pad på glas bilder i vakuumugn vid 70 ° C i 4 timmar eller över natten (eller i rumstemperatur över natten).
- Göra flera Injection kuddar och spara för framtida bruk.
- Mikroinjektion till hermafroditer gonaderna
Figur 1. En schematisk ritning av P. pacificus anatomi. Den tydliga celler med kärnor är kvinnliga könsceller (äggceller) och den grå skuggade delen är tarmen. Endast en distala främre gonad visasmen märker de två distala könskörtlarna korsar varandra dorsalt nära mitten av kroppen.
Figur 2. Bilder av mikroinjektion. (A) Injektionen nålspetsen är i fokus med längst till höger rad drog kapillär pjäs. Genom att lätt vidröra nålspetsen för att kanten ska nålspetsen paus och ändå behålla en vass spets. (B) Nålen sätts in i toppen gonad precis ovanför tarmen krökning för den första injektionen. (C) Nålen sätts in i botten gonad strax under tarmen krökning för den andra injektionen.
- Se till att kontrasten och DIC klippning inställning är idealisk för att titta på hermafrodit gonaderna.
- Ladda 1,0-2,0 l för injektion smeten i drog kapillär nålen.
- Placera nålen i mikroinjektion manipulatorn, tryckmätare av kvävet tanken ska vara inställd på idealiska förhållanden (10-20 psiför 0,5-1 sek).
- Bryt nålspetsen genom att röra den något till kanten av ett tunt drog kapillärrör placeras i en bild (Figur 2A).
- Nål brytare bild: den tunnaste delen av en drog kapillär placeras på en glasplatta i en droppe olja
- När nålen är trasig kan det finnas plats i ett viloläge när du hämtar din mask till pad (P. pacificus har en 5 minuter fönster för injektion innan de torkar ut och dör).
- Med hjälp av en tallrik full med J4-unga vuxna maskar, häll paraffinolja (tunga) att bara täcka alla maskar i OP50 bakteriell gräsmatta.
- Välj en mask och placera den på injektionen pad.
- Placera glasskiva med masken på mikroskopet, placera maskens gonad i riktning nålen och vulvan bort från nålen (Figur 2B, 2C).
- Sänk nålen in i position mikroskop utsikten.
- Placera toppen gonad och nålen i samma fokalplanet (Figur 2B).
- Peta masken försiktigt och pumpa i injektion blandningen, ooctyes skiljer mot den distala änden indikerar en lyckad injektion (För att optimera transgenen eller dsRNA leverans bör du efter injektionen se en våg av expansion i gonad som fortsätter tills det är nära till distala tips).
- Flytta nålen för att injicera den lägre gonad och upprepa injektion, men eftersom detta gonad är under tarmen spridningen av ägg kommer inte att synas och är därmed svårare att uppnå (Figur 2C).
- Normalt letar mask indikerar en lyckad injektion efter injektionen, det ska inte finnas några skadade gonader (sticker ut från vulva eller dök inuti kroppen hålighet).
- Placera nålen tillbaka i startläge.
- Förbered dig på att rädda masken.
- Lägg en droppe (0,5 l) av M9 buffert på plattan där injicerade masken är placerad.
- Använda några OP50 bakterier på din pick trycker masken med OP50, och det bör hålla. We Använd inte mun pipett.
- Placera masken på tallriken ympats med 50 l fläckar av OP50, kan 2-4 maskar räddas på sådana plattor.
- Efter injektion Lagring & Screening för genmodifiering
- Store injicerade maskar (P 0) vid 20 ° C ~ 4 dagar för att lägga ägg och växa upp F 1.
- Screen maskar på den fjärde dagen för utvalda fenotyp (för att screena för genmodifiering, sök rullande djur uttrycka PPA-PRL-1 dominerande markör).
- Plocka enda oberoende F 1: s djur med den observerade fenotypen för nya seedade tallrik och förvara vid 25 ° C, denna temperatur uppmuntrar bildandet av stabila linjer från F 1 's.
- Singel F 2 från fristående F 1 linjer. Individuella F 2 rader har liknande priser transgen överföring. Vi får ofta> 15 F 2 rader per omvandlas F 1 djur.
- Förvara senare generationer vid 25 ° C.
- Den överföringshastighet på rullarna är vanligen konstant efter att F 4 generationen, därför är det nödvändigt just nu att bestämma uttrycket målnivån transgenen (PPA-EGL-4p:: GFP) för varje enskild linje. GFP uttryck kan inte korrelerad till omfattningen av penetrans av de dominerande rullen fenotyp.
- Efter injektion Lagring & Screening för RNAi fenotyper
- Store injicerade maskar (P 0) vid 20 ° C ~ 4 dagar att lägga och växa F 1.
- Skärm F 1 maskar på den fjärde dagen för utvalda fenotyp (för att screena för RNAi ÖVERVÄLDIGANDE fenotyp, sök efter penetrantprovning fenotyper som kan förknippas med förlust av målgenen aktivitet, i vårt fall till förlust av PPA-PRL-1 fenotyp).
- Enligt vår erfarenhet är den icke-rullen ÖVERVÄLDIGANDE fenotyp vilse i> 97% av F 2.
4. Representativa resultat:
p "> 1. Resultat av genmodifiering| Session | Injected P 0 | F 1 Rollers | % Transgena F 2 | Genomsnittlig% transmission efter F 2 |
| 1 | 60 | 2 | (Linje 1) 0% (Linje 2) 13% | NA 13% ± 10 |
| 2 | 40 | 1 * | (Linje 3) 0% | NA |
| 3 | 40 | 0 | 0% | NA |
| 4 | 40 | 1 | (Linje 4) 0% | NA |
| 5 | 20 | 0 | 0% | NA |
| 6 | 40 | 1 | (Linje 5) 26% | 22% ± 10 |
. Tabell 3 Resultat av injicerade PS312 med PPA-EGL-4p:: GFP (Sal jag smält), pRL3 (rulle) (Pst jag smält) och gDNA PS312 (PstI och Sali smält).
Figur 3 (A) wildtype (B, C) En stabil F 4 pRL3, PPA-EGL-4p.:: GFP transgen linje visar huvud neuron GFP uttryck.
2. Resultat av RNA-interferens
Figur 4. RNA injiceras PRL-1 mutanter Visa hela ÖVERVÄLDIGANDE av "rullande" förflyttning. (A) PRL-1 rulle vinst-of-funktion mutant tu92. (B) "knockade" PRL-1 mutant uppvisar normala wildtype kroppshållning och rörelseförmåga. (C) som injiceras PRL-1 (nederst) har också längre bODY än PRL-1 mutant (överst). (D) längre kropp injiceras PRL-1 (botten) är också längre än wildtype PS312 (överst). Ju längre kroppen fenotyp observerades också i den rol-5 (sqt-1) RNAi ÖVERVÄLDIGANDE av C. elegans N2 (data visas inte).
| rulla | icke-rulle | |
| En PRL-1 dsRNA (200 ng / l) | 13 | 21 |
| B PRL-1 dsRNA (1000 ng / l) | 9 | 16 |
| kontroll | 20 | 2 |
Tabell 4. Sammanfattning av PPA-PRL-1 dsRNA injektioner. (A) [dsRNA] = 200 ng / l, (B) [dsRNA] = 1000 ng / l. P = 0,0019 och 0,041 med Fishers exakta test, tvådelade, för 200 och 1000 ng / l injektionsvätskor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
P. pacificus populationer finns i nära samarbete med olika arter skarabé skalbagge över hela världen och är en modell nematod mellanting mellan fria levande och parasitiska nematoder. Styrkan i P. pacificus som en ny modell organism låg i integrationen av genetiska och fysiska kartor som främjar positionella kartläggning av mutanter isolerade från objektiva framåt genetiska skärmar (dvs. inte bara för kandidatgener tidigare karaktäriserat i C. elegans) 6,10. Men C. elegans genteknik inte är lätt överförbara till P. pacificus grund av de betydande skillnaderna i orgel morfologi, primär DNA-sekvenser, samt svar på främmande DNA. Vår aktuella studien visar i detalj hur man införa stabila reporter gener som tidigare beskrivits av Schlager m.fl. 5 och hur man slå ner samma dominerande rullen mutant av RNAi. Vårt protokoll inte förutsätter inte tidigare kNowledge av genmodifiering eller RNAi i C. elegans.
F 1-omvandling som visades i denna studie (~ 2%) är jämförbar med tidigare resultat med hjälp av PRL-1 markör i P. pacificus (2-10%) 5, men mindre än den som finns i S. stercoralis (3-22%) 4. Det finns fortfarande stor potential för förbättringar av transgen teknik i P. pacificus. Även med hjälp av PRL-1 (tu92) dominerande roller markör homolog till vanliga rol-6 (su1006) allelen i C. elegans, effektiviteten av genmodifiering i P. pacificus är betydligt mindre än vad som först beskrevs för C. elegans av Mello och medarbetare 3, där flera transgena F 1 avkomma kan erhållas per injiceras djur expert händer. Flera faktorer kan förklara denna skillnad: (1) Det minskade antalet oocyter i diakinesis i P. pacificus kvinnliga könsceller (AVEraseri 1 per gonad) 8 kan återspegla en lägre celler mitotiska könsceller övergår till meios i P. pacificus jämfört med C. elegans 11. Därför kan färre oocyter ta upp DNA och RNA efter varje injektion. Den totala lägre ruvar storlek per hermafrodit i P. pacificus PS312 (~ 200) jämfört med C. elegans N2 (~ 300) kan också förvärra det lägre antal av de transgena F 1 per injiceras djur. (2) Kravet på genomisk DNA i injektion mix för överföring av främmande DNA från F 1 och F 2 tyder på en starkare geners uttryck mekanism också kan vara inblandade i P. pacificus än i C. elegans. Ändå P. pacificus transgens uttryck tycks inte genomgå extrema geners uttryck som finns i S. stercoralis där transgens uttryck är begränsad till F 1 djur 4. Vi är för närvarande kännetecknar ett uttryck för PPA-EGL-4p:: GFP linjer i F 6 djur. En enkel metod för att förbättra andelen genmodifiering är att öka koncentrationen av rullen co-injektion markör (för närvarande 1 ng / l för pRL3 jämfört med 25-50 ng / l för pRF4 i C. elegans).
Förmågan att manipulera geners funktion i organismens nivå av RNAi och genmodifiering är de båda pelarna teknik som höjer C. elegans över många andra modellorganismer. Vi hoppas att vår nuvarande studie i hög grad kommer att förbättra P. pacificus modell för genetik studier i utveckling och beteende genom att erbjuda lättillgängliga instruktioner för genmodifiering och RNAi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna är mycket tacksamma till RJ Sommer och X Wang för hjälp med mikroinjektion, samt kommentarer insiktsfulla från den anonyma granskare. Detta arbete stöds av NIH bidrag SC2GM089602.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMI3000 Injection microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Tritech Research, Inc. | Narashige BC-3 Ball joint | |
| Needle Puller | Tritech Research, Inc. | Narashige PC-10 | |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Tritech Research, Inc. | Narashige MINJ-D | |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N70 | |
| pJet Cloning Jet kit | Fermentas | K1231 | |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | Fermentas | K0502 | |
| DNA Clean & Concentrator™ | Zymo Research Corp. | D4005 | |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | Invitrogen | K3500-01 & K3650-01 | |
| Difco™Agar Noble | Fisher Scientific | DF0142-15-2 | |
| Microscope cover glass (1.5 - 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | Fisher Scientific | 12-554-F | |
| Glass capillaries (filament) | A-M Systems | 615000 | |
| Paraffin Oil (Heavy) | Fisher Scientific | O122-1 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | AC20651-5000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP3581 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M80-500 |
References
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
- Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
- Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).
