Summary
Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.
Abstract
Die Maus Herz ist ein beliebtes Modell für Herz-Kreislauf-Studien aufgrund der Existenz von Low-Cost-Technologie für die Gentechnik in dieser Spezies. Herz-Kreislauf-physiologische Phänotypisierung der Maus Herz kann leicht getan werden mittels Fluoreszenz-Bildgebung unter Einsatz verschiedener Sonden für transmembrane Potential (V m), Calcium-Transienten (CAT), und andere Parameter. Elektromechanische Kopplung wird durch Aktionspotential und intrazellulären Calcium-Dynamik geprägt, daher ist es äußerst wichtig, sowohl V m und CAT gleichzeitig Karte von der gleichen Stelle auf das Herz 1-4. Gleichzeitige optische Abbildung von Langendorff perfundierten Mäuseherzen hat das Potenzial, Mechanismen Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen, Stoffwechselerkrankungen und andere Herzkrankheiten aufzuklären. Visualisierung der Aktivierung können Leitgeschwindigkeit, die Dauer des Aktionspotentials und andere Parameter bei einer Vielzahl von Websites, die nicht von zellulärer Ebene Untersuchung erreicht werden, sondern ist auch durch optische Abbildung 1,5,6 gelöst. In diesem Papier stellen wir die Instrumentierung Setup und experimentellen Bedingungen für die simultane optische Abbildung von V m und Katze in Mäuseherzen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit state-of-the-art CMOS Imaging-Technologie. Konsequente optische Aufnahmen mit dieser Methode erhaltenen verdeutlichen, dass die simultane optische Abbildung von Langendorff perfundierten Mäuseherzen ist sowohl machbar als auch zuverlässig.
Protocol
1. Erweiterte Zubereitung der Stammlösungen
- Bereiten Sie zwei Stammlösungen von Tyrode-Lösung (16x) im Voraus in deionisiertem Wasser und lagern Sie sie bei 4 ° C:
- Lager I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ));
- Lager II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
- Stammlösungen von Fluoreszenzfarbstoffen. Um zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen, speichern wir 30 ul Aliquots der beiden Farbstoffe bei -20 ° C, was ausreicht für ein Experiment:
- Voltage-sensitiven Farbstoff RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) Stammlösung, 1,25 mg / ml-Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma, St. Louis, MO);
- Calcium-Indikator Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) Stammlösung 1 mg / ml-Lösung in DMSO.
- Bereiten Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin Stammlösung (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / ml-Lösung in DMSO) im Voraus und speichern Sie die gelösten blebbistatin bei 4 ° C.
2. Bereiten Perfusionslösungen und experimentelle Setup 7
- Frisch vorzubereiten 2L Tyrode-Lösung (128.2mM NaCl, 1,3 mm CaCl 2 (2H 2 O), 4,7 mm KCl, 1,05 mm MgCl 2 (6H 2 O), 1,19 mm NaH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 11,1 mm D-Glucose in VE-Wasser, pH = 7,35 ± 0,05). Wenn Stammlösung verwendet wird, um 2L von Tyrode-Lösung (ausreichend für ein Experiment) nehmen 1750 ml VE-Wasser und mischen in 125 ml Lager I, 125 mL Lager II und 4g Glukose.
- Schalten Sie die beiden Pumpen der Perfusion Systeme. Stellen Sie die Schlauchpumpe (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA), die für retrograde Perfusion auf 40 mL / min verwendet wird. Legen Sie die anderen Schlauchpumpe (Cole-Parmer Masterflex peristaltische Pumpe L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois), die für Superfusion verwendet wird und das Perfusat wieder zurück in den Betrieb Reservoir bis 80 mL / min.
- Waschen Sie die Perfusion mit 70% Ethanol für 30 min und dann mit 2L VE-Wasser.
- Sobald alle VE-Wasser aus der Kammer evakuiert, zirkulieren die Tyrode-Lösung und führt es durch eine 5-um-Filter (Millipore, Billerica, MA, USA). Warm Perfusat bis +37 ° C mit einem Wassermantel und Thermostat (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) und mit Sauerstoff das Perfusat durch Einblasen von O 2 / CO 2 (95% / 5%) Gas in die Lösung. Überwachen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Meter (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) und passen Sie die Geschwindigkeit von O 2 / CO 2 sprudelnden der pH um 7.35 ± 0,05 zu halten. Weiter Überwachung pH-Wert und Temperatur während des Experiments.
- Die zwei optischen Abbildung Vorrichtung besteht aus zwei Micam Ultima-L CMOS-Kameras (SciMedia, Costa Mesa, CA), die hohe räumliche (100x100 Pixel, 230 ± 20 mu m pro Pixel) und zeitliche (1.000-3.000 Frames / sec) Auflösung haben. Fix ein Bandpass-Filter (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) vor dem bezeichneten Kalzium-Imaging-Kamera, während ein lang-Pass-Filter (> 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) muss in positioniert werden vor dem vorgesehenen Spannung Wärmebildkamera. Die Kameras sind senkrecht zueinander durch eine Halterung, die einen dichroitischen Spiegel (635 nm-Cutoff, Omega Optical, Brattleboro, VT) enthält angeordnet. Unmittelbar unterhalb der Zwei-Kamera-Halterung befindet sich ein Objektiv (Nikon Nikkor 55 mm 1:1,4 235052), die die Emission Licht konzentriert sich von Herzen kommt auf den dichroitischen Spiegel. Der Arbeitsabstand beträgt ca. 3cm.
Das Anregungslicht wird durch eine Halogenlampe (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) erzeugt und durch einen Wärme-Filter, Shutter und Bandpassfilter (520 ± 45 nm) übergeben. Eine flexible Lichtleiter leitet die bandpassgefiltert Licht auf die Vorbereitung, und eine Blende verwendet wird, um sicherzustellen, dass die Vorbereitung ausgesetzt ist, nur das Licht während der Bildaufnahme zu vermeiden Ausbleichen der Farbstoffe. - Bereiten Ag / AgCl 2 Elektroden für Stimulation und Erfassung im Voraus und installieren Sie sie in der Kammer vor der Erteilung des Herzens. Stellen Sie sicher, dass Verstärker und Filter, um eine angemessene eingestellt sind.
3. Ernten Sie die Maus Herz, kanülieren, und richten Sie Langendorff Perfusion
- Anesthetize die Maus mit Ketamin / Xylazin (Ketamin, 80mg/kg Körpergewicht; Xylazin, 10 mg / kg Körpergewicht) und Heparin (100 Einheiten) durch intraperitoneale Injektion. Assure angemessenes Niveau der Anästhesie durch den Mangel an Schmerz-Reflex.
- Nach einer mittleren sternalen Einschnitt, schnell zu entfernen, das Herz und waschen Sie es in Sauerstoff (95% O 2, 5% CO 2), mit konstanter Temperatur (37 ± 1 ° C) Tyrode-Lösung.
- Mit einem Binokular, Schnell zu identifizieren die Aorta und machen einen sauberen Schnitt in der aufsteigenden Aorta unterhalb der rechten A. subclavia. Ein kurzer Abschnitt der Aorta wird dann eine benutzerdefinierte aufgeklebt wird, 21-Gauge-Kanüle mit einem erweiterten Spitze. 4-0 schwarz-geflochtene Seidenfaden (Surgical Specialties Corporation, Reading, PA) wird verwendet, um das Herz auf die Kanüle zu fixieren. Nach Kanülierung, ist das Herz retrograd perfundierten und superfundiert mit Tyrode-Lösung. Brückenverstärker TBM4M, WPI, Sarasota,, Die retrograde Perfusion beträgt im Bereich von 2-5 ml / min auf die Aortendruck zwischen 60 und 80 mmHg (Druckaufnehmer, World Precision Instruments Inc (WPI), Sarasota, USA halten eingestellt USA).
- Nach dem Herz ist durchbohrt, sind Lunge, Thymus und Fettgewebe dann seziert und entfernt werden.
- Das isolierte Herz merken (Fine Science Tools) an der Spitze auf den Boden der Perfusionskammer (Sylgard beschichtet) zu streamen-induzierte Bewegung zu verhindern. Die rechten und linken Vorhof Anhängsel sind auch gespannt und merken (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA), um den Boden der Kammer, die maximale Fläche bietet für optische Messungen der Vorhöfe.
Sehr wichtig! Ein kleiner Silikonschlauch ist in die linke Herzkammer durch die Lungenvenen eingesetzt und durch Seidenfaden zu den nahe gelegenen Bindegewebe. Dies verhindert Lösung Staus und Versauerung der Perfusat in die linke Herzkammer, was besonders wichtig ist nach der Niederschlagung des ventrikulären Kontraktionen mit einer Erregung und Kontraktion Kupplung (siehe Teil 4 Schritt 19) gefangen. - Eine maßgeschneiderte Elektrode wird auf der Oberfläche des Herzens angeordnet, um die Stimulation Reize, die von Meister-8 (AMP Instruments Ltd, Jerusalem, Israel) oder PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australien) erzeugt wird, zu führen.
- Ein kleines Deckglas auf der Oberfläche der Lösung über das Herz, um Bewegungsartefakte aus der schwingenden Lösung reduzieren fixiert.
- Fokus des Anregungslichts auf das Herz. Darüber hinaus stellen Sie den Abstand zwischen den Dual-Kamera Apparat und das Herz, so dass maximale Auflösung erreicht wird.
- Schalten Sie alle Lichter in den Raum und beginnen elektrische Aufnahmen mit PowerLab 26T.
4. Lastspannung und Calcium sensitiven Farbstoffen und Erregung und Kontraktion Entkoppler
- Warm-up 0,6 ml blebbistatin. Mix 0,5 ml des blebbistatin mit dem Perfusat in der Holding-Reservoir. Verdünnen Sie die verbleibenden 0,1 ml blebbistatin in 1 ml Tyrode-Lösung und langsam injizieren (über einen Zeitraum von 20 Minuten) durch ein Medikament Hafen in der Nähe der Kanüle entfernt. Beobachten Sie, wie blebbistatin allmählich reduziert Bewegungsartefakte.
- Verdünnen Sie 30 ul Spannung Farbstoff RH237 Stammlösung in 1 ml Tyrode-Lösung und langsam über 5-7 Minuten injiziert in die gleiche Einspritzöffnung als blebbistatin.
- 30 ul Calcium-Indikator Rhod-2 AM ist 1:1 mit Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% ige Lösung in DMSO) gemischt und dann verdünnt in 1 ml Tyrode-Lösung und langsam über 5-10 min über die gleiche Einspritzöffnung angewendet .
- Warten Sie 5-10 Minuten für blebbistatin und Farbstoffe an die Zellmembran und Zytosol zu erreichen. Fahren Sie mit dem Protokoll, wenn die Bewegung völlig unterdrückt.
- Kontinuierliche Überwachung EKG-Aufzeichnungen über das gesamte Verfahren, um sicherzustellen, normale elektrische Funktion des Herzens.
- Commence Fluoreszenzsignal Aufnahmen über den SciMedia kundenspezifische Software (SciMedia, Costa Mesa, CA).
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Versuchsaufbau zur Perfusion, elektrische und optische Aufnahmen Mapping.
EM = Emission; Lp = Langpass
Abbildung 2. Experimental Vorbereitung und Signal Beispiele während ventrikuläre Stimulation aufgezeichnet. Links: EKG-Signale werden von Ag / AgCl 2 Platten-Elektroden (Top) und ein Beispiel für S1S1 Stimulationsprotokoll angezeigt wird (Bottom) gesammelt. Center: Langendorff Mäuseherzen Vorbereitung. Rechts: Vertreter optische Aktionspotentiale und Kalzium transiente Signale von Atrien (Top) und Ventrikel (unten) dargestellt. Der gelbe Pfeil (oben) zeigt auf das Fluoreszenzsignal Streuung aus den Herzkammern, die im Vorhof-Aufnahmen zu sehen ist.
LV = linker Ventrikel; RV = rechter Ventrikel, LA = linker Vorhof, RA = rechter Vorhof
Abbildung 3. Representative optische Aufnahmen von V m und die Katze von den Herzkammern eines Wildtyp-Maus Herzen. A. Die experimentelle Vorbereitung mit einer Reihe von gleichmäßig verteilten Standorten durch schwarze Punkte, deren optische Aufnahmen können in (C) gesehen werden markiert. B. Beispiel Verfolgung von V m und die Katze von einer zentralen Stelle auf dem Array (siehe Kasten in (C)). C. V m (blau) und Katze (rot) aus dem Array von gleichmäßig verteilten Standorten. Die Signale wurden binned 3x3.
Abbildung 4. Activation Karte und Wärmeleitung. A. Ein Beispiel Aktivierung Karte von einem Wildtyp-Maus Herz mit Quer-(T) und längs (L) Richtungen durch weiße Pfeile gekennzeichnet. B. V m-Signale (Top) und dV / dt (unten) für die drei Punkte zu sehen in A (T1, T2, T3, L1, L2, L3).
Abbildung 5. Aktionspotential und Kalzium transienten Dauer Analyse. A. Aktionspotentialdauer bei 80% Repolarisation (APD80) und Kalzium transienten Dauer bei 80% Entspannung (80 CAD) Karten sind aus einem Herzen unter Kontrollbedingungen (links) und nach 30 nM Isoproterenol Anwendung (rechts) gezeigt. Die gelb / grüne Farbe in die Ventrikel (rechts) zeigt Isoproterenol verkürzt APD80 und 80 CAD. B. Beispiel Kurven von APD80 und 80 CAD aus dem Wildtyp-Maus Ventrikel (Top) und Vorhöfe (Bottom).
Discussion
In diesem Experiment haben wir modifiziert die Langendorff Perfusion Methode durch Zugabe einer kleinen Silikonschlauch, was besonders wichtig ist nach der Niederschlagung des ventrikulären Kontraktionen mit einer Erregung und Kontraktion Entkoppler. Der Silikonschlauch wird verwendet, um Lösung Staus, Versauerung der Perfusionslösung und der Entwicklung von Ischämie im linken Ventrikel zu verhindern. Die Maus Herz ist sehr empfindlich gegen Unterkühlung; somit Temperaturschwankungen über das Herz künstlichen Unterschiede in Aktionspotential Laufzeiten verursachen. Folglich wurde ein Heizsystem in der Perfusionskammer implementiert, um eine konstante Temperatur von 37 ° C während der Gesamtheit der Versuch 8 zu erhalten. Da eine Langendorff-Modell nicht beibehält Innervation des Herzens, muss man überlegen, Neurotransmitter, um das Perfusat, um physiologische Sympathikus und Parasympathikus Ton 9 zu untersuchen. Neben retrograde Perfusion, hilft neben der Superfusion des Herzens, um geeignete ökologische Parameter wie pH-Wert und Temperatur zu halten. In diesem Verfahren war die Langendorff perfundierten Herzen horizontal platziert. Eine vertikale Langendorff Perfusion-Setup kann auch 10 verwendet werden, kann aber in leicht unterschiedlichen Herz-Mechanik 11 Resultat. Neben CMOS-Kameras, sind alternative Detektoren ebenfalls verfügbar und kann auf die Karte V m und CAT gleichzeitig 12 aufgebracht werden.
Anwendung von CMOS-Kameras mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung gewährleistet die Genauigkeit der Aufzeichnungen, jedoch sind optische Zuordnung Signale nicht aus einer einzigen Zelle. Vielmehr kommt jedes Fluoreszenzsignal von Hunderten oder Tausenden von Zellen, je nach optischer Vergrößerung. Die viel größere ventrikuläre Fluoreszenz kann atriale Signale durch optische Streuung verzerren, daher sorgfältige Interpretation der optisch aufgezeichneten Signalen erforderlich ist. Eine weitere Einschränkung der Maus Vorbereitung ist das Signal, Verzerrungen und Rauschen durch die Krümmung der Oberfläche aufgrund der geringen Größe des Herz 13 induziert. Leitgeschwindigkeit Messungen können nicht nur von der Krümmung der Maus Herz, sondern auch von der Elektrode Polarität und virtuelle Elektroden verändert werden. Um Genauigkeit zu erreichen für Leitgeschwindigkeit, Aktivierung Anisotropie und Repolarisation Karten, korrekte Fokussierung der Kamera an der Oberfläche des Herzens ist unerlässlich.
In dieser Methode können Echtzeit-EKG-Aufnahmen ergänzen die optische Untersuchung der kardialen Elektrophysiologie. Voltage-sensitiven Farbstoffs (RH237) und Kalzium-Indikator (Rhod-2AM) sind in das Protokoll wegen ihrer schnellen Reaktion, ähnlich Anregung und verschiedene Emissionsspektren 3,7 verwendet. Es gibt alternative Kombinationen von Farben, die verwendet werden, um V m und CAT außer RH237 und Rhod-2AM 3 messen kann. Eine neuartige Spannung Farbstoff, PGHI, mit einem großen Stokes-Shift (> 200 nm) wurde festgestellt, dass eine bessere V m und CAT-Signale wegen der größeren Trennung der Emissionswellenlänge zwischen PGHI und Rhod-2AM 14 zu ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen können auf die Erforschung neuartiger fluoreszierender Sonden, die Entwicklung der neuen bildgebenden Detektoren und einer verbesserten Bildverarbeitungs-Software konzentrieren. Höhere Auflösung und neuartige optische Bildgebungsverfahren für optische 3D-Mapping sind ebenfalls wichtige zukünftige Ausrichtung der optischen Abbildung 5.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
NIH gewährt R01 HL085369.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| PowerLab 26T |  ADInstruments |
References
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