Summary
我们已经建立了诱导多能干人类胚胎干细胞与小分子物质，使推导的大量供应人类神经祖细胞和神经细胞类型，在发展中国家中枢神经系统神经修复定义的条件下保持直接的神经母细胞的协议。
Abstract
有一个大的需要尚未得到满足的临床适合人类神经细胞修复或再生受损的中枢神经系统（CNS）的结构和电路在今天的医疗保健行业的源。细胞疗法具有很大的承诺，以挽回失去的神经组织和中枢神经系统疾病的功能。但是，基于对中枢神经源性神经干细胞的细胞疗法遇到供应的限制和困难，在临床上使用，由于他们的文化和失败的可塑性有限扩张后的广泛传代1-3能力。尽管取得了一些有益的结果，出现中枢神经系统派生的人类神经干细胞（hNSCs）通过生产的营养和神经保护分子施加其治疗效果，主要是由非神经细胞的后代救援的内源性细胞1-3。另外，多能干的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）毫无顾忌治愈supplyin广泛的神经系统疾病克人类在开发中枢神经系统再生1,4-7的神经细胞类型的多样性。然而，如何进行渠道广泛的分化潜能的多能胚胎干细胞是有效的和可预见的所需的表型的发育研究和临床翻译的一个重大挑战。依靠传统的方法多通过自发的胚层分化的多能干细胞系的倾向，导致效率低下和不可控的谱系承诺，往往是由表型异质性和不稳定性，因此，一个高风险的致瘤性7-10。此外，未定义外国/动物生物补充和/或通常被用于隔离，扩建，和人类胚胎干细胞分化的馈线可直接利用等专门的细胞移植患者问题 11-13 。为了克服这些障碍，我们已经解决了一个定义的文化系统中的元素的必要和足够为sustaining外胚层的胚胎干细胞pluripotence，作为临床适合人类胚胎干细胞的新的De Novo推导的平台，有效地指导临床相关的谱系对小分子14（请在图中看到的示意图。1）这种人类胚胎干细胞均匀。维甲酸（RA）不会诱发1，14馈线保持未分化的人类胚胎干细胞神经分化。小鼠胚胎干细胞不同，治疗胚胎干细胞分化的胚状体（EBS）仅略有增加产量低的神经元1，14，15 。然而，各种小分子和生长因子的筛选后，我们发现，这些规定的条件提供足够维甲酸（RA）诱导，进一步发展到在人类神经祖细胞和神经元产生的神经母细胞的多能胚胎干细胞的神经外胚层规范直接开发高效率的中枢神经系统（ 图2） 。我们定义为神经诱导条件多能胚胎干细胞不干预多系胚体阶段，使控制大量供应了整个人类神经细胞的发育阶段的细胞为基础的疗法的频谱效率的推导，直接从爆炸。
Protocol
1。解决方案和媒体准备
- 明胶涂层解决方案：0.1％（W / V），蒸压在DDH 2 O的明胶和储存于4 ° C。
- 基质胶涂层解决方案。联合解决方案：缓慢解冻基质胶（10毫升）于4 ° C过夜，加10毫升冰冷的DMEM或DMEM/F12，拌匀等分1毫升/管消毒的组织文化引擎盖底下，储存在-20 ° C.工作液：缓慢解冻1毫升基质胶分装在4 ° C 1-2小时，转移到14毫升冷冻的DMEM或DMEM/F12，拌匀涂装前消毒的组织文化引擎盖下方。
- 人层粘连蛋白涂层解决方案：稀释1毫升人类层粘连蛋白溶液（0.5毫克/毫升的Tris缓冲盐，储存在-80℃，在4 ° C缓慢解冻1-2小时），用冰冷的DMEM或DMEM/F12到12.5毫升工作液（40微克/毫升）消毒的组织文化引擎盖下方紧接涂层。
- 生长因子库存解决方案（500 - 1000X）：溶解在10微克生长因子/ ml的消毒缓冲（0.5％BSA，1.0毫米的数码地面电视，10％甘油，1XPBS）和存储50-100μL/管分装在-80 ° C
- 全反式维甲酸溶液（1000X）：10 -80毫米，分装店在DMSO ° C。
- HESC媒体的DMEM/F12或Ko - DMEM（80％），KO血清替代（20％），L -丙氨酰- L -谷氨酰胺和L -谷氨酰胺（2毫米），纪念不必要的氨基酸（MNAA 1X），并β-巯基乙醇（100微米），过滤和储存于4 ° C，使用前20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子的补充。或更换“击倒（KO）的血清替代品”的DMEM/F12或KO - DMEM（100％），L -丙氨酰- L - GLN或L -谷氨酰胺（2毫米），MNAA（1X），纪念必不可少的定义组件：氨基酸（MEAA 1X），和β-巯基乙醇（100μM），过滤和储存在4 ° C，碱性成纤维细胞生长因子（20毫微克/毫升），人胰岛素（20微克/毫升），抗坏血酸（50微克/为辅毫升），人类激活素A（50毫微克/毫升），人血白蛋白/ Albumax（10毫克/毫升），和人转（8微克/毫升），使用前。
- 国科会媒体：DMEM/F12（100％），N - 2个supplemeNT（1X），肝素（8微克/毫升）。
2。板的涂层
- 涂层板明胶：添加2.5毫升/明胶溶液6孔板，在37 ° C培养箱孵育过夜。
- 涂层板与层粘连蛋白：寒意明胶涂层钢板和删除明胶，添加2.5毫升/良好的基质胶或人类的层粘连蛋白涂层工作方案预冷糊化6孔板孵育在4 ° C过夜。
3。在规定条件下未分化的人类胚胎干细胞的传代和播种
- 允许人类胚胎干细胞菌落生长到5-7天左右，并采取胚胎干细胞培养板，解剖显微镜（剖析阶段预温至37 ° C）下方解剖消毒罩。
- 选择被分裂的胚胎干细胞菌落。形态上，这些殖民地应该有定义的边缘联合国> 75％，未分化的人类胚胎干细胞（小型紧凑细胞），通常稍不透明的（不是白堆砌的细胞，没有明确的分化细胞）derneath解剖显微镜。小心地勾勒出选定的殖民地和删除分化成纤维细胞层周围的殖民地和所有有区别的部分（如果任何殖民地）与P2的无菌枪头边缘拉玻璃毛细管。 （请注意，多能胚胎干细胞是在瞬态阶段，经历即使在最佳条件下自发分化，虽然首选，它的难以细胞确定论文100％无差别解剖显微镜下，> 75％的未分化是通常的传递点考虑。“分化的细胞通常不会种子和持续增长，在传代过程中被淘汰）
- 取下吸浮动分离分化的细胞含有的旧媒体。人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子），一次洗干净。加入3毫升/以及含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子的新鲜胚胎干细胞媒体。
- 切成小块的未分化的胚胎干细胞菌落，用无菌枪头或拉玻璃毛细管和分离。
- 池媒体中含有50毫升的锥形管分离的殖民地拼凑。洗板一次1毫升/人类胚胎干细胞以及媒体含有20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子和池一起。
- 吸新鲜的涂层板的基质胶或人类的层粘连蛋白溶液。分装4毫升/包含殖民地件以及人类胚胎干细胞媒体6孔板。轻轻板转移到孵化器，无晃动，让殖民地件的种子没有令人不安的气氛中5％的CO 2，饱和湿度37℃培养箱过夜。
4。文化系统定义维甲酸诱导下的人类胚胎干细胞神经
- 在播种后第3天，从每个板块以及删除最旧的媒体和留下足够的媒体，让人类胚胎干细胞的殖民地被淹没（决不允许人类胚胎干细胞向干出）。更换4毫升/新鲜胚胎干细胞含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和10微米维甲酸的媒体。
- 替换旧媒体与新鲜胚胎干细胞含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和媒体10μM维甲酸隔日，并让神经诱导人类胚胎干细胞的菌落长到7或8天。殖民地内的所有细胞将发生大分化的细胞，继续繁殖的形态变化。殖民地的大小会增加，以涵盖7天或8板，细胞就会开始堆积在一些地区的殖民地。
5。悬浮培养持续神经元分化
- 以人类胚胎干细胞培养板解剖显微镜消毒罩下面剖析（剖析阶段预温至37 ° C）。小心地勾勒出殖民地和成纤维细胞层周围的殖民地（分化的细胞迁移的殖民地）与P2的无菌枪头边缘删除或拉玻璃毛细管。
- 取下吸浮动分离的成纤维细胞中含有的旧媒体。人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子），一次洗干净。加入3毫升/以及新鲜的人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子）。
- 剪下的神经- Induced人类胚胎干细胞成小块殖民地，并用无菌枪头分离或拉玻璃毛细管。
- 池媒体中含有50毫升的锥形管分离的殖民地拼凑。洗板一次1毫升/以及人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子）和汇集。
- 分装4毫升/无血清胚胎干细胞媒体殖民地件含有6以及超低附件板和孵化在37 °彗星培养箱允许浮动（神经母细胞）细胞集群，形成4-5天。
6。胶粘剂文化中的神经细胞表型成熟
- 池媒体浮动神经母细胞含有50毫升的锥形管。在5分钟1400转的离心机。吸，你可以旧媒体和含血管内皮生长因子（20毫微克/毫升），NT - 3（10毫微克/毫升），并BDNF（10纳克/毫升），加等量新鲜国科会媒体。
- 移液器上下混合浮动的神经母细胞和分装4毫升/ 6孔板。也可以本身的神经母细胞在一个层粘连蛋白/胶原（基质胶）或人类的层粘连蛋白聚合的三维矩阵含有血管内皮生长因子（20毫微克/毫升），NT - 3（10毫微克/毫升）和BDNF（10毫微克/毫升）在无血清的国科会媒体eded 。板块转移到了37 °彗星培养箱，让神经母细胞附加过夜。
- 更换NSC媒体含有血管内皮生长因子（20毫微克/毫升），NT - 3（10毫微克/毫升），和BDNF（10毫微克/毫升），隔日。含突起的神经元细胞和色素细胞的广泛的网络将随着时间的数字不断培育和增加2个星期内开始出现，并可以持续3个月以上。
7。代表性的成果：
维甲酸（RA）呈现足以吸引从多能性维持在定义文化系统过渡的人类胚胎干细胞向神经外胚层表型（ 图 2A）独家。 RA未分化的人类胚胎干细胞的暴露后，殖民地内的所有细胞进行形态学变化- 4月，大分化的细胞停止表达多能性相关的标记，并开始表达神经外胚层相关的各种标志物，如HNK1，AP2，和TrkC（ 图2B） 。这些大分化的细胞会继续繁殖和殖民地将扩大规模，进行自发地表达早期神经元的标记β- III -微管蛋白（ 图 2B ）。更加成熟的神经元标记MAP - 2细胞越积越多（ 图 2B）菌落地区将开始出现。与外观的神经外胚层细胞和神经细胞的分化重合，神经元特异性转录因子NURR1，多巴胺能神经元分化和激活的酪氨酸羟化酶（TH） 基因 16牵连，将转运到细胞核内（ 图2B） 。 RA的治疗的胚胎干细胞分离后，将形成漂浮在悬浮邪教的细胞簇（神经母细胞）URE继续进行神经分化过程中。碱性成纤维细胞生长因子去除后允许附加到一个组织培养板或在层粘蛋白/胶原聚合3维矩阵接种于无血清定义介质，β三，微管蛋白和地图- 2表达，突起的神经母细胞后，含细胞和色素细胞就会开始出现大幅增加，自发的多系分化的人类胚胎干细胞治疗不超过同一时期相比，在效率，并可以持续超过3个月（图2C）。
图1控制专门为特定的临床相关的宗族提供简单的小分子的高效诱导人类多能干细胞的示意图。
图2
Discussion
的发育研究和临床翻译的重大挑战之一是如何进行渠道广泛的分化潜能的多能干的人类干细胞所需的表型，高效和可预见的的。虽然这种细胞可以自发分化成胚层细胞在体外通过多血统的聚合阶段，只有一小部分细胞追求一个给定的血统 1,4 。在这些胚胎干细胞衍生的聚合，同时出现了大相径庭的不受欢迎的可能驻留在三个胚层的细胞类型的大量经常出现不仅效率低，所需的表型，但不可控和不可靠的。虽然心脏和神经系已在以前的报告中得出的，但是，在通过胚层诱导多能干细胞的致瘤性的高风险的专门细胞效率低下以下transplantatioN有阻碍进一步的临床翻译。
人类胚胎干细胞线最初是根据共培养保持增长被捕的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）4 。几个人类馈线，馈线，化学制定文化系统已发展为11-13人胚胎干细胞，虽然必要的，足以维持人类多能干细胞的自我更新的元素仍然没有得到解决。这些外源性饲养层细胞和生物试剂，有助于保持未分化的人类胚胎干细胞的长期稳定增长，而面具，多能干细胞的能力，以应对发育信号。保持在未分化的人类胚胎干细胞定义的生物制剂无文化系统，让忠实的扩张和可控性的直接分化是其治疗的效用和潜在的关键因素之一。类风湿性关节炎是不够的诱导未分化的人类胚胎干细胞神经分化的维持根据以前报道的康迪特含有外源性饲养层细胞的离子。虽然神经谱系出现在人类胚胎干细胞分化的相对早期阶段，与RA治疗的胚胎干细胞分化的多系的聚合（胚体）仅略有增加产量低的神经元1， 14，15。为了实现统一的一个特定的血统的人类多能干细胞的转换，我们雇用了一个定义文化系统有能力投保未分化的人类胚胎干细胞的增殖完全确定条件，以及控制多能胚胎干细胞的有效诱导到一个特定的临床相关的谱系提供简单的小分子（ 图1，图2）。在人类中枢神经系统的发展，未来的研究将揭示遗传和表观遗传控制分子，作为替代品，这可能为人类胚胎干细胞多能性的命运的小分子介导的直接控制和调制方式时所产生再生疗法的临床相关的谱系。如果没有治疗类风湿性关节炎，1-5％的人类胚胎干细胞将发生自发分化成神经元1，14，15。 RA的治疗，我们已经能够产生大于95％的胚胎神经祖细胞和神经细胞从人类胚胎干细胞保持在一个过程，可能会模仿人类的胚胎发育14下一个定义文化。近日，已知的神经命运决定基因已被用于transdifferentiate成人神经祖细胞和神经元的低效率0.5-8％，17，18的小鼠成纤维细胞。不过，体细胞重新编程历史上一直与基因表达异常加速衰老和受损的治疗公用事业 19-21 。最后，我们在这里建立的协议是从内细胞团（ICM）或人类囊胚4外胚层衍生的多能胚胎干细胞，可能并不适用于其他的多能干细胞，包括动物起源的胚胎干细胞，胚胎干细胞从早期的桑椹胚的（八细胞）胚胎22，artificially重新编程的细胞23 。
Disclosures
作者声明竞争的利益。 XHP是Xcelthera创始人。 XHP和余仁生有关人类胚胎干细胞的知识产权。
Acknowledgments
XHP一直支持由国家卫生研究院（NIH）国家老龄问题研究所（NIHK01AG024496）和尤尼斯肯尼施莱佛国立儿童健康和人类发展研究所（NIHR21HD056530）的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma-Aldrich | L6274 | |
| all-trans-Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution(MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech Inc | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech Inc | 120-14E | |
| Human BDNF | PeproTech Inc | AF-450-02 | |
| Human VEGF | PeproTech Inc | AF-100-20 | |
| Human NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H5284 | |
| N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
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